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1 第 30 卷第 3 期 011 年 6 月 华中农业大学学报 JnaHazhngAgaUnvy V.30 N.3 Jn011,80~84 猪卵母细胞体外成熟的影响因素 华再东 1 郑新民 魏庆信 许厚强 1 刘西梅 李莉 1. 贵州大学动物科学学院 / 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 55005;. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 / 动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室, 武汉 摘要通过采集屠宰场废弃猪卵巢, 体外分离和培养猪卵母细胞, 探讨基础培养基 激素 卵泡直径大小及卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟的影响 结果表明 : 改良 TCM199(mTCM199) 较 NCSU3 培养猪卵母细胞成熟率显著提高 (P<0.05); 基础培养基中添加 PMSG hcg 和 pff, 卵母细胞体外成熟率 (80.63%) 显著高于仅添加其中一种 ; 从卵泡直径 3~6mm 和大于 6 mm 卵泡获得的卵丘卵母细胞复合体 (COC), 其体外培养成熟率 (83.33% 和 76.43%) 极显著高于卵泡直径在 3 mm 以下获得的 COC 成熟率 (30.94%); 根据卵丘细胞层数把 COC 分为 A B C3 级, 其中 A 级和 B 级卵母细胞成熟率差异不显著, 但都极显著高于 C 级卵母细胞的成熟率 关键词猪 ; 卵母细胞 ; 体外成熟 ; 卵丘卵母细胞复合体中图分类号 S814.8 文献标识码 A 文章编号 (011) 猪体细胞核移植 (SCNT) 以及孤雌激活 (PA) 资料 等现代胚胎生物技术为开展抗病育种 提高肉质 生产转基因或者基因组修饰猪 建立人类疾病模型以 1 材料与方法 及生物学基础研究诸多方面的探索提供了强大的技 1.1 材 料 术支撑 而猪卵母细胞体外成熟 (IVM) 是体外受精技术 (IVF) 胞浆单精子注射 (ICSI) 和 SCNT 技 [1] 术等成功与否的关键 相对猪体内成熟的卵母细胞来说,IVM 的卵母细胞来源丰富, 价格低廉, 因而已成为 IVF SCNT 研究的主流 在克隆胚的发育能力上, 体内成熟的卵母细胞要优于体外成熟的卵 [3] 母细胞, 成功率高 如何优化猪卵母细胞体外成熟体系, 使得卵母细胞核 质同步成熟, 获得较强的发育能力, 成为当 [4] 今亟需解决的问题 然而, 猪卵母细胞的成熟是 [5] 一个复杂的生理过程, 主要包括细胞核和细胞质的变化, 同时又是一个受多因素调节的过程, 严格依 洗卵液 (DPBS) 购自 Gb 公司, 孕马血清促性腺激素 (PMSG) 人绒毛膜促性腺激素 (hcg) 是宁波激素制品厂生产, 其他试剂如未特别注明, 均购自 Sgma 公司 (S.L,MO,USA) 卵母细胞体外培养基为改良 TCM199 (mtcm199), 其成分为 3.05 mm/l 葡萄糖 0.91 mm/l 丙酮酸钠 0.57 mm/l L 半胱氨酸 1mm/LL 谷氨酰胺 10ng/mL 表皮生长因子 (EGF) 10 IU/mL hcg 10 IU/mL PMSG 75 μg/ml 青霉素 50μg/mL 硫酸链霉素 10% pff; NCSU3 [7] ;DPBS; 脱卵液 (0.1% 透明质酸酶的 DPBS) [6] 赖其生长的卵泡环境 1. 方 法 本试验旨在通过研究猪卵母细胞体外成熟的主要影响因素, 旨在为体细胞核移植提供大量优质的第 次减数分裂中期 (M Ⅱ ) 卵母细胞提供基础 1) 猪卵母细胞的采集和体外成熟培养 猪卵巢采自当地屠宰场, 置于盛有 8~37 生理盐水 ( 分别含青 链霉素 0 万 IU/L 和 15 万 IU/L) 的保温 收稿日期 : 基金项目 : 国家生物新品种培育专项 (008ZX ;008ZX ;008ZX ;008ZX ;009ZX B); 国际合作项目 (009BFA01) 华再东, 博士研究生. 研究方向 : 细胞分子生物学.Ema:hazadng13@yah.m.n 通讯作者 : 许厚强, 教授. 研究方向 : 动物生物技术.Ema:hqg054@yah.m; 郑新民, 研究员. 研究方向 : 动物生物技术.Ema:b0@163.m

