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1 J f S Ag :// 南方农业学报 488 ISSN CODEN NNXAAB DOI /j 海黄瓜共附生细菌多样性及其对甘蔗 鞭黑粉菌的抑制作用 江 蕾 3 李 菲3 李 智 3 易湘茜 邓家刚 周 桂* 高程海 3* 广西民族大学 海洋与生物技术学院/广西多糖材料与改性重点实验室培育基地/高校微生物与植物资源利用重点实验室 南宁 广西中医药大学 海洋药物研究所/广西中药药效研究重点实验室 南宁 广西科学院 广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室培育基地 南宁 摘要 目的 研究海黄瓜 P 共附生细菌多样性及其发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用 为甘蔗黑穗病的防治及新型生物农药的研发提供新途径 方法 利用微生物纯培养技术分离纯化海黄瓜的 胃和内容物等组织的共附生细菌 并通过6S DNA序列分析共附生细菌种类多样性及其在海黄瓜不同部位组织 的分布特征 采用牛津杯法测定共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用 结果 从海黄瓜各部位组织共分 离得到79株共附生细菌 归属于4门6科35属46种 优势菌属为 芽孢杆菌属 B 6.5% 鞘氨醇盒菌属 Sgx 8.9% 小单孢菌属 M 6.3% 和柠檬酸杆菌属 C 6.3% 分别以甘蔗鞭黑粉菌的 + 型担孢子 - 型担孢子和菌丝为靶标 采用牛津杯法筛选得到9株活性菌 其中以芽孢杆菌属的BGMRC03005 对甘蔗鞭黑粉菌菌丝 + 型担孢子和 - 型担孢子的抑制作用最强 抑菌圈直径分别为 和4.5 结 论 海黄瓜中可培养细菌种类丰富 且富含对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株 筛选获得的芽孢杆菌属细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用 具有开发成为微生物农药的潜力 关键词 海黄瓜 海洋细菌 物种多样性 甘蔗鞭黑粉菌 抑菌活性 中图分类号 S Q939. 文献标志码 A 文章编号 Dv f f P fg v g S JIANG L 3 LI F3 LI Z 3 YI Xg-x DENG J-gg ZHOU G* GAO Cg- 3* S f M S Bg Ggx Uv f N/Ggx K L Cv B f P M Mf/Ggx Cg Uv K L f Uz f M B R Ng C I f M Dg Ggx Uv f C M/Ggx K L f Eff S C M M Ng C 3Ggx K L f M N P C B C Ggx A f S Ng C A Ojv T f w v w f v f g v f w g vgg v f f P g v f f g S. M P g w f f v f P. g. Dv f ff f P. w z g 6S DNA. I ff f f f g S. w Oxf. R Sv- gg g 6 f 4 w f v f P. g w B 6.5% Sgx 8.9% M 6.3% C 6.3%. Tkg + - f S. g 9 v w g Oxf. Ag ff f B BGMRC03005 w g g 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目 广西自然科学基金项目 06GXNSFBA 广西高校科学技术研究项目 ZD0404 广西海洋生物技术重点实验室项目 GLMBT-0603 作者简介 *为通讯作者 周桂 969- 博士 教授 主要从事壳聚糖应用及红树林活性成分研究工作 E @63. 高程海 979- 博士 研究员 主要从事海洋微生物中次生代谢产物研究工作 E @qq. 江 蕾 99- 研究方向为海洋微生物次生代谢产物 E @63.

