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1 中国医学前沿杂志 ( 电子版 ) 2015 年第 7 卷第 11 期论著 33 波动血糖对糖尿病大鼠肾脏和肝脏损伤的影响李素娟, 高凯旋, 杨文娟, 钱竹青, 王猛, 吴德平 ( 中国人民解放军第八二医院内分泌科, 江苏淮安 ) 摘要目的探讨波动高血糖引起糖尿病大鼠肾脏和肝脏损伤的机制方法将 SD 大鼠随机分为 N 组 ( 正常对照组 ) D 组 ( 稳定高血糖组 ) F 组 ( 波动血糖组 ),D 组 F 组大鼠均一次性腹腔内注射链脲佐菌素 (STZ)65 mg/kg, 建立糖尿病模型 F 组大鼠每天错时给予胰岛素和葡萄糖造成血糖波动模型 12 周后测定各组大鼠血清谷草转氨酶 (AST) 和谷丙转氨酶 (ALT) 肌酐尿素氮水平, 收集 24 小时尿液测定尿微量蛋白和尿蛋白定量, 观察肾肝脏显微和超微结构变化结果 F 组大鼠 1 天中的血糖浓度出现明显波动,D 组大鼠 1 天中的血糖浓度基本处于高水平状态 N 组大鼠糖化血红蛋白 (HbA1c) 为 (5.10±0.32)%,D 组为 (10.50±0.69)%,F 组为 (10.13±0.96)%,D 组与 F 组比较无明显差异 (P > 0.05) 与 N 组比较,D 组和 F 组大鼠的肝指数均明显升高 ( 分别为 P < 0.05, P < 0.01),D 组和 F 组大鼠的 AST ALT 水平均明显升高 (P < 0.01) 与 D 组比较,F 组大鼠肝指数 AST ALT 水平均明显升高 (P < 0.01) 与 N 组比较,D 组和 F 组大鼠 24 小时尿微量蛋白尿蛋白定量和血清肌酐和尿素氮水平均明显升高 (P < 0.05,P < 0.001) 与 D 组比较,F 组大鼠 24 小时尿微量蛋白尿蛋白定量均明显升高 (P < 0.05,P < 0.001) 三组大鼠肝脏和肾脏显微和超微结构明显改变结论糖尿病大鼠 12 周时肾肝脏出现明显损伤, 且血糖波动能够加重其损伤程度关键词血糖 ; 糖尿病 ; 大鼠 ; 肝脏 ; 肾脏 Effects of fluctuant high blood glucoes on liver and kidney injury in diabetic rats LI Su-juan, GAO Kai-xuan, YANG Wen-juan, QIAN Zhu-qing, WANG Meng, WU De-ping (Department of Endocrinology, the 82nd Hospital of PLA, Jiangsu, Huaian , China) Corresponding author: LI Su-juan, fangli3478@163.com Abstract Objective To explore the mechanisms of fluctuant high blood glucose induced injury on liver and kidney. Method SD rats were randomly divided into normal control group (N), stable high blood glucose group (D), fluctuant high blood glucose group (F). Diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 65 mg/kg), established the diabetes model. Rats in group F were given insulin and glucose to cause blood glucose fluctuation model. After 12 weeks, serum AST and ALT, creatinine, urea nitrogen level of rats were measured, Urine samples were collected for 24 hours to measure urinary micro protein and urinary protein, and to observe the changes of microstructure and ultrastructure of kidney, liver and kidney. Result The blood glucose concentration of group F was obviously fluctuated in the 1 day, and the blood glucose concentration in group D was basically in the high level in 1 days. The HbA1c of group N was (5.10±0.32)%, group D was (10.50±0.69)%, group F was (10.13±0.96)%, there was no significant difference between group D and group F (P > 0.05). Compared with group N, liver index of group F and group D were significantly increased (P < 0.05, P < 0.01), AST and ALT levels of group F and group D were significantly increased (P < 0.01); compared with group D, liver index, AST, ALT levels of group F were significantly increased (P < 0.01). Compared with group N, group D and f rats 24 hours 基金项目 : 浙江省自然科学基金资助项目 (Y207495); 南京军区科技创新课题项目 (12MA026); 淮安市内分泌代谢性疾病重点实验平台持续支持项目 (HAP201273) 通讯作者 : 李素娟 fangli3478@163.com

