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1 中国农业科学 猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养 吴中红 邢凤英 刘国世 曾申明 朱士恩 张忠诚 伏彭辉 中国农业大学动物科技学院 北京 摘要 主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系 用不同场强! 脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞 结果表明 在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 # Λ 其囊胚发育率为? Π 多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 Π 孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 发现 不换液与第 天换液和第 天换含 胎牛血清的培养液其囊胚发育率 分别为?!? 和? 无显著差异 Π 后两者换液培养方式其囊胚细胞数?!? 明显低于不换液的? Π 同时发现低氧 Β Β 气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 的空气 无明显差别 分别为?!? 和?!? Π 表明激活后第 天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数 低氧 Β Β 气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 的空气 好 关键词 猪 卵母细胞 体外培养 电激活 胚胎培养 2 ƒ ƒ 2 (Χολλεγε οφ Ανι μ αλ Σχιενχε ανδ Τεχηνολογψ, Χηινα Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ ) ιν ϖιτρο 2 2 # Λ? Π Π ιν ϖιτρο? ƒ? 2? Π?? 2 2? Π Β Β???? Π ƒ 收稿日期 22 基金项目 国家自然科学基金 和香港 生物技术研究发展中心资助项目作者简介 吴中红 2 女 甘肃静宁人 讲师 博士研究生 主要从事胚胎生物技术和家畜环境科学的科研! 教学工作 曾申明为本文通讯作者 2 2

2 中国农业科学 卷 ιν ϖιτρο 猪体细胞核移植技术在畜牧生产中可加速猪遗传改良 培育生长速度快! 肉质优良的猪种 提高养猪生产的经济效益 在医学上 利用克隆转基因技术生产经遗传修饰的克隆猪 提供移植器官 以补充人类移植器官的严重不足 这是猪体细胞核移植技术的重要意义之一 目前体细胞核移植技术已在牛! 绵羊! 山羊! 小 鼠! 猪等许多动物上取得成功 但动物体细胞核移植效率仍很低 出生的正常后代不足操作胚胎的 而猪的体细胞核移植技术更难 其核移植的效率则更低 出生活仔数与移植胚的比率仅 为 左右 我国目前还不能成功地克隆猪 相关研究也很少 有很多因素影响核移植胚的发育 其中一重要环节就是受体卵母细胞的激活 激活处理对胚胎的后期发育非常关键 这也是猪体细胞核移植技术所 要解决的难点之一 等采用一次移植方法未能成功 推测可能是其所用激活刺激尚不足以支持胚胎的全程发育 才用两次核移植方法得到克隆猪 卵母细胞的激活有许多方法 如用电激活! 钙离子载体! 乙醇! 蛋白酶合成抑制剂等 其中电激活是应用最多! 也很有效的方法 电激活时由于所用仪器型号和各实验室条件不同 激活条件也各不相同 早期胚胎的体外培养也直接影响胚胎的后期发育 目前猪早期胚胎体外培养的研究落后于牛! 羊 等 所用培养液和气体环境有多种 现有的研究结果表明 比较适合于猪早期胚胎的 体外培养 几例成功得到克隆猪的试验所用胚胎培养液均为 本试验的目的是探索猪体外成熟卵母细胞的最佳电激活条件 场强! 脉冲时程和脉冲次数 并用 为培养液 比较不同培养方法和气体环境对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响 建立猪胚胎的高效培养体系 1 材料与方法 1 1 卵母细胞的采集和体外培养从屠宰场收集猪卵巢 保存在 ε 生理盐水中 内运回实验室 用生理盐水清洗卵巢 后用 针头的注射器抽取 卵泡中的卵子 内抽完 抽取液放入 尖底离心管 置于 ε 水浴槽中 待卵子沉降后 用 2 洗 次 挑选有多层完整卵丘细胞的卵子 用成熟培养液洗涤 次后进行成熟培养 成熟培养液用 2 加 猪卵泡液! # 半胱氨酸! # ƒ! #! # 在其中培养 后 移入无 和 的培养液中继续培养 卵母细胞培养用 塑料平皿或四孔细胞培养板 平皿培养时 每滴 Λ 培养液中放入 个卵子 上盖矿物油 四孔培养板培养时 每孔培养液 Λ 每孔 个卵子 培养条件为 的空气! 湿度 温度为 ε 1 2 卵子的孤雌激活培养 后将卵子移入 透明质酸酶中震荡 或放入 2 中用移液枪头吹打脱去颗粒细胞 之后用无钙 2 洗涤 电激活电激活所用电融合仪型号为 2 ƒ 激活液为 # 甘露醇 # # 电激小室两平行电极间距离为 取待用卵子放入激活液中平衡片刻 将其移入电融合仪小室 之后立即施加不同电场强度和脉冲时程组合的直流脉冲 次 场强分别为!!!!!!! 和 # 脉冲时程为 Λ 必要时添加!!!! Λ 施加多次脉冲时其间隔时间为 激活后立即将卵子移入含 Λ # 细胞松弛素 和 Λ # 放线菌酮的 # 中清洗 在此液中培养 之后移入无细胞松弛素 和放线菌酮的 # 中 激活情况评定激活后 取部分卵子压片 用醋酸 Β 乙醇 Β 液固定 再用 醋酸地衣红染色 观察原核形成情况 1 3 卵子激活后的培养激活后卵子移入 # 中 Λ 小滴培养 每滴 枚胚胎 上盖矿物油 培养条件为 的空气! 湿度 温度为 ε 记录卵裂数 第! 天观察囊胚发育情况 记录囊胚数 胚胎培养气体环境分两种 的空气和 Β Β 的混合气 的空气中培养的胚胎又分为第 天不