2 3期 江蕾等 海黄瓜共附生细菌多样性及其对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用 489 f z f z f z 4.5 f S.. C T f v P. vf f v g fg v g S.. T B. BGMRC03005 ff f f S. w v. K w P v S v 0 引言 研究意义 甘蔗黑穗病是一种由甘蔗鞭黑粉 菌 S 引起的全球性甘蔗病 害 Vák 999 其传播速度快 发病时间短 一旦 感染很难根除 鞭黑粉菌侵入甘蔗后 其冬孢子会 黏附在幼芽的鳞片内部和新生叶的基部 并随着甘 蔗的生长而快速传播 S. 03 从而导致甘 蔗产量和产糖量下降 因此 寻找对甘蔗鞭黑粉菌 有抑制作用的生防菌株 对于甘蔗黑穗病的防治有 极其重要的意义 前人研究进展 生物防治是植物 病害防治中的重要组成部分 且越来越得到世界各 国的重视 其中 芽孢杆菌因其生长速度快 抑菌作 用广泛而成为科研工作者研究生防微生物的热点 齐爱勇等 0 廖咏梅等 004 采用微生物纯 培养法从不同甘蔗黑穗病样地采集的甘蔗根际土壤 及其根 茎 叶等组织内分离获得98株菌株 并采用 对峙培养法从中筛选得到8株对甘蔗鞭黑粉菌有较 强拮抗作用的细菌菌株 其中有株隶属于芽孢杆 菌属 熊国如等 03 利用对峙培养法测定对甘蔗 鞭黑粉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的抑菌活 性 结果显示抑菌圈直径大于0 且该菌在盆栽 防效试验中对甘蔗黑穗病也有很好的抑制效果 李 菲等 07 利用牛津杯法对来自红树植物秋茄的50 株内生细菌进行抗甘蔗鞭黑粉菌活性测定 结果筛 选得到37株抑制程度不同的活性菌株 其中有6株隶 属于芽孢杆菌属 本研究切入点 目前 植物病害生 防菌主要是从植物不同部位或其根际土壤中分离获 得 关于从海生动物中分离筛选得到植物病害生防 细菌的研究鲜见报道 拟解决的关键问题 以海洋 生物海黄瓜 P 为研究对象 采 用微生物纯培养技术 6S DNA序列分析及牛津杯 法开展其共附生细菌多样性及细菌发酵产物对甘蔗 鞭黑粉菌的抑制作用研究 为甘蔗黑穗病的防治及 新型生物农药的研发提供新途径 材料与方法. 试验材料.. 样本来源及预处理 海黄瓜于06年0月 采集自广西防城港怪石滩 东经08 北纬 49 水下5 用无菌水冲洗海黄瓜表面3遍 分别 从海黄瓜的 胃和内容物等4个部位切取 小块 分别加 L无菌水研磨 研磨液保 存于无菌离心管 待用.. 主要试剂和仪器 培养基 TAE缓冲液 E Tq MMx 引物 7F和49R DNA Mk和GVw核酸染料购自北京康为世纪生物科 技有限公司 Cx 00树脂购自美国伯乐公司 其他有机试剂均为国产分析纯 主要仪器设备 SW-CJ-F型洁净工作台 苏州佳宝净化工程设备有 限公司 MINI-6k型迷你离心机 常州市国旺仪器制 造有限公司 T-g型多功能梯度PCR仪 德国 B公司 Pw B型电泳仪 美国伯乐 公司 C G Lg 00 P冷CCD凝胶 成像分析系统 美国锐珂公司 VCX-500超声波细 胞破碎仪 美国S公司 N000型旋转蒸发仪 日 本EYELA株式会社 VB-55型高压灭菌锅 德国 SYSTEC公司 和MINIB-00型金属浴 杭州米欧仪器 有限公司.. 3 供试菌采集及保存 甘蔗鞭黑粉菌冬孢子 于07年5月采自广西金光农场的发病甘蔗植株 轻 轻敲打新鲜黑穗病鞭子上的冬孢子 装于封口袋中 40 烘干并保存于4 冰箱备用. 共附生细菌菌株的分离纯化 将海黄瓜不同部位组织研磨液分别梯度稀释 - 至0 0-和0-3 将稀释液涂布至M M5 M7 M9 M0 AGG I3和I7等8种分离培养基上 8 恒 温培养5 挑取不同形态单菌落划线纯化 记录菌落 数及其形态特征 用冻存管4 保藏纯化后的菌株. 3 共附生细菌的多样性分析. 3. 6S DNA序列及系统发育分析 采用Cx-00树脂法 周双清等 00 提取纯化后细菌的 DNA 并参照W 等 99 的方法进行6S DNA 序列的PCR扩增 扩增样品经%琼脂糖凝胶电泳 检验合格后 委托上海美吉生物医药科技有限公司 广州分公司纯化并测序 测序结果经DNASTAR 整 理 利 用 EzTx Sv. //www. zx. g/ K. 009 和BLAST //....gv/b.g 在线比对 选取同源性高的已 知序列作为参比菌株 运用MEGA 5.0构建NgJg系统发育进化树 并对各菌株的系统发育地 位进行分析 T S DNA序列聚类分析 参照T等 009 的方法 通过V. //fg.../

