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1 实 验 一 显 微 镜 的 使 用 油 浸 系 物 镜 的 使 用 一 实 验 原 理 微 生 物 学 研 究 用 的 显 微 镜 通 常 有 低 倍 物 镜 (16mm,10 ) 高 倍 物 镜 (4mm,40-45 ) 和 油 镜 (1.8mm, ) 三 种 油 镜 常 标 有 黑 圈 或 红 圈, 它 是 三 者 中 放 大 倍 数 最 大 的 使 用 油 镜 时, 油 镜 与 其 他 物 镜 的 不 同 是 载 玻 片 与 接 物 镜 之 间, 不 是 隔 一 层 空 气, 而 是 隔 一 层 油 质, 称 为 油 浸 系 这 种 油 常 选 用 香 柏 油, 因 香 柏 油 的 折 射 率 n=1.52, 与 玻 璃 基 本 相 同 当 光 线 通 过 载 玻 片 后, 可 直 接 通 过 香 柏 油 进 入 物 镜 而 不 发 生 折 射 如 果 玻 片 与 物 镜 之 间 的 介 质 为 空 气, 则 称 为 干 燥 系 ; 当 光 线 通 过 玻 片 后, 受 到 折 射 发 生 散 射 现 象, 进 入 物 镜 的 光 线 显 然 减 少, 这 样 视 野 的 照 明 度 就 减 低 了 ( 图 Ⅰ-1) 利 用 油 镜 不 但 能 增 加 照 明 度 ; 更 主 要 的 是 能 增 加 数 值 口 径 因 为 显 微 镜 的 放 大 效 能 由 其 数 值 孔 径 决 定 的 所 谓 数 值 孔 径, 即 光 线 投 射 到 物 镜 上 的 最 大 角 度 ( 称 镜 口 角 ) 的 一 半 正 弦, 乘 上 玻 片 与 物 镜 间 介 质 折 射 率 所 得 的 乘 积, 可 用 下 列 公 式 表 示 : N A= n sin α 2 式 中 N A = 数 值 孔 径 n = 介 质 折 射 率 α = 最 大 入 射 角, 即 镜 口 角 数 值 孔 径 的 大 小 又 是 衡 量 一 台 显 微 镜 分 辨 力 强 弱 的 依 据 ; 分 辨 力 是 指 显 微 镜 能 辨 别 物 体 两 点 间 最 小 距 离 的 能 力 λ 能 辨 别 两 点 间 最 小 距 离 = 2 N A 式 中 λ= 光 波 波 长 由 上 述 可 知 若 n 值 和 α 角 越 大 则 N A 越 大 或 光 波 波 长 越 短, 则 显 微 镜 的 分 辨 力 越 大 ( 图 Ⅰ-2) 一 些 物 质 的 折 射 率 : 水 1.33 玻 璃 1.52 空 气 1.0 香 柏 油 1.515

2 二 实 验 器 材 1 仪 器 显 微 镜 ; 2 材 料 巨 大 芽 孢 杆 菌 (Bacillus megaterium) 等 标 本 片, 香 柏 油, 二 甲 苯, 擦 镜 纸 三 操 作 步 骤 1 取 镜 显 微 镜 是 光 学 精 密 仪 器, 使 用 时 应 特 别 小 心 从 镜 箱 中 取 出 时, 一 手 握 镜 臂, 一 手 托 镜 座, 放 在 实 验 台 上 在 使 用 时 要 特 别 小 心 使 用 前 首 先 要 熟 悉 显 微 镜 的 结 构 和 性 能, 检 查 各 部 零 件 是 否 完 全 合 用, 镜 身 有 无 尘 土, 镜 头 是 否 清 洁 做 好 必 要 的 清 洁 和 调 整 工 作 显 微 镜 构 造 见 图 Ⅰ-3 图 Ⅰ-3 光 学 显 微 镜 的 构 造 1. 物 镜 转 换 器 2. 接 物 镜 3. 游 标 卡 尺 4. 载 物 台 5. 聚 光 器 6. 彩 虹 光 阑 7. 光 源 8. 镜 座 9. 电 源 开 关 10. 光 源 滑 动 变 阻 器 11. 粗 调 螺 旋 12. 微 调 螺 旋 13. 镜 臂 14. 镜 筒 15. 目 镜 16. 标 本 移 动 螺 旋 2 调 节 光 源 1) 将 低 倍 物 镜 旋 到 镜 筒 下 方, 旋 转 粗 调 螺 旋, 使 镜 头 和 载 物 台 距 离 约 为 0.5 厘 米 左 右 2) 上 升 聚 光 器, 使 之 与 载 物 台 表 面 相 距 1 毫 米 左 右 3) 左 眼 看 目 镜 调 节 反 光 镜 镜 面 角 度 ( 在 天 然 的 光 线 下 观 察, 一 般 用 平 面 反 光 镜 ; 若 以 灯 光 为 光 源, 则 一 般 多 用 凹 面 反 光 镜 ) 开 闭 光 圈, 调 节 光 线 强 弱, 直 至 视 野 内 得 到 最 均 匀 最 适 宜 的 照 明 为 止 一 般 染 色 标 本 油 镜 检 查 对, 光 度 宜 强, 可 将 光 圈 开 大, 聚 光 器 上 升 到 最 高, 反 光 镜 调 至 最 强 ; 未 染 色 标 本, 在 低 倍 镜 或 高 倍 镜 观 察 时, 应 适 当 地 缩 小 光 圈, 下 降 聚 光 器, 调 节 反 光 镜, 使 光 度 减 弱, 否 则 光 线 过 强 不 易 观 察 3 低 倍 镜 观 察 低 倍 物 镜 (8 或 10 ) 视 野 面 广, 焦 点 深 度 较 深, 为 易 于 发 现 目 标 确 定 检 查 位 置, 故 应 先 用 低 倍 镜 观 察 为 宜 操 作 步 骤 : 1) 先 将 标 本 玻 片 置 于 载 物 台 上 ( 注 意 标 本 朝 上 ), 并 将 标 本 部 位 处 于 物 镜 的 正 下 方 转 动 粗 调 螺 旋, 上 升 载 物 台 使 物 镜 至 距 标 本 约 0.5 厘 米 处 2) 左 眼 看 目 镜, 同 时 反 时 针 方 向 慢 慢 旋 转 粗 调 节 螺 旋 使 载 物 台 缓 慢 上 升, 至 视 野 内 出 现 物 象 后, 改 用 细 调 节 螺 旋, 上 下 微 微 转 动, 仔 细 调 节 焦 距 和 照 明, 直 至 视 野 内 获 得 清 晰 的 物 象, 及 时 确 定 需 进 一 步 观 察 的 部 位 3) 移 动 推 动 器 将 所 要 观 察 的 部 位 置 于 视 野 中 心, 准 备 换 高 倍 镜 观 察

3 4 高 倍 镜 观 察 将 高 倍 物 镜 (40 ) 转 至 镜 筒 下 方 ( 在 转 换 物 镜 时, 要 从 侧 面 注 视 以 防 低 倍 镜 未 对 好 焦 距 而 造 成 镜 头 与 玻 片 相 撞 ), 调 节 光 圈 和 聚 光 镜, 使 光 线 亮 度 适 中, 再 仔 细 反 复 转 动 微 调 螺 旋, 调 节 焦 距, 获 得 清 晰 物 象, 再 移 动 推 动 器 选 择 最 满 意 的 镜 检 部 位 将 染 色 标 本 移 至 视 野 中 央, 待 油 镜 观 察 5 油 镜 观 察 1) 用 粗 调 螺 旋 提 起 镜 筒, 转 动 转 换 器 将 油 镜 转 至 镜 筒 正 下 方 在 标 本 镜 检 部 位 滴 上 一 滴 香 柏 油 右 手 顺 时 针 方 向 慢 慢 转 动 粗 调 螺 旋, 上 升 载 物 台, 并 及 时 从 侧 面 注 视 使 油 浸 物 镜 浸 入 油 中, 直 到 几 乎 与 标 本 接 触 时 为 止 ( 注 意 切 勿 压 到 标 本, 以 免 压 碎 玻 片, 甚 至 损 坏 油 镜 头 ) 2) 左 眼 看 目 镜, 右 手 反 时 针 方 向 微 微 转 动 粗 调 螺 旋, 下 降 载 物 台 ( 注 意 : 此 时 只 准 下 降 载 物 台, 不 能 向 上 调 动 ), 当 视 野 中 有 模 糊 的 标 本 物 象 时, 改 用 细 调 螺 旋, 并 移 动 标 本 直 至 标 本 物 象 清 晰 为 止 3) 如 果 向 上 转 动 粗 调 螺 旋 已 使 镜 头 离 开 油 滴 又 尚 未 发 现 标 本 时, 可 重 新 按 上 述 步 骤 操 作 直 到 看 清 物 象 为 止 4) 观 察 完 毕, 下 降 载 物 台, 取 下 标 本 片 先 用 擦 镜 纸 擦 去 镜 头 上 的 油, 然 后 再 用 擦 镜 纸 沾 少 量 二 甲 苯 擦 去 镜 头 上 残 留 油 迹, 最 后 再 用 擦 镜 纸 擦 去 残 留 的 二 甲 苯 切 忌 用 手 或 其 他 纸 擦 镜 头, 以 免 损 坏 镜 头, 可 用 绸 布 擦 净 显 微 镜 的 金 属 部 件 5) 将 各 部 分 还 原, 反 光 镜 垂 直 于 镜 座, 将 接 物 镜 转 成 八 字 形, 再 向 下 旋 罩 上 镜 套, 然 后 放 回 镜 箱 中 四 注 意 事 项 1 不 准 擅 自 拆 卸 显 微 镜 的 任 何 部 件, 以 免 损 坏 2 镜 面 只 能 用 擦 镜 纸 擦, 不 能 用 手 指 或 粗 布, 以 保 证 光 洁 度 3 观 察 标 本 时, 必 须 依 次 用 低 中 高 倍 镜, 最 后 用 油 镜 当 目 视 接 目 镜 时, 特 别 在 使 用 油 镜 时, 切 不 可 使 用 粗 调 节 器, 以 免 压 碎 玻 片 或 损 伤 镜 面 4 观 察 时, 两 眼 睁 开, 养 成 两 眼 能 够 轮 换 观 察 的 习 惯, 以 免 眼 睛 疲 劳, 并 且 能 够 在 左 眼 观 察 时, 右 眼 注 视 绘 图 5 拿 显 微 镜 时, 一 定 要 右 手 拿 镜 臂, 左 手 托 镜 座, 不 可 单 手 拿, 更 不 可 倾 斜 拿 6 显 微 镜 应 存 放 在 阴 凉 干 燥 处, 以 免 镜 片 滋 生 霉 菌 而 腐 蚀 镜 片 7 显 微 镜 镜 头 的 保 护 和 保 养 8 使 用 显 微 镜 时 应 据 不 同 的 物 镜 而 调 节 光 线 五 思 考 题 1 油 镜 与 普 通 物 镜 在 使 用 方 法 上 有 何 不 同? 应 特 别 注 意 些 什 么? 2 使 用 油 镜 时, 为 什 么 必 须 用 镜 头 油? 3 镜 检 标 本 时, 为 什 么 先 用 低 倍 镜 观 察, 而 不 是 直 接 用 高 倍 镜 或 油 镜 观 察?