2 第3期 81 华再东 等:猪卵母细胞体外成熟的影响因素 瓶内, h 内 送 回 实 验 室,用 适 量 生 理 盐 水 ( 8~ ) ( 冲洗 遍, 采 用 注 射 器 37 3~5 10 ml 16 号 针 的成熟率 同时制备 pff,为后续实验所用 )实 验 :基 础 培 养 基 中 添 加 PMSG hcg 和 头)抽吸卵泡,卵泡 液 置 于 37 水 浴 保 温 的 50 ml pff 对卵母细胞体外成熟 的 效 果 的 比 较 将 COC 离心管中,静置 15~0 m n,弃 上 清 液,实 体 显 微 镜 分成 4 组 进 行,第 1 组 在 mtcm199 中 添 加 10 下观察,捡取卵丘 卵 母 细 胞 复 合 体 ( COC),转 移 到 IU/mLPMSG,第 组添加10IU/mLhCG,第3 组 DPBS 液滴中,冲洗3 遍,再用IVM 培养基洗涤3~ 添加 10% pff,第 4 组以上 3 种物质都添加 体外 培养 44h 后比较其成熟率 5 遍 [ 8] 卵母细胞的成 熟 培 养 采 用 微 滴 法,于 39 3)实验 3:不同卵泡直径获得 COC在体外培养 100% 湿度 5% CO 培养箱中培养 44h 后于倒置显 的成熟率 的 比 较 分 别 抽 吸 直 径 为 3~6 mm 大 于 微镜下观察卵丘细 胞 扩 散 状 态,将 扩 散 良 好 的 卵 母 6mm和 3 mm 以 下 卵 泡,将 COC 分 别 培 养 在 细胞移入 0. 1% 的 透 明 质 酸 酶 中,反 复 吹 打 去 除 颗 10IU/mL PMSG+10IU/mLhCG+ 粒细胞,用 DPBS 洗 卵 液 清 洗 ~3 次,统 计 排 出 第 10% pff 中, 44h 后观察卵母细胞的成熟率 一极体 的 卵 母 细 胞 数 量,计 算 卵 母 细 胞 的 成 熟 率 4)实验 4:卵 丘 细 胞 的 层 数 对 卵 母 细 胞 体 外 成 (图 1,图 ) 熟率的比较 根据包裹卵丘细胞层数将卵母细胞分 A B C( A 级:包 裹 5 层 以 上 卵 丘 细 胞,B 级:包 裹 3~5层卵丘细胞, C:包 裹 3 层 以 下 卵 丘 细 胞) 3 级, 将 获 得 的 COC 培 养 在 10IU/mL PMSG+10IU/mLhCG+10% pff 中, 44h 后 比 较其成熟率 析 图 1 成熟卵丘卵母细胞复合体 F 1 Cm y mp x g. 试验结果用卡 方 ( χ )检 验,进 行 差 异 显 著 性 分 结果与分析.1 种基础培养基对卵母细胞体外成熟的影响 从表 1 可以看 出,使 用 mtcm199 培 养 的 卵 母 细胞 成 熟 率 ( 7.9% )显 著 高 于 NCSU3 ( %, P<0. 05) 结果显示 mtcm199 更 适 于 猪卵母细胞的体外 成 熟 培 养,将 其 作 为 后 续 实 验 的 基础培养基 表 1 mtcm199 和 NCSU 3 种培养基对 图 去掉颗粒细胞的卵母细胞 F Ma y mvdg a g. )猪卵泡液( pff)制备 抽取卵巢上 3~8 mm 直径的 卵 泡,将 抽 取 液 放 入 离 心 管 中 离 心 ( 1600 /m n) 0 m n,取 上 清 液 于 超 净 工 作 台 内,以 0. 5 ml 离 心 管 中,0 μm 滤膜过滤后分 装 于 0. 冷冻保存备用 1.3 试验设计与数据分析 1)试验 1:mTCM199 和 NCSU3 两 种 培 养 基 对猪卵母细胞体外成熟效果的比较 将 COC分别 培养在 mtcm199 和 NCSU3 培 养 基 中, 44h 后 统计排出第一极体 的 卵 母 细 胞 数 量,计 算 卵 母 细 胞 猪卵母细胞体外成熟效果的比较1) Tab 1 E d n m d m COC n nv ma y B 级以上 COC数 N. v Bd C md m abv COC 培养基 mtcm199 NCSU3 60( 8) 60( 8) 第一极体 排出数 体外成熟率/% Ma a ±3. 56a N. pbⅠ ±3. 8b 1)同列数据字母相同者表示 差 异 不 显 著( P>0. 05);不 同 小 写 字母者表示差异显著( P<0. 05),括号中数字为重复次数;下 表 同 W h n h am mn, h amva a n g n n ( P>0. 05);va w hd n p yd a n ( P <0. 05).Nmb npa p gn yd n h hw h p v m. Th ama b w.