时给予胰岛素和葡萄糖造成血糖波动模型 12 周后测定各组大鼠血清谷草转氨酶 (AST) 和谷丙转氨酶 (ALT) 肌酐尿素氮水平, 收集 24 小时尿液测定尿微量蛋白和尿蛋白定量, 观察肾肝脏显微和超微结构变化结果 F 组大鼠 1 天中的血

2 34 论著中国医学前沿杂志 ( 电子版 ) 2015 年第 7 卷第 11 期 urinary albumin, urinary protein and serum creatinine and urea nitrogen water average increased significantly (P < 0.05, P < 0.001); compared with group D, 24 hours urine trace protein, urinary protein of group F were significantly increased (P < 0.05, P < 0.001). The microstructure and ultrastructure of the liver and kidney were significantly changed in the three groups. Conclusion The kidney and liver of diabetic rats appeared obviously damage in the 12 week, blood glucose fluctuation can aggravate the injury degree. Key words Blood glucose; Diabetes mellitus; Rats; Liver; Kidney 餐后血糖的升高是糖尿病血糖控制的关键, 高血糖是糖尿病的标志以及导致慢性并发症的主要原因近年研究报道, 糖尿病的预后及慢性并发症的发生和发展不仅与整体血糖水平的升高密切相关, 而且与患者的血糖波动有密切联系 [1] 研究表明, 糖尿病患者糖化血红蛋白 (HbA1c) 水平并不能反映血糖波动情况 [2],HbA1c 相近的患者, 血糖波动较大者发生慢性并发症的风险更大体外细胞培养研究发现, 间歇性葡萄糖浓度波动会导致肾小球系膜细胞血管内皮细胞等出现不同程度的损伤 [3-6] 因此, 目前认为长期的血糖波动较慢性持续高血糖对人体的危害更加严重本研究通过每日 3 次错时给予糖尿病大鼠胰岛素和葡萄糖来实现血糖波动, 观察血糖波动对大鼠肾肝脏形态学的影响 1 资料和方法 1.1 材料 SPF 级雄性 SD 大鼠由本校实验动物中心提供, 体重 180 ~ 220 g ;Streptozotocin(STZ, 美国 ); 枸橼酸钠分析纯 ; 葡萄糖 (20 ml.. 10 g); 普通速效胰岛素 (10 ml U); 强生 (Johnson) 稳步倍加血糖仪 ( 美国 ) 及配套试纸 1.2 方法动物模型制备及分组将雄性 SD 大鼠 24 只随机均分为三组, 每组各 8 只,N 组为正常对照组,D 组为稳定高血糖组,F 组为波动高血糖组,D 组 F 组大鼠均一次性腹腔内注射 STZ 65 mg/kg,a 组大鼠给予同剂量的枸橼酸钠缓冲液 72 小时后于大鼠尾部取血, 检测空腹血糖, 并刺激大鼠膀胱检测尿糖, 如血糖 > 16.7 mmol/l 尿糖 +++, 则造模成功 12 周后腹主动脉取血, 用于生化指标检测 ; 取肾脏和肝脏用于肾肝脏指标测定, 并观察肾肝脏形态学改变血糖和 HbA1c 采用 Johnson 稳步倍加血糖仪测定血糖, 亲和层析 - 高效液相色谱法 (HPLC) 测定 HbA1c 含量谷草转氨酶 (AST) 和谷丙转氨酶 (ALT) 采用雅培 C8000 生化分析仪检测肝指数取出实验大鼠整个肝脏, 滤纸吸干血迹后电子天平秤重得肝湿重, 肝湿重与体重的比值即为肝指数尿蛋白定量和尿微量蛋白的测定 (24 小时 ) 12 周后大鼠禁食 24 小时, 用代谢笼接尿, 采用雅培 C8000 生化分析仪检测尿素氮和血肌酐测定 12 周后以 10% 水合氯醛 (0.35 ml/100 g) 腹腔注射麻醉大鼠, 仰卧固定于手术台上, 腹主动脉取血, 采用雅培 C8000 生化分析仪检测显微结构观察取左肾和肝脏组织,4% 多聚甲醛 -PBS 缓冲液固定, 常规石蜡制片 ( 厚度为 5 μm),he 染色, 显微镜观察并拍照超微结构观察用冷刀片取左肾肝脏 0.5 ~ 1 mm 3 大小的组织块, 以 2.5% 冷戊二醛溶液迅速固定经过 1%OsO 4 后固定梯度丙酮脱水环氧树脂浸透包埋切片醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,H-7500 型透射电镜 ( 日本 HITACH 公司 ) 观察拍照 1.3 统计学处理采用 SPSS 17.0 软件处理实验数据计量资料以 x±s 表示, 组间比较采用单因素方差分析后再采用 LSD-t 检验 2 结果 2.1 三组大鼠血糖浓度及 HbA1c 水平比较 N 组大鼠血糖浓度为 5.40 ~ 6.25 mmol/l,d 组为 ~ mmol/l,f 组为 6.17 ~ mmol/l,f 组大鼠 1 天中的血糖浓度出现明显波动,D 组大鼠 1 天中的血糖浓度基本处于高水平状态 N 组大鼠 HbA1c 为 (5.10±0.32)%,D 组为 (10.50±0.69)%,F 组为 (10.13±0.96)%,D 组与 F 组比较无明显差异 (P > 0.05) 2.2 三组大鼠肝指数及血清转氨酶水平比较与