4 实 验 二 细 菌 形 态 的 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 巩 固 油 镜 的 使 用 ; 掌 握 细 菌 形 态 观 察 的 基 本 方 法, 了 解 细 菌 的 基 本 形 态 内 容 :1. 观 察 细 菌 的 基 本 形 态 染 色 装 片 2. 观 察 枯 草 芽 孢 杆 菌 活 菌 3. 观 察 细 菌 细 胞 结 构 的 染 色 装 片 二 实 验 材 料 和 用 具 棒 杆 菌 (Corymebacterium) 螺 菌 (Spirillum) 浮 游 球 衣 菌 (Sphaerotilus natans) 巨 大 芽 孢 杆 菌 (Bacillus megaterium ) 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thuringiensis ) 普 通 变 形 菌 (Proteus vulgaris) 等 细 菌 的 染 色 装 片, 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subis) 的 斜 面 菌 种 香 柏 油 二 甲 苯 无 菌 水 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 酒 精 灯 载 玻 片 盖 玻 片 吸 水 纸 小 滴 管 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 观 察 细 菌 的 基 本 形 态 用 低 倍 镜 高 倍 镜 和 油 镜 观 察 溶 血 链 球 菌 棒 杆 菌 螺 菌 浮 游 球 衣 菌 的 染 色 装 片, 并 分 别 在 油 镜 下 绘 图 ( 二 ) 观 察 细 菌 的 细 胞 结 构 用 低 倍 镜 高 倍 镜 和 油 镜 观 察 巨 大 芽 孢 杆 菌 ( 示 细 胞 壁 ) 巨 大 芽 孢 杆 菌 ( 示 异 染 粒 ) 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 ( 示 伴 胞 晶 体 ) 普 通 变 形 菌 ( 示 鞭 毛 ) 丙 酮 丁 醇 梭 菌 ( 示 芽 孢 ) 褐 球 固 氮 菌 ( 示 荚 膜 ) 等 细 菌 的 染 色 装 片, 并 分 别 在 油 镜 下 绘 图 ( 三 ) 观 察 枯 草 杆 菌 活 菌, 常 用 压 滴 法 观 察 1. 将 洁 净 无 油 腻 的 载 片 放 于 自 己 右 边 前 方, 在 中 央 放 一 小 滴 无 菌 水 2. 将 酒 精 灯 放 于 自 己 正 前 方, 点 燃 3. 用 无 菌 操 作 方 法 从 枯 草 芽 孢 杆 菌 斜 面 中 沾 取 少 量 菌 体, 与 载 片 上 的 水 滴 充 分 混 匀, 把 接 种 环 上 残 留 的 菌 体 杀 灭 后, 放 回 试 管 架 4. 用 镊 子 夹 一 洁 净 的 盖 玻 片, 使 其 一 边 先 接 触 菌 液, 然 后 将 整 个 盖 玻 片 慢 慢 放 下, 注 意 不 要 产 生 气 泡 如 菌 液 过 多, 可 用 吸 水 纸 适 当 吸 去 一 部 分 5. 先 用 低 倍 镜 然 后 转 用 高 倍 镜 观 察, 观 察 时 光 线 要 适 当 调 暗 些 四 注 意 事 项 1. 注 意 擦 镜 头 时, 只 能 用 擦 镜 纸 2, 观 察 完 毕, 必 须 将 镜 筒 上 升, 才 能 取 下 装 片, 放 入 另 一 装 片 后, 要 按 使 用 油 镜 要 求, 重 新 操 作, 不 能 在 油 镜 下 直 接 取 下 和 替 换 装 片, 切 记! 3. 无 菌 操 作 过 程 中, 接 种 环 灭 菌 后 不 能 触 及 其 他 物 品, 挑 菌 不 能 过 多 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 l. 给 出 你 所 观 察 到 的 几 种 细 菌 的 个 体 形 态 视 野 图 2. 给 出 你 所 观 察 到 的 细 菌 细 胞 结 构 视 野 图, 并 注 明 各 部 分 ( 二 ) 试 指 出 在 制 备 活 菌 装 片 时, 应 注 意 什 么 问 题? 六 问 题 和 思 考 1. 用 明 视 野 显 微 镜 观 察 细 菌 的 形 态 时, 你 认 为 用 染 色 装 片 好, 还 是 用 非 染 色 的 活 体 装 片 好, 为 什 么? 观 察 活 体 装 片 与 染 色 装 片, 光 线 调 节 各 有 什 么 不 同? 2. 无 菌 操 作 过 程 中, 可 否 将 棉 塞 放 在 桌 面 上? 为 什 么? 3 试 设 计 一 个 准 备 本 实 验 的 工 作 方 案

5 实 验 三 培 养 基 的 配 制 与 消 毒 灭 菌 I 培 养 基 的 配 制 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 和 掌 握 配 制 培 养 基 的 一 般 方 法 和 步 骤 内 容 :1. 牛 肉 膏 蛋 白 陈 培 养 基 的 配 制 2. 高 氏 1 号 培 养 基 的 配 制 3. 马 丁 氏 培 养 基 的 配 制 二 实 验 材 料 和 用 具 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 可 溶 性 淀 粉 葡 萄 糖 孟 加 拉 红 链 霉 素 1mol/L NaOH lmol/l HCl KNO 3 NaCl K 2 HPO 4 3H 2 O MgSO 4 7H 2 O FeSO 4 7H 2 O 试 管 三 角 瓶 烧 杯 量 筒 玻 璃 棒 天 平 牛 角 匙 ph 试 纸 棉 花 牛 皮 纸 记 号 笔 线 绳 纱 布 漏 斗 漏 斗 架 胶 管 止 水 夹 等 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 的 配 制 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 是 一 种 应 用 最 广 泛 和 最 普 通 的 细 菌 基 础 培 养 基 其 配 方 如 下 : 牛 肉 膏 3g, 蛋 白 胨 10g,Nacl5g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL,PH7.4~ 称 药 品 按 实 际 用 量 计 算 后, 按 配 方 称 取 各 种 药 品 放 入 大 烧 杯 中 牛 肉 膏 可 放 在 小 烧 杯 或 表 面 皿 中 称 量, 用 热 水 溶 解 后 倒 入 大 烧 杯 ; 也 可 放 在 称 量 纸 上 称 量, 随 后 放 入 热 水 中, 牛 肉 膏 使 与 称 量 纸 分 离, 立 即 取 出 纸 片 蛋 白 胨 极 易 吸 潮, 故 称 量 时 要 迅 速 2. 加 热 溶 解 在 烧 杯 中 加 入 少 于 所 需 要 的 水 量, 然 后 放 在 石 棉 网 上, 小 火 加 热, 并 用 玻 棒 搅 拌, 待 药 品 完 全 溶 解 后 再 补 充 水 分 至 所 需 量 若 配 制 固 体 培 养 基, 则 将 称 好 的 琼 脂 放 入 己 溶 解 的 药 品 中, 再 加 热 融 化, 此 过 程 中, 需 不 断 搅 拌, 以 防 琼 脂 糊 底 或 溢 出, 最 后 补 足 所 失 的 水 分 3. 调 ph 检 测 培 养 基 的 ph, 若 ph 偏 酸, 可 滴 加 lmol/l NaOH, 边 加 边 搅 拌, 并 随 时 用 ph 试 纸 检 测, 直 至 达 到 所 需 ph 范 围 若 偏 碱, 则 用 lmol/l HCl 进 行 调 节 ph 的 调 节 通 常 放 在 加 琼 脂 之 前 应 注 意 ph 值 不 要 调 过 头, 以 免 回 调 而 影 响 培 养 基 内 各 离 子 的 浓 度 4. 过 滤 液 体 培 养 基 可 用 滤 纸 过 滤, 固 体 培 养 基 可 用 4 层 纱 布 趁 热 过 滤, 以 利 培 养 的 观 察 但 是 供 一 般 使 用 的 培 养 基, 这 步 可 省 略 5. 分 装 按 实 验 要 求, 可 将 配 制 的 培 养 基 分 装 入 试 管 或 三 角 瓶 内 分 装 时 可 用 漏 斗 以 免 使 培 养 基 沾 在 管 口 或 瓶 口 上 而 造 成 污 染 分 装 量 : 固 体 培 养 基 约 为 试 管 高 度 的 l/5, 灭 菌 后 制 成 斜 面 分 装 入 三 角 瓶 内 以 不 超 过 其 容 积 的 一 半 为 宜 半 固 体 培 养 基 以 试 管 高 度 的 1/3 为 宜, 灭 菌 后 垂 直 待 凝 6. 加 棉 塞 试 管 口 和 三 角 瓶 口 塞 上 用 普 通 棉 花 ( 非 脱 脂 棉 ) 制 作 的 棉 塞 棉 塞 的 形 状 大 小 和 松 紧 度 要 合 适, 四 周 紧 贴 管 壁, 不 留 缝 隙, 才 能 起 到 防 止 杂 菌 侵 入 和 有 利 通 气 的 作 用 要 使 棉 塞 总 长 约 3/5 塞 入 试 管 口 或 瓶 口 内, 以 防 棉 塞 脱 落 有 些 微 生 物 需 要 更 好 的 通 气, 则 可 用 8 层 纱 布 制 成 通 气 塞 有 时 也 可 用 试 管 帽 或 塑 料 塞 代 替 棉 塞 7. 包 扎 加 塞 后, 将 三 角 瓶 的 棉 塞 外 包 一 层 牛 皮 纸 或 双 层 报 纸, 以 防 灭 菌 时 冷 凝 水 沾 湿 棉 塞 若 培 养 基 分 装 于 试 管 中, 则 应 以 5 支 或 7 支 在 一 起, 再 于 棉 塞 外 包 一 层 牛 皮 纸, 用 绳 扎 好 然 后 用 记 号 笔 注 明 培 养 基 名 称 组 别 日 期 8. 灭 菌 将 上 述 培 养 基 于 湿 热 灭 菌 20min 如 因 特 殊 情 况 不 能 及 时 灭 菌, 则 应 故 人 冰 箱 内 暂 存 9. 摆 斜 面 灭 菌 后, 如 制 斜 面, 则 需 趁 热 将 试 管 口 端 搁 在 一 根 长 木 条 上, 并 调 整 斜 度, 便 斜 面 的 长 度 不 超 过 试 管 总 长 的 1/2