3 490 /v/x. 绘制韦恩图 分析海黄瓜不 同部位共附生细菌在属级水平上的分布特征. 4 共附生细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果试验. 4. 细菌粗提物制备 参照覃媚等 06 的方 法 将分离获得的共附生细菌菌株分别接种于I 液体培养基中80 / 8 发酵7 收集发酵液 用细胞破碎仪进行破碎 乙酸乙酯萃取 旋转蒸发仪 浓缩 收集粗提物 置于干燥器中保存. 4. 甘蔗鞭黑粉菌担孢子及菌丝的制备 参照 Sg等 005 的方法 取少量鞭黑粉菌冬孢子与无 菌水混匀 混匀后将原液稀释至0-0-和0-3 并涂 布于PDA培养基上 待其萌发后 选取生长效果最佳 的单菌落 0-3 时生长效果最佳 最佳浓度选取依据 为涂布后菌落呈单个分布 且稀疏程度适中 与 L无菌水混匀 稀释至0-5 取00 μl涂布于pda培 养基 于8 培养3~5 待其长出酵母形态菌落 后 随机选取5个分别接种于YEPS液体培养基中 80 / 8 培养4 各取 µl菌液于pda培 养基上进行随机交叉配型 若菌落为白色绒毛状 则 两菌株为异型 + - 交配型单倍体担孢子 若菌落为 酵母形态 则两菌株为同型交配型单倍体担孢子 抑制甘蔗鞭黑粉菌担孢子及菌丝生长的 活性鉴定 参照宫小明等 05 的牛津杯法分别检 测各共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效 果 利用生物级DMSO将共附生细菌发酵产物浓度 调至0 g/l 分别挑取已验证的两种异型 + - 单倍体担孢子接种于50 L YEPS液体培养基中 置 于8 80 /的摇床中培养36 参照李菲等 07 的方法制备待试菌板 空白对照为DMSO 阳性对照为5 μg/l啶酰菌胺 每个牛津杯中加入 00 μl样液 置于8 培养箱中培养 培养5 后 利 用垂直十字交叉法测量各抑菌圈的直径 结果与分析. 海黄瓜中可培养共附生细菌多样性分析结果.. 6S DNA序列及系统发育分析 采用8种 分离培养基从海黄瓜的 胃和内容物中分 别 分 离 获 得 和 0 株 共 79 株 共 附 生 细 菌 表 根据菌落的表观形态及出现时间排除相同菌 株 经6S DNA序列及系统发育分析发现 在种的分 表 海黄瓜可培养共附生细菌的物种组成 T C f f P. 门 P 变形菌门 P 科 F 交替单胞菌科 A 属 G 菌株数量 N f 交替单胞菌属 A 海杆菌属 M 柄杆菌科 C 短波单胞菌属 Bv 杆菌科 E 柠檬酸杆菌属 C 5 杆菌属 E 盐单胞菌科 H 色盐杆菌属 C 甲基杆菌科 M 甲基杆菌属 M 4 Mf 微泡菌属 Mf 莫拉菌科 Mx 不动杆菌属 A 叶瘤菌科 P 中生根瘤菌属 Mz 假单胞菌科 P 假单胞菌属 P 4 根瘤菌科 Rz 根瘤菌属 Rz S 红细菌科 R 副球菌属 P 红螺菌科 R 海旋菌属 T 鞘酯菌科 Sg 鞘氨醇盒菌属 Sgx 7 弧菌科 V 弧菌属 V 厚壁菌门 F 芽孢杆菌科 B 芽孢杆菌属 B 3 F 3 拟杆菌门 B C C Fv Ez 放线菌门 A 皮生球科 D 皮生球属 D 间孢囊菌科 Ig 丝氨酸球菌属 S M 细杆菌属 M 微球菌科 M 柠檬酸球菌属 C G 考克氏菌属 K 微球菌属 M P 小单孢菌科 M 小单孢子菌属 M 5 分枝杆菌科 M 分枝杆菌属 M 4 诺卡氏菌科 N 戈登氏菌 G 红球菌属 R 拟诺卡氏菌科 N 诺卡氏土壤菌属 N 假诺卡氏菌科 P 假诺卡氏菌属 P 来源 S 胃 内容物 内容物 胃 内容物 胃 内容物 内容物 内容物 内容物 胃 内容物 内容物 胃 内容物 内容物 内容物 内容物 内容物 内容物