3 期 吴中红等 猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养 换液! 换 ƒ 和换 # 种处理 囊胚用 染色 压片 在荧光显微镜下统计囊胚细胞数 1 4 数据分析为降低季节! 材料来源和试验批次间误差造成的影响 本研究中同一表格内试验数据均为在同一季节! 相同卵巢来源和试验条件下所得 试验数据用 分析 2 结果与分析 2 1 不同场强! 脉冲时程及脉冲次数的激活效果场强和脉冲组合为 即场强 #! 脉冲时程 Λ! 次脉冲!! 时 胚胎卵裂率和囊胚率差异均不显著 但 的囊胚率高于后两者 表明! 强度偏高 优于前两者 表 降低场强!! 和 相比 其胚胎卵裂率和囊胚率差异也不显著 但 囊胚率最高 表 表明场强 #! # 仍偏高 之后扩大场强与脉冲时程的组合 表 可看出 的处理其囊胚率最高 场强 #! 脉冲时程 Λ 这一范围内 囊胚率较高 不同处理其囊胚细胞数无明显差异 Π 表 从表 至表 可推出 的处理囊胚率最高 为本试验条件下电激活的最佳条件 表 1 不同场强对猪体外成熟卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响 ιν ϖιτρο 场强 脉冲时程 脉冲次数 # Λ 次 ƒ 卵裂率 囊胚率?????? 表内同列字母相同者差异不显著 Π 下同? Π 表 2 不同场强对猪体外成熟卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响 ιν ϖιτρο 场强 脉冲时程 脉冲次数 # Λ 次 ƒ 卵裂率 囊胚率???????? 表 3 不同场强和不同脉冲时程对猪体外成熟卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响 1 ιν ϖιτρο 场强 脉冲时程 脉冲次数 # Λ 次 ƒ 卵裂率 囊胚率 囊胚细胞数????????????????????????????????? 括号内为所计囊胚数 下同

4 中国农业科学 卷 不同脉冲次数其囊胚发育率差异不显著 脉冲次数 次! 次! 的处理其囊胚率低于 次脉冲的处理 囊胚率也不比 其它 次脉冲的处理高!!! 表 由此看出 多次脉冲刺激并不优于 次脉冲刺激 表 4 不同脉冲次数和不同脉冲时程对猪体外成熟卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响 2 ιν ϖιτρο 场强 脉冲时程 脉冲次数 # Λ 次 ƒ 卵裂率 囊胚率 囊胚细胞数???????????????????????? 表内同列有相同字母者差异不显著 Π 否则 则差异极显著 Π 下同? Π 2 2 不同的换液方式和气体环境对胚胎的影响胚胎培养第 天不换液和换原培养液! 换 2 ƒ 相比 其囊胚发育率差异不显著 换原培养液的略高于不换液的 换 ƒ 的囊胚率最低 Π 表 混合气培养胚胎其囊胚率也与上述 种处理无显著差异 其囊胚率低于不换液和换原培养液的处理 不换液的胚胎囊胚细胞数明显高于换原培养液和换 ƒ 的胚胎 Π 但与混合气培养的无 差异 Π 两种换液处理间囊胚细胞数无差异 换原培养液的与混合气培养的囊胚细胞数也无差异 但换 ƒ 的胚胎囊胚细胞数显著低于混合气培养的胚胎 Π 由此看出 第 天换 ƒ 和混合气培养并不比不换液的和 的空气培养的效果好 第 天换原培养液的其囊胚率略高于不换液的 但其囊胚细胞数却显著低于不换液的 因此 的空气培养! 不换液为最佳培养条件 表 5 不同的气体环境和培养方式对猪胚胎发育的影响 培养体系 卵裂率 囊胚率 囊胚细胞数 空气不换液??? 第 天换 #?? # 第 天换 ƒ?? ƒ 混合气不换液??? 本表中胚胎培养液在未注明时均为 # # 3 讨论 本试验结果 表 表明 单次脉冲! 场强在 #! 脉冲时程在 Λ 之间囊胚发育率差别不大 场强 #! 脉冲 Λ 囊胚发育率较高 #! Λ 的处理囊胚发育率最高 从他人研究结果看 用 次脉冲