6 10. 无 菌 检 查 将 灭 菌 的 培 养 基 放 入 37 温 箱 中 培 养 24~48h, 无 菌 生 长 即 可 使 用, 或 贮 存 于 冰 箱 或 清 洁 的 橱 内, 备 用 ( 二 ) 高 氏 l 号 培 养 基 的 配 制 高 氏 1 号 培 养 基 是 用 于 分 离 和 培 养 放 线 菌 的 合 成 培 养 基 其 配 方 如 下 : 可 溶 性 淀 粉 20g,KNO 3 1g,NaCl 0.5g,K 2 HPO 4 3H 2 O 0.5g,MgSO 4 7H 2 O 0.5g, FeSO 4 7H 2 O 0.01g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL,pH7.4~7.6 l. 称 量 和 溶 解 先 计 算 后 称 量, 按 用 量 先 称 取 可 溶 性 淀 粉, 放 入 小 烧 杯 中, 并 用 少 量 冷 水 将 其 调 成 糊 状, 再 加 至 少 于 所 需 水 量 的 水, 继 续 加 热, 边 加 热 边 搅 拌, 至 其 完 全 溶 解 再 加 入 其 他 成 分 依 次 溶 解 对 微 量 成 分 FeSO 4 7H 2 O 可 先 配 成 高 浓 度 的 贮 备 液 后 再 加 入, 方 法 是 先 在 1000mL 中 加 入 1g 的 FeSO4 7H 2 O, 配 成 浓 度 为 0.01g/mL 的 贮 备 液, 再 在 1000mL 培 养 基 中 加 入 以 上 贮 备 液 1mL 即 可 待 所 有 药 品 完 全 溶 解 后, 补 充 水 分 到 所 需 的 总 体 积 如 要 配 制 固 体 培 养 基, 其 琼 脂 溶 解 过 程 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 2.pH 调 节 分 装 包 扎 及 无 菌 检 查 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 ( 三 ) 马 丁 氏 培 养 基 的 配 制 马 丁 氏 培 养 基 是 用 于 分 离 真 菌 的 选 择 培 养 基 其 配 方 如 下 : K 2 HPO 4 1g,MgSO 4 7H 2 O 0.5g, 蛋 白 胨 5g, 葡 萄 糖 l0g, 琼 脂 15~20g, 水 1000mL, 自 然 ph 1. 称 量 和 溶 解 先 计 算 后 称 量, 按 用 量 称 取 各 成 分, 并 将 其 溶 解 在 少 于 所 需 的 水 中 待 各 成 分 完 全 溶 解 后, 补 充 水 分 到 所 需 体 积 再 将 孟 加 拉 红 配 成 1% 的 水 溶 液, 在 1000mL 培 养 液 中 加 入 以 上 孟 加 拉 红 溶 液 3.3mL, 混 匀 后, 加 入 琼 脂 加 热 融 化, 方 法 同 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 配 制 2. 分 装 包 扎 灭 菌 及 无 菌 检 查 同 牛 肉 膏 蛋 白 膝 培 养 基 配 制 3. 链 霉 素 的 加 入 链 霉 素 受 热 容 易 分 解, 所 以 临 用 时, 将 培 养 基 融 化 后 待 温 度 降 至 45 左 右 时 才 能 加 入 可 先 将 链 霉 素 配 成 1% 的 溶 液 ( 配 好 的 链 霉 素 溶 液 保 存 于 -20 ), 在 100mL 培 养 基 中 加 1% 链 霉 素 0.3mL, 使 每 毫 升 培 养 基 中 合 链 霉 素 30μg 图 3-1 斜 面 的 摆 法 和 冷 藏 图 3-2 棉 塞 的 要 求 条 件 1. 正 确 的 式 样 2. 管 内 部 分 太 短, 管 外 太 松 3. 外 部 太 小 4. 整 个 棉 塞 太 松 5. 管 内 部 分 太 紧, 外 部 太 松

7 图 3-3 吸 管 灭 菌 前 的 包 装 ( 用 纸 包 装 的 情 况 ) 图 3-4 用 于 除 菌 的 过 滤 器 a 蔡 氏 过 滤 器 b 注 射 器 装 置 过 滤 器 四 注 意 事 项 称 药 品 用 的 牛 角 匙 不 要 混 用, 称 完 药 品 应 及 时 盖 紧 瓶 盖 调 ph 时 要 小 心 操 作, 避 免 回 调 不 同 培 养 基 各 有 配 制 特 点, 要 注 意 具 体 操 作 五 实 验 报 告 记 录 本 实 验 配 制 培 养 基 的 名 称 数 量, 并 图 解 说 明 其 配 制 过 程, 指 明 要 点 六 问 题 和 思 考 l. 配 制 培 养 基 有 哪 几 个 步 骤? 在 操 作 过 程 中 应 注 意 些 什 么 问 题? 为 什 么? 2. 培 养 基 配 制 完 成 后, 为 什 么 必 须 立 即 灭 菌? 若 不 能 及 时 灭 菌 应 如 何 处 理? 已 灭 菌 的 培 养 基 如 何 进 行 无 菌 检 查? 3. 试 设 计 实 验 对 饮 料 进 行 无 菌 检 查 II 消 毒 灭 菌 一 干 热 灭 菌

8 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 干 热 灭 菌 的 原 理 和 应 用 范 围 2. 学 习 干 热 灭 菌 的 操 作 技 术 ( 二 ) 基 本 原 理 干 热 灭 菌 是 利 用 高 温 使 微 生 物 细 胞 内 的 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 达 到 灭 菌 的 目 的 细 胞 内 的 蛋 白 质 凝 固 性 与 其 本 身 的 含 水 量 有 关, 在 菌 体 受 热 时, 当 环 境 和 细 胞 内 含 水 量 越 大, 则 蛋 白 蛋 凝 固 就 越 快, 反 之 含 水 量 越 少, 凝 固 缓 慢 因 此, 与 湿 热 灭 菌 相 比, 干 热 灭 菌 所 需 温 度 要 高 (160~170 ), 时 间 要 长 (1~2h), 但 干 热 灭 菌 温 度 不 能 超 过 180, 否 则, 包 器 皿 的 纸 或 棉 塞 就 会 烧 焦, 甚 至 引 起 燃 烧 ( 三 ) 器 材 培 养 皿 试 管 吸 管 电 烘 箱 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 装 入 待 灭 菌 物 品 将 包 好 的 待 灭 菌 物 品 ( 培 养 皿 试 管, 吸 管 等 ) 放 入 电 烘 箱 内, 关 好 箱 门 物 品 不 要 摆 得 太 挤, 以 免 妨 碍 空 气 流 通, 灭 菌 物 品 不 要 接 触 电 烘 箱 内 壁 的 铁 板, 以 防 包 装 纸 烤 焦 起 火 2. 升 温 接 通 电 源, 拨 动 开 关, 打 开 电 烘 箱 排 气 孔, 旋 动 恒 温 调 节 器 至 绿 灯 亮, 让 温 度 逐 渐 上 升 当 温 度 升 至 100 时, 关 闭 排 气 孔 在 升 温 过 程 中, 如 果 红 灯 熄 灭, 绿 灯 亮, 表 示 箱 内 停 止 加 温, 此 时 如 果 还 未 达 到 所 需 的 温 度, 则 需 转 动 调 节 器 使 红 灯 再 亮, 如 此 反 复 调 节, 直 至 达 到 所 需 温 度 3. 恒 温 当 温 度 升 达 到 160~170 时, 恒 温 调 节 器 会 自 动 控 制 调 节 温 度, 保 持 此 温 度 2h 干 热 火 菌 过 程 严 防 恒 温 调 节 的 自 动 控 制 失 灵 而 造 成 安 全 事 故 4. 降 温 切 断 电 源 自 然 降 温 5. 开 箱 取 物 待 电 烘 箱 内 温 度 降 到 70 以 下 后, 打 开 箱 门, 取 出 灭 菌 物 品 电 烘 箱 内 温 度 未 降 到 70, 切 勿 自 行 打 开 箱 门 以 免 骤 然 降 温 导 致 玻 璃 器 皿 炸 裂 ( 五 ) 思 考 题 l. 在 干 热 灭 菌 操 作 过 程 中 应 注 意 哪 些 问 题, 为 什 么? 2. 为 什 么 干 热 火 菌 比 湿 热 灭 菌 所 需 要 的 温 度 要 高, 时 间 要 长? 请 设 计 干 热 灭 菌 和 湿 热 灭 菌 效 果 比 较 实 验 方 案 二 高 压 蒸 气 灭 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 高 压 蒸 气 灭 菌 的 基 本 原 理 及 应 用 范 围 2. 学 习 高 压 蒸 气 灭 菌 的 操 作 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 高 压 蒸 气 灭 菌 是 将 待 灭 菌 的 物 品 放 在 一 个 密 闭 的 加 压 灭 菌 锅 内, 通 过 加 热, 使 灭 菌 锅 隔 套 间 的 水 沸 腾 而 产 生 蒸 气 待 水 蒸 气 急 剧 地 将 锅 内 的 冷 空 气 从 排 气 阀 中 驱 尽, 然 后 关 闭 排 气 阀, 继 续 加 热, 此 时 由 于 蒸 气 不 能 溢 出, 而 增 加 了 灭 菌 锅 内 的 压 力, 从 而 使 沸 点 增 高, 得 到 高 于 100 的 温 度 导 致 菌 体 蛋 白 质 凝 固 变 性 而 达 到 灭 菌 的 目 的 在 同 一 温 度 下, 湿 热 的 杀 菌 效 力 比 干 热 大 其 原 因 有 三 : 一 是 湿 热 中 细 菌 菌 体 吸 收 水 分,

9 蛋 白 质 较 易 凝 固, 因 蛋 白 质 含 水 量 增 加, 所 需 凝 固 温 度 降 低 ( 表 3 1), 二 是 湿 热 的 穿 透 力 比 干 热 大 ( 表 3 2), 三 是 湿 热 的 蒸 气 有 潜 热 存 在 1g 水 在 100 时, 由 气 态 变 为 液 态 时 可 放 出 2.26kJ( 千 焦 ) 的 热 量 这 种 潜 热, 能 迅 速 提 高 被 灭 菌 物 体 的 温 度, 从 而 增 加 灭 菌 效 力 表 3 1 蛋 白 质 含 水 量 与 凝 固 所 需 温 度 的 关 系 卵 白 蛋 白 含 水 量 /% 30 分 钟 内 凝 固 所 需 温 度 / ~ ~ ~170 在 使 用 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 灭 菌 时, 灭 菌 锅 内 冷 空 气 的 排 除 是 否 完 全 极 为 重 要, 因 为 空 气 的 膨 胀 压 大 于 水 蒸 气 的 膨 胀 压, 所 以, 当 水 蒸 气 中 含 有 空 气 时, 在 同 一 压 力 下, 含 空 气 蒸 气 的 温 度 低 于 饱 和 蒸 气 的 温 度 灭 菌 锅 内 留 有 不 同 分 量 空 气 时, 压 力 与 温 度 的 关 系 见 ( 表 3 3) 表 3-2 干 热 温 热 穿 透 力 及 灭 菌 效 果 比 较 温 度 / 时 间 /h 透 过 布 层 的 温 度 / 灭 菌 20 层 10 层 100 层 干 热 不 完 全 湿 热 完 全 表 3 3 灭 菌 锅 留 有 不 同 分 量 空 气 时, 压 力 与 温 度 的 关 系 压 力 数 全 部 空 气 2/3 空 气 1/2 空 气 1/3 空 气 空 气 全 不 Mpa Kg/cm 2 Ib/in 2 排 出 时 的 排 出 时 的 排 出 时 的 排 出 时 的 排 出 时 的 温 度 / 温 度 / 温 度 / 温 度 / 温 度 / 现 在 法 定 压 力 单 位 己 不 用 磅 和 kg/cm 2 表 示, 而 是 用 Pa 或 bar 表 示, 其 换 算 关 系 为 : 1kg/cm 2 = Pa;1Ib/in 2 = Pa. 一 般 培 养 基 用 0.1Mpa( 相 当 于 15 Ib/in 2 或 1.05kg/cm 2 ),121.5,15~30min 可 达 到 彻 底 灭 菌 的 目 的 灭 菌 的 温 度 及 维 持 的 时 间 随 灭 菌 物 品 的 性 质 和 容 量 等 具 体 情 况 而 有 所 改 变 例 如 含 糖 培 养 基 用 0.06Mpa(8Ib/in 2 或 0.59kg/cm 2 )112.6 灭 菌, 然 后 以 无 菌 操 作 手 续 加 入 灭 菌 的 糖 溶 液 又 如 盛 于 试 管 内 的 培 养 基 以 0.1Mpa,121.5 灭 菌 20min 即 可, 而 盛 于 大 瓶 内 的 培 养 基 最 好 以 0.1Mpa,122 灭 菌 30min 实 验 中 常 用 的 非 自 控 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 有 卧 式 和 手 提 式 二 种, 其 结 构 和 工 作 原 理 相 同, 本 实 验 以 手 提 式 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 为 例, 介 绍 其 使 用 方 法, 有 关 自 控 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 (autoclave) 的 使 用 可 参 照 厂 家 说 明 书 ( 三 ) 器 材 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基, 培 养 皿 (6 套 一 包 ), 手 提 式 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 等 ( 四 ) 操 作 步 骤 1. 首 先 将 内 层 锅 取 出, 再 向 外 层 锅 内 加 入 适 量 的 水, 使 水 面 与 三 角 搁 架 相 平 为 宜 切 勿 忘 记 加 水, 同 时 水 量 不 可 过 少, 以 防 灭 菌 锅 烧 干 而 引 起 炸 裂 事 故