4 3期 江蕾等 海黄瓜共附生细菌多样性及其对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用 类水平上 79株共附生细菌可分为46个种 归属于4门 6科35属 从属级水平统计分离得到的细菌数 发现其 优势菌属为 芽孢杆菌属 B 6.5% 鞘氨醇盒 菌属 Sgx 8.9% 小单孢菌属 M- Fg % 和柠檬酸杆菌属 C 6.3% 根据46株共附生细菌的6S DNA序列 选取同 源性高的已知序列作为参比菌株 构建NgJg系统发育进化树 图 如图所示 46株 图 基于共附生细菌6S DNA基因序列构建的Ng-Jg系统发育进化树 Ng-Jg g 6S DNA g q f

5 49 共 附 生 细 菌 与 其 参 比 菌 株 的 同 源 性 较 高 均 在 90% 以 上 图 中 未 展 开 表 示 的 4 株 B. 为 BGMRC0300~BGMRC03005 其 参 比 菌 株 分 别 为 B. B. B. 和 B. 未 展 开 表 示 的 4 株 P. 为 BGMRC0303~BGMRC03035 其参比菌株分别为P. g P. P. z和p. z.. 各培养基分离海黄瓜中可培养共附生细菌 种类 利用8种分离培养基对海黄瓜不同部位中的 菌株数量 N f 20 15 10 5 0 M1 M5 M7 M9 M10AGG I s p3 I s p7 共附生细菌进行分离纯化 结果 图 显示 I7培 养基分离得到的细菌种类最多 包括3属7种细菌 M7培养基分离得到的细菌种类最少 只有属4种细 菌 菌 落 计 数 结 果 表 明 M M5 M7 M9 M0 AGG I3和I7培养基上的菌落数分别为 和 CFU/L 由此可见 I7培养基分离到的菌 株数量及种类均最多 可作为海黄瓜共附生细菌的 首选分离培养基 A A B B C C D D F F M M M M M M P P P P S S T T A A Bv B v C C E E G G Mz M z Mf M f M M P P Rz R z Sgx S g x V V G G C C C C Ez E z K K M M M M N N P P R R S S 培养基种类 K f 图 不同培养基分离得到的共附生细菌种类数 Fg. S k f ff.. 3 6S DNA序列聚类分析 在属的分类水平 上对海黄瓜 胃和内容物来源细菌进行 6S DNA序列聚类分析 图3 结果发现海黄瓜不 同部位共附生细菌种类差异较明显 从海黄瓜 胃和内容物部位中分别获得8 8 5和5个菌 属 海黄瓜的4个部位中均分离到芽孢杆菌属细菌 柠檬酸杆菌属 甲基杆菌属 M 和鞘 氨醇盒菌属的细菌 和内容物中均分离到 分枝杆菌属 M 和假单胞菌属 P- 图 3 海黄瓜各部位来源共附生细菌属级种类分布韦恩图 Fg.3 V g f g f f ff f P. 细菌 和内容物中均分离到色盐杆菌属 C F 属 和 小 单 孢 菌 属 M 细菌 和中均分离到海杆 菌属 M 细菌 和内容物中均分离 到海旋菌属 T 细菌. 海黄瓜共附生细菌发酵物对甘蔗鞭黑粉菌的 抑制效果 分别以甘蔗鞭黑粉菌的 + 型担孢子 - 型担 孢子和菌丝为靶标 采用牛津杯法从46株细菌中筛 选得到8株对鞭黑粉菌菌丝生长有抑制作用的细菌 阳性率为7.4% 9株细菌对鞭黑粉菌 + 型担孢子 有抑制作用 阳性率为9.6% 7株细菌对鞭黑粉菌 - 型担孢子有抑制作用 阳性率为5.% 图4和表 46株细菌中有9株对甘蔗鞭黑粉菌至少一种形 态有抑制作用 总阳性率为4.3% 其中芽孢杆菌属 细菌3株 假单胞菌属细菌株 在所有活性菌株中 只有细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌均有抑制作 用 且抑制作用最强 抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝 + 型担孢子和 - 型担孢子的抑菌圈直径分别为 和4.5 其中抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝和 + 型担孢子的抑菌圈直径超过阳性对照 具有开发 成为微生物农药的潜力 3 讨论 海洋微生物是一种潜在的微生物资源 代谢产