Conclusion The kidney and liver of diabetic rats appeared obviously damage in the 12 week, blood glucose fluctuation can aggravate the injury degree.

3 中国医学前沿杂志电子版 2015 年第 7 卷第 11 期论著 35 N 组比较 D 组和 F 组大鼠的肝指数均明显升高分别为 P 0.05 P 0.01 D 组和 F 组大鼠的 AST ALT 水平均明显升高 P 0.01 与 D 组比较 F 组大鼠肝指数 AST ALT 水平均明显升高 P 0.01 表 1 表 1 三组大鼠肝指数及血清 AST ALT 比较 x±s 组别肝指数 % AST U/L ALT U/L N 组 3.52± ± ±15.42 D 组 4.22±0.33* ± ±49.54 F 组 5.05± ± ±49.89 F 图 1 三组大鼠肾脏组织的 HE 染色 200 P 0.01 与 D 组比较 P 0.05 注与 N 组比较 *P 0.05 P 0.01 AST 谷草转氨酶 ALT 谷丙转氨酶 2.3 三组大鼠 24 小时尿微量蛋白尿蛋白定量和血清肌酐尿素氮水平比较与 N 组比较 D 组和 F 组大鼠 24 小时尿微量蛋白尿蛋白定量图 2 三组大鼠肝脏组织 HE 染色 40 和血清肌酐和尿素氮水平均明显升高 P 肾脏超微结构观察 N 组大鼠足突细胞结构 P 与 D 组比较 F 组大鼠 24 小时尿完整近曲小管和远曲小管都未见异常 D 组大鼠微量蛋白尿蛋白定量均明显升高 P 0.05 足突细胞核轻度固缩近曲小管有少量蛋白沉积 P 表 2 远曲小管上皮细胞核轻度固缩细胞器较少 F 组表 2 三组大鼠 24 小时尿微量蛋白尿蛋白定量和血清肌大鼠足突细胞核明显固缩球内有明显的充血近酐尿素氮水平比较 x±s 曲小管有明显的蛋白沉积远曲小管上皮细胞固缩组别尿微量蛋白 24 小时尿蛋白 mg/l 定量 mg/l N组 0.11± 0.01 D组 1.04± 0.12* F组 1.56± 0.1* F ±0.03 * 0.36± ±0.82* 血肌酐 μmol/l 尿素氮 mmol/l 46.00± ± ±11.04 不规则电子密度高染色质多有凋亡的倾向图 ± ± ± 注与 N 组比较 *P 0.05 P 与 D 组比较 P 0.05 P 光镜下三组大鼠肾小球和肾小管结构比较光镜下所见 N 组大鼠肾小球和肾小管结构未见病图 3 三组大鼠足突细胞的变化变 D 组大鼠肾小球细胞轻度增多肾小管有空泡 F 组大鼠肾小球毛细血管球萎缩球囊腔变大扩张明显分叶肾小管有空泡透明样变部分坏死脱落结构紊乱图光镜下三组大鼠肝脏组织比较 N 组大鼠肝小叶结构清晰完整肝索排列整齐肝细胞边界清图 4 三组大鼠近曲小管的变化晰肝细胞内无脂肪空泡 F 组大鼠肝脏肝板结构破坏肝细胞排列紊乱肝细胞增大核大小不等肝细胞胞浆内可见大小不等数量不一的脂肪空泡 D 组大鼠虽然也存在空泡和炎性细胞但较 N 组和 F 组明显减少图 2 图 5 三组大鼠远曲小管的变化 10000

44 图 1 三组大鼠肾脏组织的 HE 染色 200 P 0.01 与 D 组比较 P 0.05 注与 N 组比较 *P 0.05 P 0.01 AST 谷草转氨酶 ALT 谷丙转氨酶 2.