10 2. 放 回 内 层 锅, 并 装 入 待 灭 菌 物 品 注 意 不 要 装 得 太 挤, 以 免 防 碍 蒸 气 流 通 而 影 响 灭 菌 效 果 三 角 烧 瓶 与 试 管 口 端 均 不 要 与 锅 壁 接 触, 以 免 冷 凝 水 淋 湿 包 口 的 纸 而 透 入 棉 塞 3. 加 盖, 并 将 盖 上 的 排 气 软 管 插 入 内 层 锅 的 排 气 槽 内 再 以 两 两 对 称 的 方 式 同 时 旋 紧 相 对 的 两 个 螺 栓, 使 螺 栓 松 紧 一 致, 勿 使 漏 气 4. 用 电 炉 或 煤 气 加 热, 并 同 时 打 开 排 气 阀, 使 水 沸 腾 以 排 除 锅 内 的 冷 空 气 待 冷 空 气 完 全 排 尽 后, 关 上 排 气 阀, 让 锅 内 的 温 度 随 蒸 气 压 力 增 加 到 逐 渐 上 升 当 锅 内 压 力 升 到 所 需 压 力 时, 控 制 热 源, 维 持 压 力 至 所 需 时 间 本 实 验 用 0.1Mpa,121.5,20min 灭 菌 灭 菌 的 主 要 因 素 是 温 度 而 不 是 压 力 因 此 锅 内 冷 空 气 必 须 完 全 排 尽 后, 才 能 关 上 排 气 阀, 维 持 所 需 压 力 5. 灭 菌 所 需 时 间 到 后, 切 断 电 源 或 关 闭 煤 气, 让 灭 菌 锅 内 温 度 自 然 下 降, 当 压 力 表 的 压 力 降 至 0 时, 打 开 排 气 阀, 旋 松 螺 栓, 打 开 盖 子, 取 出 灭 菌 物 品 压 力 一 定 要 降 到 0 时, 才 能 打 开 排 气 阀, 开 盖 取 物 否 则 就 会 因 锅 内 压 力 突 然 下 降, 使 容 器 内 的 培 养 基 由 于 内 外 压 力 不 平 衡 而 冲 出 烧 瓶 口 或 试 管 口, 造 成 棉 塞 沾 染 培 养 基 而 发 生 污 染, 甚 至 灼 伤 操 作 者 6. 将 取 出 的 灭 菌 培 养 基, 需 摆 斜 面 的 则 摆 成 斜 面, 然 后 放 入 37 温 箱 培 养 24h, 经 检 查 若 无 杂 菌 生 长, 即 可 待 用 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果 检 查 培 养 基 灭 菌 是 否 彻 底 2. 思 考 题 (1) 高 压 蒸 气 灭 菌 开 始 之 前, 为 什 么 要 将 锅 内 冷 空 气 排 尽? 灭 菌 完 毕 后, 为 什 么 待 压 力 降 低 0 时 才 能 打 开 排 气 阀, 开 盖 取 物? (2) 在 使 用 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 灭 菌 时, 怎 样 杜 绝 一 切 不 安 全 的 因 素? (3) 灭 菌 在 微 生 物 实 验 操 作 中 有 何 重 要 意 义? (4) 黑 曲 霉 的 孢 子 与 芽 孢 杆 菌 的 孢 子 对 热 的 抗 性 哪 个 最 强? 为 什 么? 三 紫 外 线 灭 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 了 解 紫 外 线 灭 菌 的 原 理 和 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 紫 外 线 灭 菌 是 用 紫 外 线 灯 进 行 的 波 长 为 200~300nm 的 紫 外 线 都 有 杀 菌 能 力, 其 中 以 260nm 的 杀 菌 力 最 强 在 波 长 一 定 的 条 件 下, 紫 外 线 的 杀 菌 效 率 与 强 度 和 时 间 的 乘 积 成 正 比 紫 外 线 杀 菌 机 理 主 要 是 因 为 它 诱 导 了 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体 的 形 成 和 DNA 链 的 交 联, 从 而 抑 制 了 DNA 的 复 制 另 一 方 面, 由 于 辐 射 能 使 空 气 中 的 氧 电 离 成 [O], 再 使 O2 氧 化 生 成 臭 氧 (O3) 或 使 水 (H2O) 氧 化 生 成 过 氧 化 氢 (H2O2) O3 和 H2O2 均 有 杀 菌 作 用 紫 外 线 穿 透 力 不 大, 所 以, 只 适 用 于 无 菌 室, 接 种 箱, 手 术 室 内 的 空 气 及 物 体 表 面 的 灭 菌 紫 外 线 灯 距 照 射 物 以 不 超 过 1.2m 为 宜 此 外, 为 了 加 强 紫 外 线 灭 菌 效 果, 在 打 开 紫 外 灯 以 前 ; 可 在 无 菌 室 内 ( 或 接 种 箱 内 ) 喷 洒 3%~5% 石 炭 酸 溶 液, 一 方 面 使 空 气 中 附 着 有 微 生 物 的 尘 埃 降 落, 另 一 方 面 也 可 以 杀 死 一 部 分 细 菌 无 菌 室 内 的 桌 面 凳 子 可 用 2%~3% 的 来 苏 尔 擦 洗, 然 后 再 开 紫 外 灯 照 射, 即 可 增 强 杀 菌 效 果, 达 到 灭 菌 目 的 ( 三 ) 器 材 1. 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 2. 溶 液 或 试 剂 3%~5% 石 炭 酸 或 2%~3% 来 苏 尔 溶 液

11 3. 仪 器 或 其 他 用 具 紫 外 线 灯 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 单 用 紫 外 线 照 射 (1) 在 无 菌 室 内 或 在 接 种 箱 内 打 开 紫 外 线 灯 开 关, 照 射 30min, 将 开 关 关 闭 (2) 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 盖 打 开 15min, 然 后 盖 上 皿 盖 置 37 培 养 24h 共 做 三 套 (3) 检 查 每 个 平 板 上 生 长 的 菌 落 数 如 果 不 超 过 4 个, 说 明 灭 菌 效 果 良 好, 否 则, 需 延 长 照 射 时 间 或 同 时 加 强 其 他 措 施 2. 化 学 消 毒 剂 与 紫 外 线 照 射 结 合 使 用 (1) 在 无 菌 室 内, 先 喷 洒 3%~5% 的 石 炭 酸 溶 液, 再 用 紫 外 线 灯 照 射 15imn (2) 无 菌 室 内 的 桌 面, 凳 子 用 2%~3% 来 苏 尔 擦 洗, 再 打 开 紫 外 线 灯 照 射 15min (3) 检 查 灭 菌 效 果 [ 方 法 同 单 用 紫 外 线 照 射 (3)] 因 紫 外 线 对 眼 结 膜 及 视 神 经 有 损 伤 作 用, 对 皮 肤 有 刺 激 作 用, 故 不 能 直 视 紫 外 线 灯 光 下 工 作 ( 五 ) 实 验 报 告 1. 结 果 记 录 两 种 灭 菌 效 果 列 于 表 中 2. 思 考 题 (1) 细 菌 营 养 体 细 胞 和 细 菌 芽 孢 对 紫 外 线 和 的 抵 抗 力 会 一 样 吗, 为 什 么? (2) 你 知 道 紫 外 线 灯 管 是 用 什 么 玻 璃 制 作 的? 为 什 么 不 用 普 通 灯 用 玻 璃? (3) 在 紫 外 灯 下 观 察 实 验 结 果 时, 为 什 么 要 隔 一 块 普 通 玻 璃? 四 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 了 解 过 滤 除 菌 的 原 理 2. 掌 握 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌 的 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 过 滤 除 菌 是 通 过 机 械 作 用 滤 去 液 体 或 气 体 中 细 菌 的 方 法 根 据 不 同 的 需 要 选 用 不 同 的 滤 器 和 滤 板 材 料 微 孔 滤 膜 过 滤 器 是 由 上 下 二 个 分 别 具 有 出 口 和 入 口 连 接 装 置 的 塑 料 盖 盒 组 成, 出 口 处 可 连 接 针 头, 人 口 处 可 连 接 针 筒, 使 用 时 将 滤 膜 装 入 两 塑 料 盖 盒 之 间, 旋 紧 盖 盒, 当 溶 液 从 针 筒 注 入 滤 器 时, 此 滤 器 将 各 种 微 生 物 阻 留 在 微 孔 滤 膜 上 面, 从 而 达 到 除 菌 的 目 的 根 据 待 除 菌 溶 液 量 的 多 少, 可 选 用 不 同 大 小 的 滤 器 此 法 除 菌 的 最 大 优 点 是 可 以 不 破 坏 溶 液 中 各 种 物 质 的 化 学 成 分, 但 由 于 滤 量 有 限, 所 以 一 般 只 适 用 于 实 验 室 中 小 量 溶 液 的 过 滤 除 菌 ( 三 ) 器 材 1. 培 养 基 2% 的 葡 萄 糖 溶 液, 肉 汤 蛋 白 胨 平 板 2. 仪 器 或 其 他 用 具 注 射 器, 微 孔 滤 膜 过 滤 器,0.22μm 滤 膜, 无 菌 试 管, 镊 子, 玻 璃 刮 棒 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 组 装 灭 菌 将 0.22μm 孔 径 的 滤 膜 装 入 清 洗 干 净 的 塑 料 滤 器 中, 旋 紧 压 平, 包 装 灭 菌 后 待 用 (0.lMPa, 灭 菌 20min) 2. 连 接 将 灭 菌 滤 器 的 入 口 在 无 菌 条 件 下, 以 无 菌 操 作 方 式 连 接 于 装 有 待 滤 溶 液 (2% 葡 萄 糖 溶 液 ) 的 注 射 器 上, 将 针 头 与 出 口 处 连 接 并 插 入 带 橡 皮 塞 的 无 菌 试 管 中 见 图 压 滤

12 将 注 射 器 中 的 待 滤 溶 液 加 压 缓 缓 挤 入 过 滤 到 无 菌 试 管 中, 滤 毕, 将 针 头 拨 出 压 滤 时, 用 力 要 适 当, 不 可 太 猛 太 快, 以 免 细 菌 被 挤 压 通 过 淀 胶. 4. 无 菌 检 查 无 菌 操 作 吸 取 除 菌 滤 液 0.1ml 于 肉 汤 蛋 白 胨 平 板 上, 涂 布 均 匀, 置 37 温 室 中 培 养 24h, 检 查 是 否 有 菌 生 长 5. 清 洗 弃 去 塑 料 滤 器 上 的 微 孔 滤 膜, 将 塑 料 滤 器 清 洗 干 净, 并 换 上 一 张 新 的 微 孔 滤 膜, 组 装 包 扎, 再 经 无 菌 后 使 用 整 个 过 程 应 在 无 菌 条 件 下 严 格 无 菌 操 作, 以 防 污 染, 过 滤 时 应 避 免 各 连 接 处 出 现 渗 漏 现 象 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果 记 录 无 菌 检 查 结 果 2. 思 考 题 (1) 你 做 的 过 滤 除 菌 实 验 效 果 如 何? 如 果 经 培 养 检 查 有 杂 菌 生 长, 你 认 为 是 什 么 原 因 造 成 的? (2) 如 果 你 需 要 配 制 一 种 含 有 某 抗 生 素 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基, 其 抗 生 素 的 终 浓 度 ( 或 工 作 浓 度 ) 为 50μg/ml, 你 将 如 何 操 作? (3) 过 滤 除 菌 应 注 意 哪 些 问 题?