3 8 华中农业大学学报第 30 卷. PMSG hcg 及 pff 对猪卵母细胞体外成熟的 影响 从表 可以看出, 在基础培养基中仅添加 PMSG hcg 或 pff, 其卵母细胞体外成熟率明显低 于 10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+ 10% pff 组 (P<0.05), 表明 PMSG hcg 和 pff 在 猪卵母细胞体外成熟过程中是非常必要的 表 基础培养基中添加不同激素对 卵母细胞体外成熟的影响 Tab Ednhmnmpnn 成熟培养基组成 Cmdm mpn 10IU/mLPMSG 10IU/mLhCG mdmnnv may 卵母细胞数 N.COC N.pbⅠ 体外成熟率 /% Maa 83(5) ±5.65a 76(5) ±5.43a 10% pff 80(5) ±8.17a 10IU/mLPMSG+ 10IU/mLhCG+ 10% pff 60(8) ±3.54b.3 卵泡直径大小对卵母细胞体外成熟的影响 从表 3 可以看出试验组 Ⅰ(>6 mm) 获得的卵 母细胞体外成熟率最高, 但与试验组 Ⅱ(3~6 mm) 差异不显著 (P>0.05), 二者与试验组 Ⅲ(<3 mm) 的成熟率差异极显著 (P<0.01) 表 3 卵泡直径大小对猪卵母细胞体外成熟的影响 1) 组别 Gp Tab3 Ednz 培养数 N.COC nnv maay N.pbⅠ 体外成熟率 /% Maa >6mm 35(8) ±4.19A 3~6mm 45(6) ±3.07A <3mm 40(8) ±6.9B 1) 同列数据字母相同者表示差异不显著 (P>0.05); 大写字母不 同者表示差异显著 (P<0.01), 下表同.Whnhammn,h amvagnydn(p>0.05);vawhdnavygnydn(p<0.01).thama bw..4 卵丘细胞包裹层数对猪卵母细胞成熟的影响 从表 4 结果可见,A 级与 C 级卵丘扩展率差 异显著 (P<0.05),A 级和 B 级在极体排出率上极 显著高于 C 级 (P<0.01), 说明包裹 3 层以上卵丘 颗粒细胞的卵母细胞更适合体外培养, 成熟率更 高 COC 分级 COCv 表 4 COC 分级对猪卵母细胞成熟的影响 Tab4 EdngadCOCnnv may COC 数 N.COC 卵丘扩散数 N.padCOC 扩散率 /% Spada N.pbⅠ 成熟率 /% Maa A 级 GadA 71(7) ±0.88A ±5.89A B 级 GadB 80(6) ±0.67A ±5.97A C 级 GadC 46(8) ±0.58B ±6.56B 3 讨论 mtcm199 和 NCSU3 是当前应用最广, 也是 猪卵母细胞体外培养最有效的 种基础培养基 [9] 本试验采用 mtcm199 和 NCSU3 培养基, 结果 发现前者培养卵母细胞的成熟率显著高于后者 该 [10] 结果和潘登科等人的研究不一致 ; 但与王海等 [11] [1] 人和徐小明等人的相同 本试验结果表明, 使用 NCSU3 为培养基的猪卵母细胞体外成熟效 果较差, 究其原因可能是因为 NCSU3 配方相对 复杂, 称量产生误差, 溶液配比中缺乏蛋白质组分, 不能完全提供卵母细胞成熟过程所需的营养成分, 从而不能使卵母细胞核成熟的缘故 促性腺激素在卵母细胞成熟启动中发挥重要作 用,PMSG 和 hcg 是成熟培养基中使用较多的促性 腺激素 在 10IU/mL PMSG+10 IU/mLhCG+10% pff 组卵母细胞体外成熟率显 著高于其他 3 组, 说明激素和 pff 对卵母细胞体外 成熟有促进作用 有些研究者认为猪卵母细胞体外 培养的前 4h 添加 PMSG 和 hcg, 后 4h 去除所 有激素, 不仅能提高卵母细胞的成熟率, 而且成熟卵 母细胞的质量也高, 受精和发育更正常 [13] 本研究 结果表明 PMSG 和 hcg 试验组的卵母细胞体外培 养成熟率要显著高于不含 PMSG 或者 hcg 组, 表 明促性腺激素对卵母细胞体外成熟培养是非常必 要的 pff 的成分极为复杂, 含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子 有关 pff 对猪卵母细胞成熟及发育的影响, 不同学者报 道的结果不太一致 [1415], 可能与 pff 所含的因子随