4 36 论著中国医学前沿杂志电子版 2015 年第 7 卷第 11 期 2.7 肝脏超微结构观察 N 组大鼠肝细胞核规则组大鼠足突细胞核明显固缩近曲小管出现明显的线粒体有完整的膜和嵴内质网排列整齐无脂质蛋白沉积远曲小管上皮细胞固缩不规则电子变性毛细胆管中央区域无扩张 D 组大鼠肝细胞密度高染色质多而稳定高血糖组大鼠变化不是核不规则线粒体模糊内质网增生破裂毛细很明显通过生化指标和形态学观察发现波动高胆管扩张有淤胆现象 F 组大鼠肝细胞核不规则血糖组大鼠的肾脏可能是通过氧化应激大量的活线粒体肿胀结构不清粗面内质网丰富脱颗粒性氧通过上述途径引起肾脏损害滑面内质网扩张毛细胆管明显扩张管壁增粗腔内可见非定形物质图 6 8 文献报道高血糖可引起肝脏组织学和功能的变化并可导致胆管紊乱 [8] 糖尿病可使肝脏超微制模 12 wk 时结构发生改变 [9,10] 本研究中亦发现稳定高血血糖组和波动高血糖组的糖尿病大鼠均表现为肝脏指数明显升高血清 AST 和 ALT 水平升高形态学表现有一定变化但波动高血糖组大鼠的肝功能损害更明显显微结构为肝板结构破坏图 6 三组大鼠肝细胞核的变化 6000 肝细胞排列紊乱肝细胞增大核大小不等超微结构为肝细胞核不规则线粒体模糊内质网增生破裂毛细胆管扩张有於胆现象等明显改变提示在波动高血糖组大鼠的肝脏损伤程度更明显研究表明糖尿病患者餐后高血糖的危害性极大这对于糖尿病并发症的发生具有重要影响 [1] 图 7 三组大鼠肝脏细胞间隙和内质网的变化在慢性高血糖状态下机体可通过一定程度的适应能力调节代谢使其发生改变部分对抗葡萄糖的毒性效应而波动性高血糖状态下机体的这种适应能力受损引起严重的糖毒性效应从而引发肾脏肝脏功能和形态学的明显变化波动血糖对机体其他器官的损伤情况如何还有待进一步研究图 8 三组大鼠肝脏毛细胆管的变化讨论糖尿病肾病的确切发病机制研究主要是氧化应参考文献 [1] 激方面 Monnier 等 [7] 研究表明餐后急性升高的波动性高血糖较持续性慢性高血糖更能激活糖尿病患 [2] [3] 高 [8] 波动的高血糖使机体的抗氧化防御系统下降 expression in human umbilical enclothelial cells in culture: the role of poly(adp-ribose) polymerase[j]. J Thromb Haemost, 微量蛋白尿蛋白定量和血肌酐尿素氮明显高于明显下降波动高血糖组大鼠肾小球毛细血管球萎缩球囊腔变大扩张明显分叶肾小管有空泡透明样变部分坏死脱落结构紊乱波动高血糖 Piconi L, Quagliaro L, DaRos R, et al. Intermittent high glucose enhances ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and interleukin-6 等本研究发现波动高血糖组大鼠的 24 小时尿稳定高血糖组说明波动高血糖组大鼠肾功能出现 Derr R, Garrett E, Stacy GA, et al. Is HbA(1c) affected by glycemic instability?[j]. Diabetes Care, 2003, 26(10): 者的氧化应激氧化应激对 DNA 的损伤主要表现为尿或肾脏组织中 8- 羟基脱氧鸟嘌呤水平明显升王先令陆菊明血糖波动对糖尿病预后极其慢性并发症发生发展的影响 [J] 国外医学内分泌分册 , 2(8): [4] Quagliaro L, Piconi L, Assaloni R, et al. Intermittent high glucose enhances ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin expression in human umbilical vein endothelial cells in culture: The distinct role of protein kinase C and mitochondrial superoxide production[j]. Atherosclerosis, 2005, 183(2):