13 实 验 四 土 壤 的 稀 释 分 离 纯 化 微 生 物 及 无 菌 操 作 技 术 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 习 从 土 壤 中 分 离 微 生 物 的 方 法, 学 习 无 菌 操 作 技 术 内 容 : l. 用 稀 释 法 分 离 细 菌 放 线 菌 和 霉 菌 2. 用 平 板 划 线 方 法 分 离 微 生 物 3. 学 习 斜 面 接 种 及 穿 刺 接 种 等 无 菌 操 作 技 术 二 实 验 材 料 和 用 具 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 和 普 通 变 形 菌 (Proteus vulgaris) 斜 面 菌 种 已 灭 菌 的 牛 肉 膏 高 氏 1 号 土 豆 蔗 糖 固 体 培 养 基 各 1 瓶,49.5mL 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 )1 瓶,4.5mL 无 菌 水 6 管,80% 乳 酸,10% 酚 液,95% 乙 醇 无 菌 培 养 皿 12 套,1mL 无 菌 移 液 管 10 支, 土 壤 样 品 及 天 平 称 量 纸 药 勺 试 管 架 玻 璃 铅 笔 橡 皮 头 ( 用 75% 乙 醇 浸 泡 ) 玻 璃 刮 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 土 壤 稀 释 分 离 1. 取 土 壤 取 表 层 以 下 5 10cm 处 的 土 样, 放 入 无 菌 的 袋 中 备 用, 或 放 在 4 冰 箱 中 暂 存 2. 制 备 稀 释 液 ( 要 无 菌 操 作 ) (1) 制 备 土 壤 悬 液 : 称 土 样 0.5g, 迅 速 倒 入 带 玻 璃 珠 的 49.5mL 无 菌 水 瓶 中 ( 玻 璃 珠 用 量 以 充 满 瓶 底 力 最 好 ), 振 荡 5~10min, 使 土 样 充 分 打 散, 即 成 为 10-2 的 土 壤 悬 液 (2) 稀 释 : 用 无 菌 移 液 管 吸 10-2 的 土 壤 悬 液 0.5mL, 放 入 4.5mL 无 菌 水 中 即 为 10-3 稀 释 液, 如 此 重 复, 可 依 次 制 成 10-3~10-8 的 稀 释 液 ( 图 4-1) 注 意 : 操 作 时 管 尖 不 能 接 触 液 面, 每 一 个 稀 释 度 换 用 一 支 移 液 管, 每 次 吸 入 土 液 后, 要 将 移 液 管 插 入 液 面, 吹 吸 3 次, 每 次 吸 上 的 液 面 要 高 于 前 一 次, 以 减 少 稀 释 中 的 误 差 3. 混 菌 法 测 定 菌 落 数 的 方 法 (1) 细 菌 : 取 两 管 稀 释 液 各 1mL, 分 别 接 人 相 应 标 号 的 平 皿 中, 每 个 稀 释 度 接 两 个 平 皿 然 后 取 冷 却 至 50 的 牛 肉 膏 琼 脂 培 养 基, 分 别 倒 入 以 上 培 养 皿 中 ( 装 量 以 铺 满 皿 底 高 1.5~2mm 为 宜 ), 迅 速 轻 轻 摇 动 平 皿, 使 菌 液 与 培 养 基 充 分 混 匀, 但 不 沾 湿 皿 的 边 缘, 待 琼 脂 凝 固 即 成 细 菌 平 板 倒 平 板 时 要 注 意 无 菌 操 作, 见 图 4-2 (2) 放 线 菌 : 取 两 管 稀 释 液, 在 每 管 中 加 入 10% 酚 液 5~6 滴, 摇 匀, 静 置 片 刻, 然 后 分 别 从 两 管 中 吸 出 1mL 加 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 选 用 高 氏 1 号 培 养 基, 用 与 细 菌 相 同 的 方 法 倒 入 平 皿 中, 便 可 制 成 放 线 菌 平 板 (3) 霉 菌 : 取 两 管 稀 释 各 1mL, 分 别 接 入 相 应 标 号 的 平 皿 中, 每 个 稀 释 度 接 两 个 平 皿 在 融 化 的 土 豆 蔗 糖 培 养 基 中, 每 100mL 加 入 灭 菌 的 乳 酸 1mL, 轻 轻 摇 匀, 然 后 用 与 细 菌 相 同 的 方 法 倒 入 平 皿 中, 便 可 制 成 霉 菌 的 平 板

14 4 1 稀 释 法 分 离 土 壤 微 生 物 操 作 过 程 图 解 图 4 2 倒 平 板 的 方 法 4. 培 养 将 接 种 好 的 细 菌 放 线 菌 霉 菌 平 板 倒 置, 即 皿 盖 朝 下 放 置, 于 28~30 中 恒 温 培 养, 细 菌 培 养 1~2d, 放 线 菌 培 养 5~7d, 霉 菌 培 养 3~5d 观 察 生 长 的 菌 落, 用 于 进 一 步 纯 化 分 离 或 直 接 转 接 斜 面 ( 二 ) 平 板 制 作 及 划 线 分 离 方 法 1. 倒 平 板 按 无 菌 操 作 要 求, 在 火 焰 旁 操 作 ( 图 4 2) 2. 划 线 分 离 使 用 接 种 环, 从 待 纯 化 的 菌 落 或 待 分 离 的 斜 面 菌 种 只 沾 取 少 量 菌 样, 在 相 应 培 养 基 平 板 中 划 线 分 离, 划 线 的 方 法 多 样, 目 的 是 获 得 单 个 菌 落, 主 要 方 法 参 见 图 4 3 和 图 4-4 图 4 3 平 板 划 线 方 法 示 意 图

15 图 4-5 平 板 划 线 分 离 的 划 线 方 法 左 : 连 续 划 线 法 右 : 分 区 划 线 法 ( 为 依 次 划 线 的 起 点 ) 3. 培 养 方 法 同 土 壤 稀 释 分 离 图 4-6 斜 面 接 种 无 菌 操 作 ( 三 ) 斜 面 接 种 和 穿 刺 接 种 1. 斜 面 接 种 (1) 取 新 鲜 固 体 斜 面 培 养 基, 分 别 做 好 标 记 ( 写 上 菌 名 接 种 日 期 接 种 人 等 ), 然 后 用 无 菌 操 作 方 法, 把 待 接 菌 种 接 入 以 上 新 鲜 培 养 基 斜 面 上 (2) 接 种 的 方 法 是, 用 接 种 环 沾 取 少 量 待 接 菌 种, 然 后 在 新 鲜 斜 面 上 之 字 形 划 线, 方 向 是 从 下 部 开 始, 一 直 划 至 上 部 ( 图 4 6) 注 意 划 线 要 轻, 不 可 把 培 养 基 划 破 (3) 接 种 后 30 恒 温 培 养, 细 菌 培 养 48h, 放 线 菌 霉 菌 培 养 至 孢 子 成 熟 方 可 取 出 保 存 2. 穿 刺 接 种 (1) 取 两 支 新 鲜 半 固 体 牛 肉 膏 蛋 白 胨 柱 状 培 养 基, 做 好 标 记 ( 写 上 菌 名 ) 接 种 日 期, 接 种 人 等 ) (2) 接 种 的 方 法 是, 用 接 种 针 沾 取 少 量 待 接 菌 种, 然 后 从 柱 状 培 养 基 的 中 心 穿 入 其 底 部 ( 但 不 要 穿 透 ), 然 后 沿 原 刺 入 路 线 抽 出 接 种 针, 注 意 接 种 针 不 要 移 动 (3) 接 种 后 30 恒 温 培 养, 24h 后 观 察, 比 较 两 种 菌 的 生 长 结 果 四 注 意 事 项 1. 一 般 土 壤 中, 细 菌 最 多, 放 线 菌 及 霉 菌 次 之, 而 酵 母 菌 主 要 见 于 果 园 及 菜 园 土 壤 中, 故 从 土 壤 中 分 离 细 菌 时, 要 取 较 高 的 稀 释 度, 否 则 菌 落 连 成 一 片 不 能 计 数 2. 在 土 壤 稀 释 分 离 操 作 中, 每 稀 释 10 倍, 最 好 更 换 一 次 移 液 管, 使 计 数 准 确 3. 放 线 菌 的 培 养 时 间 较 长, 故 制 平 板 的 培 养 基 用 量 可 适 当 增 多 图 4-8 穿 刺 接 种 的 两 种 方 法 ( 垂 直 法 和 水 平 法 )

16 五 实 验 报 告 1. 记 录 土 壤 稀 释 分 离 结 果, 并 计 算 出 每 克 土 壤 中 的 细 菌 放 线 菌 和 霉 菌 的 数 量 计 算 方 法 : 选 择 长 出 菌 落 数 30~300 之 间 的 培 养 皿 进 行 计 数, 按 以 下 公 式 : 总 菌 数 /g= 同 一 稀 释 度 几 次 重 复 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 2. 分 别 记 录 平 板 划 线 斜 面 接 种 的 结 果, 并 自 我 评 价 3. 比 较 两 种 细 菌 穿 刺 接 种 的 结 果, 并 进 行 分 析 七 问 题 和 思 考 1. 在 测 定 土 壤 微 生 物 含 量 中, 除 混 菌 法 外 还 可 用 什 么 方 法? 2. 试 设 计 实 验, 从 土 壤 中 分 离 出 酵 母 菌, 并 进 行 计 数

17 实 验 5 细 菌 单 染 色 法 及 口 腔 微 生 物 的 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 巩 固 无 菌 操 作 技 术, 掌 握 细 菌 的 涂 片 和 单 染 色 技 术, 了 解 口 腔 中 的 微 生 物 及 其 观 察 方 法 内 容 :1. 学 习 细 菌 单 染 色 操 作 技 术 2. 用 单 染 色 法 或 负 染 色 法 观 察 口 腔 中 的 微 生 物 二 实 验 材 料 和 用 具 大 肠 杆 菌 (E.coli) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylocosccus aureus) 的 斜 面 菌 种 吕 氏 美 蓝 染 色 液 石 炭 酸 复 红 染 色 液 黑 色 素 液 或 碳 素 墨 水 香 柏 油 二 甲 苯 无 菌 水 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 酒 精 灯 载 玻 片 吸 水 纸 无 菌 牙 签 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 单 染 色 法 1. 涂 片 在 洁 净 无 脂 的 载 玻 片 中 央 滴 一 小 滴 无 菌 水, 用 无 菌 操 作 方 法 从 菌 种 斜 面 挑 取 少 量 菌 体 与 水 滴 充 分 混 匀, 涂 成 薄 膜, 涂 布 面 积 约 1~1.5cm2( 图 7 1A B) 2. 干 燥 将 涂 片 于 室 温 中 自 然 干 燥 3. 固 定 手 扶 载 片 一 端, 使 涂 菌 的 一 面 向 上, 将 载 片 通 过 微 火 2~3 次 在 火 上 固 定 时, 用 手 摸 涂 片 反 面, 以 不 烫 手 为 宜 不 能 将 载 片 在 火 上 烤, 否 则 细 菌 形 态 毁 坏 ( 图 7 1C) 4. 染 色 将 涂 片 置 于 水 平 位 置, 滴 加 染 色 液 覆 盖 于 涂 菌 处, 染 色 约 2min( 图 7 1D) 5. 水 洗 倾 去 染 色 液, 斜 置 载 片, 用 自 来 水 的 细 水 流 由 载 片 上 端 流 下, 不 得 直 接 冲 在 涂 菌 处, 直 洗 至 从 载 片 上 流 下 的 水 中 无 染 色 液 的 颜 色 为 止 ( 图 7 1E) 6. 干 燥 自 然 晾 干 或 用 吸 水 纸 轻 轻 地 吸 干, 注 意 不 要 擦 掉 菌 体 ( 图 7 1F) 7. 待 标 本 完 全 干 燥 后, 先 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 观 察, 将 典 型 部 位 移 至 视 野 中 央, 再 用 油 镜 观 察 图 5 1 单 染 色 的 方 法 ( 二 ) 口 腔 微 生 物 的 观 察 1. 单 染 色 法 (1) 在 洁 净 无 油 腻 的 载 片 中 央 滴 一 小 滴 无 菌 水, 用 牙 签 取 牙 垢 少 许 与 水 滴 充 分 混 匀, 涂 成 薄 膜 (2) 将 涂 片 于 室 温 中 自 然 干 燥 后, 按 上 面 单 染 色 法 的 步 骤, 进 行 固 定 染 色 水 洗, 干 燥 后 镜 检 2. 负 染 色 法 (1) 在 洁 净 无 油 腻 的 载 片 的 一 端 滴 一 小 滴 无 菌 水, 用 牙 签 取 牙 垢 少 许 与 水 滴 充 分 混 匀,