5 期 吴中红等 猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养 激活猪卵母细胞时各试验所用场强和脉冲时程各不 相同 等孤雌激活试验结果认为 # Λ 接近最佳条件 和 等激活核移植卵母细胞时分别用 # Λ 和 # Λ 等发现激活核移植卵母细胞用 # Λ 的脉冲其囊胚发育率高于 # Λ 另外 有人在核移植卵 母细胞的激活和孤雌激活试验中都用 # Λ 的脉冲 从以上试验可看出 单次脉冲激活时其场强常用范围为 # 本试验最佳处理为 # Λ 单次和多次脉冲对猪卵母细胞激活效果的研究 结果也不一致 等发现体内成熟卵母细胞孤雌激活时用 次强脉冲 # Λ 刺激比用多次较弱脉冲 # Λ 刺激卵母细胞更容易分裂 其囊胚发育率也高 他们得到的克隆猪就是用上述 次脉冲激活 等认为 从卵母细胞孤雌激活发育至囊胚的能力看 间隔半小时的 次脉冲 对体内成熟的卵有益 但对体外成熟的卵有害 本试验结果与上述结果相似 即用多次脉冲刺激其囊胚发育率并不比 次脉 冲刺激高 等用 次核移植方法未能成功 他们激活对照卵母细胞和 次核移植胚时都用两次脉冲刺激 分别为 # Λ 和 # Λ 他们猜测可能是目前的激活刺激还不足以支持胚胎的全程发育 而用 次核移植方法得到克隆猪 即先将体细胞移入去核 卵母细胞 融合形成原核后 再将原核移入另一去掉原核的受精卵 再用电融合 让其发育 他们认为 次核移植不完全依赖目前所用的人工激活处理 认为 次脉冲 # Λ 效果最好 对猪卵母细胞孤雌激活研究中发现每隔 次的 次单独脉冲并不比单独 次脉冲好 但隔 次的 次电脉冲不仅类似受精开始后 变化 而且明显对诱发激活后的发育有好处 但他评价激活发育时仅以卵裂率作为衡量指标 2 也仅用 次脉冲 # Λ 有效地激活体外成熟卵 移植后有很高比例发育至第 天 即肢芽形成阶段 因此 他们认为试验中所用激活条件适合于卵子生存和保持其发育潜能 总之 有关 次和多次脉冲对激活的不同影响及多次脉冲间的最佳间隔时间问题还有待进一步探讨 等将核移植胚培养 后换入含 ƒ 的 培养 等将体外受精胚胎在 加 中培养 第 也换入含 ƒ 的 但本试验中 换含 ƒ 的 效果并不好 其囊胚发育率低于不换液和换原液的 Π 其囊胚细胞数也明显的少于不换液的 Π 这可能与血清质量有很大关系 用不同型号和批次的血清其结果会有所变化 本试验 Β Β 混合气中囊胚发育率及囊胚细胞数都略低于 的空气中 两者间无显著差异 Π 等发现体内冲出的胚胎培养在 空气其滋养层细胞核数和总的细胞核数明显高于混合气中 Β Β 培养的胚胎 本试验结果与此结果 一致 相反 等发现培养在 的空气中和 Β Β 的混合气中的体内冲出胚胎其 的囊胚发育率无差别 但体外成熟卵孤雌激活后其囊胚发育率在混合气中的明显高于在 空气中的 这种差别可能与各实验室具体试验操作和气体质量不同有关 2 2 Σχιενχε 2 Σχιενχε 2 Βιο. Ρε προ Νατυρε Νατυρε 2 2 Νατυρε Βιοτεχηνολογψ ƒ 2 ƒ 2 Νατυρε

6 中国农业科学 卷 ƒ Σχιενχε 2 Νατυρε ƒ ƒ 2 ιν ϖιτρο Να2 τυρε Βιοτεχηνολογψ 2 Τηεριογενολογψ Τηεριογενολογψ Ιν ϖιτρο Τηερι2 ογενολογψ 2 ιν ϖιτρο. Τηεριογενολογψ ιν ϖιτρο ιν ϖιϖο. Βιο. Ρεπρο 2 Τηεριογενολογψ 2 2 Τηερι2 ογενολογψ 2 Τηεριογενολογψ Ιν ϖιτρο Βιο. Ρε προδ 2 2 ιν ϖιτρο2 2 Τηεριογενολογψ ιν ϖιϖο2 ιν ϖιτρο2 Ρεπρο. Φερτιλ. Δεϖ 2 2 Τηεριογενολογψ ƒ ιν ϖιτρο. Ανι. Ρεπρο. Σχι

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浙 江大 学 学 报 农业与生命科学版 42 4 AVG 处理的大豆叶片 CO2 饱和点 RuBP 最大 再生 速 率 羧 化 效 率 均 显 著 高 于 对 照 P 0畅05 而 3 个 ACC 处理的大豆叶片 CO2 饱和 点 RuBP 最大再生速率 羧化效率均低于对照 因此 AVG 处理有利于提高大豆叶片 CO2 浓度 的可利用范围 从而有利于改善大豆的光合性 能 而 ACC 的处理效果与 AVG

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