组大鼠肝细胞核不规则血糖组大鼠的肾脏可能是通过氧化应激大量的活线粒体肿胀结构不清粗面内质网丰富脱颗粒性氧通过上述途径引起肾脏损害滑面内质网扩张毛细胆管明显扩张管壁增粗腔内可见非定形物质图 6 8 文献报道高血糖可引起肝脏组织学和功能的变化并可导致胆管紊乱 [8] 糖尿病可使肝脏超微制模 12 wk 时结构发生改变 [9,10] 本研究中亦发现

5 中国医学前沿杂志 ( 电子版 ) 2015 年第 7 卷第 11 期论著 37 [5] Quagliaro L, Piconi L, Assaloni R, et al. Intermittent high glucose enhances apoptosis related to oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells: The role of protein kinase C and NAD(P) H-oxidase activation[j]. Diabetes, 2003, 52(11): [6] 吕晔, 叶希韵, 涂皘, 等. 葡萄糖浓度的波动变化对牛血管内皮细胞的影响 [J]. 华东师范大学学报 ( 自然科学版 ), 2007,(2): [7] Monnier L, Mas E, Ginet C, et al. Activation of oxidative stress by acute glucose fluctuations compared with sustained chronic hyperglycemia in patients with type 2 diabetes[j]. JAMA, 2006, 295(14): [8] KakimotoM, Inoguchi T, Sonta T, et al. Accumulation of 8-Hy- Droxy-2-deoxyguanosine and mitochondrial DNA deletion in kidney of diabetic rats[j]. Diabetes, 2002, 51(5): [9] Nepomnyashchikh GI, Pavlenko OA, Aidagulova SV, et al. Ultrastructural analysis of liver biopsy specimens in diabetes mellitus associated with chronic Opisthorchiasis[J]. Bull Exp Biol Med, 2001, 132(6): [10] 金英锦, 金奎龙, 赵正林, 等. 链脲佐菌素糖尿病大鼠肝脏超微结构的变化 [J]. 延边大学医学学报,2000,23(1): 收稿日期 : 中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 征稿启事信息窗中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 为中华医学会主办的感染病学专业学术电子期刊, 是一本在载体形式上与纸媒体相互补的多媒体光盘期刊 (CD-ROM) 本刊以电子期刊特有的表现形式, 运用影视语言和多媒体技术登载有关感染病的专业论著专家讲坛临床病例讨论及学术会议等, 图文声像并茂, 是广大感染病工作者了解当前学科前沿掌握最新技术的有效工具本刊内容主要包括各种感染病的病原学流行病学免疫学临床诊断及预防的实践经验和研究成果, 以及本领域新技术新方法的重要进展本刊常设的主要栏目有述评专家讲座基础研究临床研究继续教育园地经验交流病例报告疑难病例分析综述临床病例荟萃设备技术介绍国内外学术动态等本刊为中国科技论文统计源期刊 ( 中国科技核心期刊 ) 收录, 且拥有中华人民共和国新闻出版总署等多种网上查询路径本刊特色栏目 : (1) 继续教育园地 ( 视频 ) (2) 临床病例荟萃 ( 病例分析典型图像分析专家点评 ) 本刊的办刊宗旨 : 贯彻党和国家的卫生工作方针政策, 贯彻理论与实践普及与提高相结合的办刊方针, 反映我国感染病临床和科研工作的重大进展, 促进国内外感染病学学术交流欢迎登陆本刊采编系统, 网址为 : 欢迎您点击和投稿您只需简单登陆, 即可免费下载期刊的 PDF 版文章本刊为双月刊, 每期定价 28 元, 全年定价 168 元编辑部常年办理邮购, 邮发代号 :80-729, 欢迎订阅通讯地址 : 北京市朝阳区京顺东街 8 号中华实验和临床感染病杂志 ( 电子版 ) 编辑部邮编 : 电话 : 传真 : editordt@163.com 网址 :www. j-ditan.com

Diabetes, 2003, 52(11): 2795-2804. [6] 吕晔, 叶希韵, 涂皘, 等. 葡萄糖浓度的波动变化对牛血管内皮细胞的影响 [J]. 华东师范大学学报 ( 自然科学版 ), 2007,(2):188-190. [7] Monnier L, Mas E, Ginet C, et al.

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34 论 著 中 国 医 学 前 沿 杂 志 ( 电 子 版 ) 2015 年 第 7 卷 第 11 期 urinary albumin, urinary protein and serum creatinine and urea nitrogen water average increased s

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