18 然 后 加 少 许 黑 色 素 溶 液, 充 分 混 匀 (2) 另 取 一 载 片 将 其 边 缘 放 在 含 菌 载 片 的 一 端, 然 后 推 向 另 一 端, 则 含 菌 载 片 上 的 混 合 液 被 推 成 薄 膜 (3) 于 室 温 中 自 然 干 燥 (4) 镜 检 : 将 光 线 调 亮, 先 用 低 倍 镜 观 察, 再 用 高 倍 镜 观 察 四 注 意 事 项 载 玻 片 要 洁 净 无 脂, 否 则 菌 液 涂 不 开 涂 片 时, 滴 水 不 要 过 多, 挑 菌 量 宜 少, 菌 膜 宜 薄 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 1. 单 染 色 后 观 察 到 的 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 形 态 图 2. 你 所 观 察 到 的 口 腔 微 生 物 的 形 态 图, 并 注 明 使 用 的 染 色 方 法, 菌 体 和 背 景 的 颜 色 ( 二 ) 单 染 色 法 和 负 染 色 法 操 作 要 点 七 问 题 和 思 考 1. 涂 片 在 染 色 前 为 什 么 要 先 进 行 固 定? 固 定 时 应 注 意 什 么 问 题? 2. 制 备 染 色 装 片 时 应 注 意 哪 些 事 项, 为 什 么? 制 片 为 什 么 要 完 全 干 燥 后 才 能 用 油 镜 观 察? 3. 你 知 道 口 腔 中 通 常 存 在 哪 些 微 生 物 吗? 如 何 进 行 区 分?

19 实 验 6 细 菌 的 革 兰 氏 染 色 一 实 验 目 的 与 内 容 目 的 : 初 步 掌 握 细 菌 涂 片 方 法 及 革 兰 氏 染 色 法 步 骤 内 容 :1. 制 作 细 菌 染 色 装 片 2. 进 行 革 兰 氏 染 色 法 操 作 二 实 验 材 料 和 用 具 苏 云 金 杆 菌 或 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 大 肠 杆 菌 (E.coli) 菌 液, 待 测 菌 菌 液 1~2 种 革 兰 氏 染 色 液 ( 结 晶 紫 染 液 卢 戈 氏 碘 液 95% 乙 醇 石 炭 酸 复 红 液 等 ) 香 柏 油 二 甲 苯 ; 显 微 镜 擦 镜 纸 接 种 环 载 玻 片 吸 水 纸 试 管 小 滴 管 酒 精 灯 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 制 片 1. 涂 菌 用 无 菌 操 作 方 法 从 试 管 中 沾 取 菌 液 一 环, 用 接 种 环 在 洁 净 无 脂 的 载 玻 片 上 做 一 薄 而 均 匀 直 径 约 lcm 的 菌 膜 涂 菌 后 将 接 种 环 火 焰 灭 菌 2. 干 燥 于 空 气 中 自 然 干 燥 亦 可 把 玻 片 置 于 火 焰 上 部 略 加 温 加 速 干 燥 ( 温 度 不 宜 过 高 ) 3. 固 定 目 的 是 杀 死 细 菌 并 使 细 菌 粘 附 在 玻 片 上, 便 于 染 料 着 色, 常 用 加 热 法, 即 将 细 菌 涂 片 膜 向 上, 通 过 火 焰 3 次, 以 热 而 不 烫 为 宜, 防 止 菌 体 烧 焦 变 形 此 制 片 可 用 于 染 色 ( 二 ) 染 色 l. 初 染 于 制 片 上 滴 加 结 晶 紫 染 液, 染 lmin 后, 用 水 洗 去 剩 余 染 料 2. 媒 染 滴 加 卢 戈 氏 碘 液,lmin 后 水 洗 3. 脱 色 滴 加 95% 乙 醇 脱 色, 摇 动 玻 片 至 紫 色 不 再 为 乙 醇 脱 退 为 止 ( 根 据 涂 片 之 厚 薄 需 时 30s 至 lmin), 水 洗 4. 复 染 滴 加 石 炭 酸 复 红 液 复 染 lmin, 水 洗 5. 滤 纸 吸 干, 油 镜 镜 检 ( 三 ) 结 果 革 兰 氏 阳 性 菌 染 成 蓝 紫 色, 革 兰 氏 阴 性 菌 染 成 淡 红 色 ( 四 ) 检 测 未 知 菌 用 以 上 方 法 对 未 知 菌 进 行 革 兰 氏 染 色, 并 绘 图 记 录 染 色 结 果 四 注 意 事 项 1. 涂 片 务 求 均 匀, 切 忌 过 厚 2. 在 染 色 过 程 中, 不 可 使 染 液 干 涸 3. 脱 色 时 间 十 分 重 要, 过 长, 则 脱 色 过 度, 会 使 阳 性 菌 被 染 成 阴 性 菌 ; 脱 色 不 够, 则 会 使 阴 性 菌 被 染 成 阳 性 菌 4. 老 龄 菌 因 体 内 核 酸 减 少, 会 便 阳 性 菌 被 染 成 阴 性 菌, 故 不 能 选 用 五 实 验 报 吉 ( 一 ) 绘 图 1. 大 肠 杆 菌 革 兰 氏 染 色 视 野 图 2. 金 黄 色 葡 萄 球 菌 或 苏 云 金 杆 菌 革 兰 氏 染 色 视 野 图 ( 二 ) 记 录 革 兰 氏 染 色 法 法 步 骤, 并 进 行 结 果 分 析 ( 三 ) 未 知 菌 的 检 测 结 果 六 问 题 和 思 考 1. 涂 片 后 为 什 么 要 进 行 固 定? 固 定 时 应 注 意 什 么? 2. 什 么 是 革 兰 氏 染 色 法? 染 色 过 程 应 注 意 什 么? 3. 试 分 析 革 兰 氏 染 色 法 在 细 菌 分 类 中 的 意 义

20 实 验 7 放 线 菌 霉 菌 酵 母 菌 形 态 及 菌 落 的 观 察 I 放 线 菌 霉 菌 形 态 的 观 察 一 目 的 要 求 1 学 习 掌 握 水 浸 片 观 察 霉 菌 形 态 特 征 2 学 习 掌 握 插 片 观 察 放 线 菌 形 态 特 征 3 学 习 掌 握 观 察 酵 母 菌 形 态 特 征 二 实 验 内 容 1 观 察 梨 头 霉 (Absidia.sp) 接 合 孢 子 的 形 态 2 观 察 根 霉 (Rhizopus.sp) 的 假 根 和 孢 子 3 观 察 青 霉 (Penicillium) 的 分 生 孢 子 梗 4 观 察 曲 霉 (Aspergillus) 的 形 态 5 观 察 平 菇 (Pleurotus.sp) 的 锁 状 联 合 现 象 6 用 插 片 法 观 察 放 线 菌 (Streptomyces.sp) 的 形 态 三 实 验 器 材 1 菌 种 : 梨 头 霉 根 霉 青 霉 曲 霉 放 线 菌 酿 母 等 平 板 菌 种 2 载 玻 片 盖 玻 片 显 微 镜 解 剖 针 蒸 馏 水 四 实 验 步 骤 ( 一 ) 梨 头 霉 属 接 合 孢 子 的 形 态 观 察 1 清 洁 载 玻 片, 并 在 中 央 加 一 滴 蒸 馏 水 2 用 解 剖 针 在 培 养 皿 中 挑 取 (+) (-) 菌 丝 交 接 处 的 菌 丝 放 入 水 滴 中 3 两 手 各 持 解 剖 针, 将 菌 丝 仔 细 分 开, 不 使 其 缠 绕 成 团 4 盖 上 盖 玻 片, 注 意 不 要 产 生 气 泡 5 先 用 低 倍 镜, 后 用 高 倍 镜 进 行 观 察 ( 二 ) 根 霉 的 形 态 观 察 挑 菌 丝 少 许 制 作 水 浸 片, 然 后 用 低 倍 镜 观 察 根 霉 的 形 态, 并 注 意 其 假 根 孢 子 囊 孢 子 的 特 征 ( 三 ) 青 霉 分 生 孢 子 梗 的 观 察 用 接 种 针 从 培 养 皿 中 连 培 养 基 一 起 挑 一 小 块 放 于 载 玻 片 中 央 的 小 滴 蒸 馏 水 中, 盖 上 盖 玻 片, 并 轻 轻 地 挤 压 盖 玻 片 使 之 分 散 先 用 低 倍 镜, 后 用 高 倍 镜 观 察 青 霉 的 形 态, 并 注 意 其 扫 帚 状 分 生 孢 子 梗 的 特 征 ( 四 ) 曲 霉 的 形 态 观 察 制 作 曲 霉 水 浸 片 [ 方 法 同 ( 三 )], 然 后 用 低 倍 镜 高 倍 镜 观 察 曲 霉 顶 部, 瓶 状 体 及 其 细 胞 的 形 态 ( 五 ) 平 菇 的 锁 状 联 合 现 象 观 察 挑 菌 丝 少 许 制 作 水 浸 片 [ 方 法 同 ( 一 )] 然 后 用 低 倍 镜 高 倍 镜 观 察 平 菇 的 锁 状 联 合 现 象 ( 六 ) 放 线 菌 的 形 态 观 察 取 下 经 过 插 片 法 培 养 的 盖 玻 片, 置 于 载 玻 片 上 先 用 低 倍 镜, 后 用 高 倍 镜 观 察 放 线 菌 的 基 内 菌 丝 气 生 菌 丝 和 孢 子 丝 的 形 态 五 结 果 与 思 考 1 绘 出 所 观 察 到 的 梨 头 霉 的 接 合 孢 子, 根 霉 青 霉 曲 霉 放 线 菌 的 形 态 及 平 菇 锁 状 联 合 现 象 2 为 什 么 观 察 霉 菌 时, 用 水 浸 片 法 制 作, 而 观 察 细 菌 时 却 要 用 涂 片 法 制 作?