4 第 3 期华再东等 : 猪卵母细胞体外成熟的影响因素 83 机体内分泌状态的变化而变化有关 此外有报道认为从不同直径卵泡获得的卵泡液也影响卵母细胞的 [16] 核成熟和发育 因此不同批次制备的卵泡液对猪卵母细胞成熟效果也可能不稳定, 所以本试验使用来自于同一批制备的 pff, 发现母细胞的体外成熟系统中添加 10% 卵泡液对卵丘细胞的扩散 卵母细胞的成熟具有良好的作用 猪卵母细胞的体外成熟与 COC 的卵泡大小有关 卵巢上卵泡在体内正常的生理条件下, 是卵母细胞发生 生长和最后成熟的微环境 卵泡的发育调节着卵母细胞的成熟, 卵泡发育早期的卵母细胞不具备恢复减数分裂的能力 随着卵泡的发育, 当其直径增加到一定大小时, 卵母细胞才具备这种能力 根据相关研究, 猪卵泡直径只有达到 mm 以上, 其卵母细胞才具备体外成熟的能力, 小卵泡中的 [17] 卵母细胞缺乏进一步发育所需的相关因子 本试验结果显示, 在猪卵母细胞体外成熟中, 卵泡直径 3~6mm 和大于 6 mm 的卵泡获得的 COC 体外培养成熟率极显著高于卵泡直径在 3 mm 以下 COC 的成熟率, 大卵泡与中等卵泡获得的卵母细胞体外成熟率无显著差异 ; 小卵泡获得的卵母细胞体外成熟率较低, 不适合于体外成熟培养 对不同分级的猪卵母细胞体外培养,A 级与 B 级成熟率无显著差异, 但明显高于 C 级, 说明 COC 中卵丘层对卵母细胞成熟有明显影响,A 级与 B 级卵母细胞更适合体外培养, 且成熟率更高 有研究报道, 猪卵母细胞的体外成熟伴随卵丘细胞的扩散, 扩散的卵丘细胞能够调节诸如氨基酸 核苷酸 磷脂酸 激素 蛋白质等物质在卵母细胞内外的进出, 诱导卵母细胞排出有害因子, 从而有效地抑制卵母细 [1819] 胞的退化 卵母细胞在生长发育中所释放的生长因子对卵丘细胞的生长也有一定的促进作用, 卵母细胞与卵丘细胞的这种相互作用使得两者共同发育生长, 最终促进了卵母细胞的成熟 [3] POLEJAEVAIA,CHENS H,VAUGHT T D,a.Cnd pgpddbynamadma[j]. Na,000,407:8690. [4] NIEMANN H,RATH D,WRENZYCKIC.Advnbhngy:nwnpgpdnag dbmdn[j].rpd DmAnm,003,38():8 89. [5] 霍道坦, 陶勇, 王勇, 等. 猪胎儿卵母细胞发生早期的细胞凋亡变化 [J]. 华中农业大学学报,010,9(1):7174. [6] KRISHER R L,BRAD A M,HERRICKJR,a.Cmpaavaymabmdvabynpnydngnv ma[j].anma Rpdn Sn, 007,98(1):796. [7] PETTERSR M,WELLSK D.Cpgmby [J].J RpdFSpp,1993,48:6173. [8] TALBOT P,DICARLANTONIO G.Uapmynvngadhnvyypnd hyda[j].dvb,1984,103(1): [9] FUNAHASHIH,DAY B N.Advnnv pdn pgmby[j].rpdfspp,1997,5:7183. [10] 张运海. 利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究 [D]. 北京 : 中国农业大学生命科学学院,006. [11] 王海, 曾申明, 朱士恩, 等. 