21 3 说 明 放 线 菌 的 基 内 菌 丝 和 气 生 菌 丝 各 有 何 特 点? II 酵 母 菌 的 形 态 观 察 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 了 解 自 然 存 在 的 酵 母 菌 及 其 形 态 结 构 了 解 酵 母 菌 产 生 子 囊 孢 子 的 条 件 及 其 形 态 内 容 : 1. 观 察 酵 母 菌 个 体 形 态 2. 观 察 酵 母 菌 的 假 菌 丝 和 繁 殖 过 程 3. 观 察 自 然 状 态 的 酵 母 菌 二 实 验 材 料 和 用 具 酿 酒 酵 母 (Saccharomyes cerevisiae) 热 带 假 丝 酵 母 (Candida tropicalis) 斜 面 菌 种 PDA 培 养 基 麦 氏 (McCLary) 培 养 基 ( 醋 酸 钠 培 养 基 ) 0.05% 美 蓝 染 色 液 ( 以 ph6.0 的 0.02mol/L 磷 酸 缓 冲 液 配 制 ) 碘 液 0.04% 的 中 性 红 染 色 液 % 孔 雀 绿,0.5% 沙 黄 液 95% 乙 醇 ; 显 微 镜 载 玻 片 擦 镜 纸 盖 玻 片 接 种 环 V 形 玻 璃 棒 放 置 一 个 三 角 形 玻 璃 棒 支 架 的 培 养 皿 三 操 作 步 骤 ( 一 ) 酵 母 菌 形 态 观 察 1. 酵 母 菌 的 话 体 染 色 观 察 及 死 亡 率 的 测 定 (1) 以 无 菌 水 洗 下 PDA 斜 面 培 养 的 酿 酒 酵 母 菌 苔, 制 成 菌 悬 液 (2) 取 0.05% 美 蓝 染 色 液 1 滴, 置 载 玻 片 中 央, 并 用 接 种 环 取 酵 母 菌 悬 液 与 染 色 液 混 匀, 染 色 2~3min, 加 盖 玻 片, 在 高 倍 镜 下 观 察 酵 母 菌 个 体 形 态, 区 分 其 母 细 胞 与 芽 体, 区 分 死 细 胞 ( 蓝 色 ) 与 活 细 胞 ( 不 着 色 ) (3) 在 一 个 视 野 里 计 数 死 细 胞 和 活 细 胞, 共 计 数 5~6 个 视 野 酵 母 菌 死 亡 率 一 般 用 百 分 数 来 表 示, 以 下 式 来 计 算 : 死 亡 率 = 死 细 胞 总 数 死 活 细 胞 总 数 100% 2. 酵 母 菌 液 泡 系 的 话 体 观 察 于 洁 净 载 玻 片 中 央 加 一 滴 中 性 红 染 色 液, 取 少 许 上 述 酵 母 菌 悬 液 与 之 混 合, 染 色 5min, 加 盖 玻 片 在 显 微 镜 下 观 察 细 胞 无 色, 液 泡 呈 红 色 3. 酵 母 菌 细 胞 中 肝 糖 粒 的 观 察 将 1 滴 碘 液 置 于 载 玻 片 中 央, 接 人 上 述 酵 母 菌 悬 液, 混 匀, 盖 上 盖 玻 片, 显 微 镜 观 察, 细 胞 内 的 贮 藏 物 质 肝 糖 颗 粒 呈 深 红 色 4. 酵 母 菌 子 囊 孢 子 的 观 察 (1) 活 化 酿 酒 酵 母 : 将 酿 酒 酵 母 接 种 至 新 鲜 的 麦 芽 汁 培 养 基 上, 置 28C 培 养 2~3d, 然 后 再 移 植 2~3 次 (2) 转 接 产 孢 培 养 基 : 将 活 化 的 酿 酒 酵 母 转 接 至 醋 酸 钠 培 养 基 上, 置 30 恒 温 培 养 14d (3) 观 察 : 挑 取 少 许 产 孢 菌 苔 于 载 玻 片 的 水 滴 上, 经 涂 片 热 固 定 后, 加 数 滴 孔 雀 绿,lmin 后 水 洗, 加 95% 乙 醇 30S, 水 洗, 最 后 用 0.5% 沙 黄 液 复 染 30S, 水 洗 去 染 色 液, 最 后 用 吸 水 纸 吸 干 制 片 干 燥 后, 镜 检, 子 囊 孢 子 呈 绿 色, 子 囊 为 粉 红 色 注 意 观 察 子 囊 孢 子 的 数 目 形 状 和 子 囊 的 形 成 率 (4) 计 算 子 囊 形 成 的 百 分 率 : 计 数 时 随 机 取 3 个 视 野, 分 别 计 数 产 子 囊 孢 子 的 子 囊 数 和 不 产 孢 子 的 细 胞, 然 后 按 下 列 公 式 计 算 : 子 囊 形 成 率 (%)=3 个 视 野 中 形 成 子 囊 的 总 数 3 个 视 野 中 ( 形 成 子 囊 的 总 数 + 不 产 孢 子 细 胞 总 数 ) 100% 5. 酵 母 菌 假 菌 丝 的 观 察 取 一 无 菌 载 玻 片 浸 于 溶 化 的 PDA 培 养 基 中, 取 出 放 在 温 室 培 养 的 支 架 上, 待 培 养 基 凝 固 后, 进 行 酵 母 菌 划 线 接 种, 然 后 将 无 菌 盖 玻 片 盖 在 接 菌 线 上 ( 图 12 1),28 培 养 2~3d 后, 取 出 载 玻 片, 擦 去 载 玻 片 下 面 的 培 养 基, 在 显 微 镜 下 直 接

22 观 察 可 见 到 芽 殖 酵 母 形 成 的 藕 节 状 假 菌 丝, 裂 殖 酵 母 则 形 成 竹 节 状 假 菌 丝 6. 自 然 状 态 下 的 酵 母 菌 观 察 取 一 滴 美 蓝 染 色 液 于 载 玻 片 中 央, 春 夏 秋 季 取 酱 油 或 淹 菜 上 的 白 膜, 冬 季 取 腌 酸 菜 汤 上 的 白 膜, 将 其 置 于 载 玻 片 染 色 液 中, 盖 上 盖 玻 片, 显 微 镜 下 仔 细 观 察 酵 母 菌 形 态, 出 芽 生 殖, 假 菌 丝 等 四 注 意 事 项 1. 用 于 活 化 酵 母 菌 的 麦 芽 汁 培 养 基 要 新 鲜 表 面 湿 润 2. 在 产 孢 培 养 基 上 加 大 移 种 量, 可 提 高 子 囊 形 成 率 3. 通 过 微 加 热 增 加 酵 母 的 死 亡 率, 易 于 观 察 死 亡 细 胞 五 实 验 报 告 ( 一 ) 绘 图 1. 数 个 酵 母 菌 细 胞, 示 观 察 到 的 结 构 2. 数 个 子 囊 及 子 囊 孢 子 形 态 图 ( 二 ) 记 录 并 计 数 酵 母 菌 的 死 亡 率 及 子 囊 形 成 率 ( 原 始 记 录 及 计 算 结 果 ) 六 问 题 和 思 考 1. 酵 母 菌 的 假 菌 丝 是 怎 样 形 成 的? 与 霉 菌 的 真 菌 丝 有 何 区 别? 2. 如 何 区 别 营 养 细 胞 和 释 放 出 的 子 囊 孢 子? 3. 试 设 计 一 个 从 子 囊 中 分 离 子 囊 孢 子 的 试 验 方 案 注 : 酵 母 菌 的 简 易 培 养 配 2% 葡 萄 糖 水 ( 或 自 糖 水 ), 煮 沸, 装 入 三 角 瓶 中 ( 液 面 高 度 2~2cm ), 加 HCl 调 至 ph3~5 放 入 几 块 葡 萄 皮 ( 或 其 他 糖 分 较 高 的 果 皮 ), 置 5~28 温 箱 中 培 养 2~3d, 闻 到 酒 香 味 后, 即 可 取 培 养 液 镜 检

23 实 验 8 微 生 物 大 小 和 数 量 的 测 定 I 细 菌 大 小 的 测 定 一 实 验 目 的 和 内 容 目 的 : 学 会 测 微 尺 的 使 用 和 计 算 方 法 及 对 球 菌 和 杆 菌 的 测 量 内 容 :1. 认 识 测 微 尺, 学 习 目 镜 测 微 尺 的 标 定 2. 测 定 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 菌 体 的 大 小 二 实 验 材 料 和 用 具 金 黄 色 葡 萄 球 菌 大 肠 杆 菌 的 玻 片 标 本 香 柏 油 二 甲 苯 ; 显 微 镜 目 镜 测 微 尺 镜 台 测 微 尺 擦 镜 纸 三 操 作 步 骤 l. 测 微 尺 的 构 造 显 微 镜 测 微 尺 是 由 目 镜 测 微 尺 和 镜 台 接 物 测 微 尺 组 成, 目 镜 测 微 尺 是 一 块 圆 形 玻 璃 片, 其 中 有 精 确 的 等 分 刻 度, 在 5mm 刻 尺 上 分 50 份 ( 图 14 一 lc) 目 镜 测 微 尺 每 格 实 际 代 表 的 长 度 随 使 用 接 目 镜 和 接 物 镜 的 放 大 倍 数 而 改 变, 因 此 在 使 用 前 必 须 用 镜 台 测 微 尺 进 行 标 定 镜 台 测 微 尺 为 一 专 用 中 央 有 精 确 等 分 线 的 载 玻 片 ( 图 14 1A), 一 般 将 长 为 1mm 的 直 线 等 分 成 100 个 小 格, 每 格 长 0.0lmm 即 10μm, 是 专 用 于 校 正 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 的 2. 目 镜 测 微 尺 的 标 定 把 目 镜 的 上 透 镜 旋 开, 将 目 镜 测 微 尺 轻 轻 放 在 目 镜 的 隔 板 上, 使 有 刻 度 的 一 面 朝 下 将 镜 台 测 微 尺 放 在 显 微 镜 的 载 物 台 上, 使 有 刻 度 的 一 面 朝 上 先 用 低 倍 镜 观 察, 调 焦 距, 待 看 清 镜 台 测 微 尺 的 刻 度 后, 转 动 目 镜, 使 目 镜 测 微 尺 的 刻 度 与 镜 台 测 微 尺 的 刻 度 相 平 行, 并 使 两 尺 左 边 的 一 条 线 重 合, 向 右 寻 找 另 外 一 条 两 尺 相 重 合 的 直 线 ( 图 15 lb) 3. 计 算 方 法 标 定 公 式 : 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 (μm)= 两 条 重 合 线 间 镜 台 测 微 尺 的 格 数 10 两 条 重 合 线 间 目 镜 测 微 尺 的 格 数 例 如, 目 镜 测 微 尺 20 个 小 格 等 于 镜 台 测 微 尺 3 小 格, 已 知 镜 台 测 微 尺 每 格 为 10μm, 则 3 小 格 的 长 度 为 3 10=30μm, 那 么 相 应 地 在 目 镜 测 微 尺 上 每 小 格 长 度 为 =1.5 μm 用 以 上 计 算 方 法 分 别 校 正 低 倍 镜 高 倍 镜 及 油 镜 下 目 镜 测 微 尺 每 格 实 际 长 度 4. 菌 体 大 小 的 测 定 将 镜 台 测 微 尺 取 下, 分 别 换 上 大 肠 杆 菌 及 金 黄 色 葡 萄 球 菌 玻 片 标 本, 先 在 低 倍 镜 和 高 倍 镜 下 找 到 目 的 物, 然 后 在 油 镜 下 用 目 镜 测 微 尺 测 量 菌 体 的 大 小 先 量 出 菌 体 的 长 和 宽 占 目 镜 测 微 尺 的 格 数, 再 以 目 镜 测 微 尺 每 格 的 长 度 计 算 出 菌 体 的 长 和 宽 并 详 细 记 录 于 表 15 1 中 例 如, 目 镜 测 微 尺 在 这 架 显 微 镜 下, 每 格 相 当 于 1.5μm, 测 量 的 结 果, 若 菌 体 的 平 均 长 度 相 当 于 目 镜 测 微 尺 的 2 格, 则 菌 体 长 应 为 3 1.5μm=3.0μm 一 般 测 量 菌 体 的 大 小, 应 测 定 10~20 个 菌 体, 求 出 平 均 值, 才 能 代 表 该 菌 的 大 小 四 注 意 事 项 1. 镜 台 测 微 尺 的 玻 片 很 薄, 在 标 定 油 镜 头 时, 要 格 外 注 意, 以 免 压 碎 镜 台 测 微 尺 或 损 坏 镜 头 2. 标 定 目 镜 测 微 尺 时 要 注 意 准 确 对 正 目 镜 测 微 尺 与 镜 台 测 微 尺 的 重 合 线 五 演 示 1. 目 镜 测 微 尺 镜 台 测 微 尺 的 显 微 镜 下 示 教 2. 标 定 及 测 量 方 法 示 范 六 实 验 报 告 1. 目 镜 测 微 尺 标 定 结 果 : 低 倍 镜 下 倍 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 是 μm