培养介质 卵丘细胞和卵泡直径对猪卵母细胞体外成熟的影响 [J]. 中国畜牧杂志,00,38(5): [1] 徐小明, 杨春荣, 胡军和, 等. 猪卵母细胞体外成熟及电激活后发育能力的研究 [J]. 自然科学进展,006,16(3): [13]DELOSREYES M,LAPIERRE L,SAENZL,a.E hnhhhmnappmnnnv maa npny[j].thgngy,001,55(1): [14]YOON K W,SHINTY,PARKJI,a.Dvpmnpṟ nym pvaydnza man mdappmnd whad[j]. RpdFDv,000,1(4): [15]TATEMOTO H,MUTO N,SUNAGAWAI,a.Pn pnyagdamagad by xdav dngnv ma:pxddma avynpnad[j].brpd,004,71: [16]ITO M,IWATA H,KITAGAWA M,a.Ea 参考文献 [1] LEE M S,KANGSK,LEEBC,a.Thbna nnd mmnnnv dvpmnapna pnydmby[j].bgy Rpdn, 005,73(6): [] ONISHIA,IWAMOTO M,AKITA T,a.Pgnngby mnjnabb[j].sn,000,89: ddm vadamnhpgnna maddvpmnampn pgy[j].anmarpdnsn,008,106(4): [17]YOON K W,SHINTY,PARKJI,a.Dvpmnpṟ nym pvaydnza man mdappmnd whad[j]. RpdFDv,000,1(4): [18]ZHANGX,MIAO YL,ZHAOJG,a.Pnydnddp madvphhbay

5 84 华中农业大学学报第 30 卷 agpvddamḻdvdym[j]. JnaAnmaSn,010,88: [19]JEZOVá M,SCSUKOVáS,NAGYOVáE,a.Eṉ avapna:mxpaṉ n,gadmpgnpdn [J]. Anm RpdS,001,65(1/): Eapnynv ma HUAZaḏng 1 ZHENG Xṉmn WEIQngxn XU Hqg 1 LIU Xm LIL 1.GzhKyLabAnmaGn,BdngdRpdn/Cg AnmaSn,GzhUnvy,Gyg55005,Chna;.HbKyLabAnmaEmbyEngnngd MaBdng/ InAnmaSndVnay Mdn,HbAadmy AgaSn,Wh430064,Chna Aba Inpndy,pnvawbddapad.Cmympx wwdbynvnhpnhpabdy(pbⅠ).wnvgadh ba mdm,hmn,dam,dy wappdmnn v mapgyabhnggdnvym.thhwdhah maaywh mtcm199wagnyhghhncsu3(p<0.05).badnh xpmn1,h maamympxn ma mda wh PMSG,hCGdpFF w55.90%,58.16%,d51.50%,pvy,hwnghahmbnd amngp (80.63%)wagnyhghhhngamngp.Thw ngndnnhmaahvayagh6mm (76.43%)d3 6 mm(83.33%)ndam,bbhwgnyhghhhvayh3mmn dam(30.94%,p<0.01).thmympxwdvddnva,bdcaḏ ngaym,whhwdnv mad44h,hmaav AdBwngn(P>0.05),bhbhwgnyhghhyvC (P<0.01). Kywd pn;y;nv ma;mympx(coc) ( 责任编辑 : 边书京 )

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