24 高 倍 镜 下 倍 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 是 μm 油 镜 下 倍 目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 是 μm 2. 菌 体 大 小 测 定 结 果 : 菌 号 均 值 大 肠 杆 菌 测 定 结 果 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 直 径 大 小 测 定 结 果 目 镜 测 微 尺 格 数 实 际 长 度 目 镜 测 微 尺 格 数 实 际 直 径 /µm 宽 长 宽 长 试 与 己 知 的 大 肠 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 大 小 作 一 比 较 是 否 一 致? 为 何? 七 问 题 和 思 考 1. 为 什 么 更 换 不 同 放 大 倍 数 的 目 镜 和 物 镜 时 必 须 重 新 用 镜 台 测 微 尺 对 目 镜 微 尺 进 行 标 定? 2. 若 目 镜 不 变, 目 镜 测 微 尺 也 不 变, 只 改 变 物 镜, 那 么 目 镜 测 微 尺 每 格 所 测 量 的 镜 台 上 的 菌 体 细 胞 的 实 际 长 度 ( 或 宽 度 ) 是 否 相 同? 为 什 么? II 微 生 物 数 量 的 测 定 细 菌 群 体 生 长 表 现 为 细 胞 数 目 的 增 加 或 细 胞 物 质 的 增 加 测 定 细 胞 数 目 的 方 法 有 显 微 镜 直 接 计 数 法 (direct microscopic count) 平 板 菌 落 计 数 法 (plate count) 光 电 比 油 法 (turbidity estimation by spectrophotometer) 最 大 或 然 数 法 (most probable number MPN) 以 及 膜 过 滤 法 (membrane filtration) 等 测 定 细 胞 物 质 的 方 法 有 细 胞 干 重 的 测 定, 细 胞 某 种 成 分 如 氮 的 含 量 RNA 和 DNA 的 含 量 测 定, 代 谢 产 物 的 测 定 等 总 之, 测 定 微 生 物 生 长 量 的 方 法 很 多, 各 有 优 缺 点, 工 作 中 应 根 据 具 体 情 况 要 求 加 以 选 择 本 实 验 主 要 介 绍 生 产 科 研 工 作 中 比 较 常 用 的 显 微 镜 直 接 计 数 法 平 板 菌 落 计 数 法 和 光 电 比 浊 计 数 法 一 显 微 镜 直 接 计 数 法 ( 一 ) 目 的 要 求 1. 明 确 血 细 胞 计 数 板 计 数 的 原 理 2. 掌 握 使 用 血 细 胞 计 数 板 进 行 微 生 物 计 数 的 方 法 ( 二 ) 基 本 原 理 显 微 镜 直 接 计 数 法 是 将 小 量 待 测 样 品 的 悬 浮 液 置 于 一 种 特 别 的 具 有 确 定 面 积 和 容 积 的 载 玻 片 上 ( 又 称 计 菌 器 ), 于 显 微 镜 下 直 接 计 数 的 一 种 简 便 快 速 直 观 的 方 法 目 前 国 内 外 常 用 的 计 菌 器 有 : 血 细 胞 计 数 板 Peteroff-Hauser 计 菌 器 以 及 Hawksley 计 菌 器 等, 它 们 都 可 用 于 酵 母 细 菌 霉 菌 孢 子 等 悬 液 的 计 数, 基 本 原 理 相 同 后 两 种 计 菌 器 由 于 盖 上 盖 玻 片 后, 总 容 积 为 0.02mm 3, 而 且 盖 玻 片 和 载 波 片 之 间 的 距 离 只 有 0.02mm, 因 此 可 用 油 浸 物 镜 对 细 菌 等 较 小 的 细 胞 进 行 观 察 和 计 数 除 了 用 这 些 计 菌 器 外, 还 有 在 显 微 镜 下 直 接 观 察 涂 片 面 积 与 视 野 面 积 之 比 的 估 算 法, 此 法 一 般 用 于 牛 乳 的 细 菌 学 检 查 显 微 镜 直 接 计 数 法 的 优 点

25 是 直 观 快 速 操 作 简 单 但 此 法 的 缺 点 是 所 测 得 的 结 果 通 常 是 死 菌 体 和 活 菌 体 的 总 和 目 前 已 有 一 些 方 法 可 以 克 服 这 一 缺 点, 如 结 合 活 菌 染 色 微 室 培 养 ( 短 时 间 ) 以 及 加 细 胞 分 裂 抑 制 剂 等 方 法 来 达 到 只 计 数 活 菌 体 的 目 的 本 实 验 以 血 球 计 数 板 为 例 进 行 显 微 镜 直 接 计 数 另 外 两 种 计 菌 器 的 使 用 方 法 可 参 看 各 厂 商 的 说 明 书 用 血 细 胞 计 数 板 在 显 微 镜 下 直 接 计 数 是 一 种 常 用 的 微 生 物 计 数 方 法 该 计 数 板 是 一 块 特 制 的 载 玻 片, 其 上 由 四 条 槽 构 成 三 个 平 台 ; 中 间 较 宽 的 平 台 又 被 一 短 横 槽 隔 成 两 半, 每 一 边 的 平 台 上 各 列 有 一 个 方 格 网, 每 个 方 格 网 共 分 为 九 个 大 方 格, 中 间 的 大 方 格 即 为 计 数 室 血 细 胞 计 数 板 构 造 如 图 l5-1 计 数 室 的 刻 度 一 般 有 两 种 规 格, 一 种 是 一 个 大 方 格 分 成 25 个 中 方 格, 而 每 个 中 方 格 又 分 成 16 个 小 方 格 ( 图 15 2); 另 一 种 是 一 个 大 方 格 分 成 16 个 中 方 格, 而 每 个 中 方 格 又 分 成 25 个 小 方 格, 但 无 论 是 哪 一 种 规 格 的 计 数 板, 每 一 个 大 方 格 中 的 小 方 格 都 是 400 个 每 一 个 大 方 格 边 长 为 lmm, 则 每 一 个 大 方 格 的 面 积 为 lmm 2, 盖 上 盖 玻 片 后, 盖 玻 片 与 载 玻 片 之 间 的 高 度 为 0.lmm, 所 以 计 数 室 的 容 积 为 0.lmm 3 ( 万 分 之 一 毫 升 ) 图 15 1 血 细 胞 计 数 板 构 造 ( 一 ) 图 15 2 血 细 胞 计 数 板 构 造 ( 二 ) A. 正 面 图 ;B. 纵 切 面 图 ; 放 大 后 的 方 格 网, 中 间 大 方 格 为 计 数 室 1. 血 细 胞 计 数 板 ;2. 盖 玻 片 ;3. 计 数 室 计 数 时, 通 常 数 五 个 中 方 格 的 总 菌 数, 然 后 求 得 每 个 中 方 格 的 平 均 值, 再 乘 上 25 或 16, 就 得 出 一 个 大 方 格 中 的 总 菌 数, 然 后 再 换 算 成 lml 菌 液 中 的 总 菌 数 设 五 个 中 方 格 中 的 总 菌 数 为 A, 菌 液 稀 释 倍 数 为 B, 如 果 是 25 个 中 方 格 的 计 数 板, 则 1mL 菌 液 中 的 总 菌 数 =A/ B=50000A B( 个 ) 同 理, 如 果 是 16 个 中 方 格 的 计 数 板, 1mL 菌 液 中 的 总 菌 数 =A/ B=32000A B( 个 ) ( 三 ) 器 材 1. 菌 种 酿 酒 酵 母 2. 仪 器 或 其 他 用 具 血 细 胞 计 数 板, 显 微 镜, 盖 玻 片, 无 菌 毛 细 滴 管 ( 四 ) 操 作 步 骤 l. 菌 悬 液 制 备 以 无 菌 生 理 盐 水 将 酿 酒 酵 母 制 成 浓 度 适 当 的 菌 悬 液 2. 镜 检 计 数 室 在 加 样 前, 先 对 计 数 板 的 计 数 室 进 行 镜 检 若 有 污 物, 则 需 清 洗, 吹 干 后 才 能 进 行 计 数 3. 加 样 品 将 清 洁 干 燥 的 血 细 胞 计 数 板 盖 上 盖 玻 片, 再 用 无 菌 的 毛 细 滴 管 将 摇 匀 的 酿 酒 酵 母 菌 悬 液 由 盖 玻 片 边 缘 滴 一 小 滴, 让 菌 液 沿 缝 隙 靠 毛 细 渗 透 作 用 自 动 进 入 计 数 室, 一 般 计 数 室 均 能 充 满 菌 液 取 样 时 先 要 摇 匀 菌 液 ; 加 样 时 计 数 室 不 可 有 气 泡 产 生 4. 显 微 镜 计 数 加 样 后 静 止 5min, 然 后 将 血 细 胞 计 数 板 置 于 显 微 镜 载 物 台 上, 先 用 低 倍 镜 找 到 计 数 室 所 在 位 置, 然 后 换 成 高 倍 镜 进 行 计 数 调 节 显 微 镜 光 线 的 强 弱 适 当, 对 于 用 反 光 镜 采 光 的 显 微 镜 还 要 注 意 光 线 不 要 偏 向 一 边,

26 否 则 视 野 中 不 易 舌 清 楚 计 数 室 方 格 线, 或 只 见 竖 线 或 只 见 横 线 在 计 数 前 若 发 现 菌 液 太 浓 或 太 稀, 需 重 新 调 节 稀 释 度 后 再 计 数 一 般 样 品 稀 释 度 要 求 每 小 格 内 约 有 5~10 个 菌 体 为 宜 每 个 计 数 室 选 5 个 中 格 ( 可 选 4 个 角 和 中 央 的 一 个 中 格 ) 中 的 菌 体 进 行 计 数 位 于 格 线 上 的 菌 体 一 般 只 数 上 方 和 右 边 线 上 的 如 遇 酵 母 出 芽, 芽 体 大 小 达 到 母 细 胞 的 一 半 时, 即 作 为 两 个 菌 体 计 数 计 数 一 个 样 品 要 从 两 个 计 数 室 中 计 得 的 平 均 数 值 来 计 算 样 品 的 含 菌 量 5. 清 洗 血 细 胞 计 数 板 使 用 完 毕 后, 将 血 细 胞 计 数 板 在 水 龙 头 用 水 冲 洗 干 净, 切 勿 用 硬 物 洗 刷, 洗 完 后 自 行 晾 干 或 用 吹 风 机 吹 干 镜 检, 观 察 每 小 格 内 是 否 有 残 留 菌 体 或 其 他 沉 淀 物 若 不 干 净, 则 必 须 重 复 洗 涤 至 干 净 为 止 ( 五 ) 实 验 报 告 l. 结 果 将 结 果 记 录 于 下 表 中 A 表 示 五 个 中 方 格 中 的 总 菌 数 ;B 表 示 菌 液 稀 释 倍 数 第 一 室 各 中 格 中 菌 数 A B 二 室 平 均 值 菌 数 /ml 第 二 室 2. 思 考 题 (1) 根 据 你 的 体 会, 说 明 用 血 细 胞 计 数 板 计 数 的 误 差 主 要 来 自 哪 些 方 面? 应 如 何 尽 量 减 少 误 差. 力 求 准 确? (2) 某 单 位 要 求 知 道 一 种 干 酵 母 粉 中 的 活 菌 存 活 率, 请 设 计 1~2 种 可 行 的 检 测 方 法