6 3期 493 江蕾等 海黄瓜共附生细菌多样性及其对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用 Fg.4 图 4 海黄瓜共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑菌活性 B v f P. f g S. 对鞭黑粉菌菌丝的抑制作用 对鞭黑粉菌 + 型担孢子的抑制作用 对鞭黑粉菌 - 型担孢子的抑制作用 I ff f S. I ff + f S. I ff - f S. 表 海黄瓜共附生细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果 T Ig ff f P. g S. 菌株编号 S N. BGMRC03003 BGMRC03004 BGMRC03005 BGMRC03008 BGMRC0306 BGMRC0308 BGMRC0309 BGMRC030 BGMRC0303 BGMRC0304 BGMRC0305 BGMRC0307 BGMRC0308 BGMRC03033 BGMRC03035 BGMRC03037 BGMRC03039 BGMRC0304 BGMRC03044 啶酰菌胺 B DMSO + 型担孢子 ± ± ± ± ± ±.06.90± ± ± ±.00 - 抑菌圈直径 D f z - 型担孢子 - 鞭黑粉菌菌丝 H f S..30±0.8.75± ± ± ± ±.63.5 ± ± ±0.4.60± ± ± ± ± ± ± ± 表示无抑菌活性 - v 物丰富 广西防城港海域生态环境多样 海产资源 丰富 其中富含多种多样的微生物资源 且活性菌株 较多 本研究利用8种成分各异的培养基从广西防 城港怪石滩海域海黄瓜的 胃 及内容物中 分离获得共附生细菌79株 隶属于4门6科35属46 种 根据培养基分离出的细菌种类及数量 确定I7 培养基为最优分离培养基 共附生细菌在海黄瓜各 部位的种类与数量分布不一 其中从中分离得到 的细菌种类和数量最多 其次是 胃中最少 海 黄瓜中共附生细菌主要分布在和上 可能与 海黄瓜暴露在海水中 海水中的细菌会附着或 寄生在其上 同时海黄瓜在摄食中食物所携带 的细菌可能会附着或寄生在中有关 本研究采用牛津杯法从46株共附生细菌中筛 选得到9株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的细菌 总 阳性率为4.3% 其中 芽孢杆菌属细菌BGMRC 03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用 与廖咏梅 等 004 李菲等 07 的研究结果相似 芽孢杆 菌属为植物病害生物防治中应用最广泛且取得成功 的一种高效生防微生物 蒋琳和马承铸 000 徐滔 明等 06 本研究测试了4株分离自海黄瓜的芽 孢杆菌 BGMRC0300~BGMRC03005 对甘蔗鞭黑 粉菌的抑制效果 结果显示有3株芽孢杆菌具有抑制 甘蔗鞭黑粉菌的活性 但只有BGMRC03005具有同 时抑制3种鞭黑粉菌形态的活性 其余两株都仅对某 一种形态的甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用 说明并非所

7 494 有芽孢杆菌属的菌株均对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作 用 且不同种之间抑制效果也不相同 造成不同抑制 效果的原因可能与不同种类芽孢杆菌的代谢途径不 同有关 不同的代谢途径可能产生不同结构或活性 差异明显的代谢产物 因此 在后续的研究中还需 针对活性菌株发酵产物作进一步研究 包括发酵产 物中化学成分分析 活性菌株合成活性产物的途径 及活性产物的作用机理等 4 结论 本研究采用8种分离培养基对广西防城港怪石 滩海域海黄瓜的 胃 和内容物进行共附生 细菌分离及鉴定 结果共分离获得共附生细菌79株 归属于4门6科35属46个种 并从中筛选得到9株对 甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的细菌 表明海黄瓜中可 培养细菌种类丰富 且富含对甘蔗鞭黑粉菌有抑制 作用的菌株 其中芽孢杆菌属细菌BGMRC03005对3 种鞭黑粉菌形态均有抑制作用 具有开发成为微生 物农药的潜力 参考文献 宫小明 马荣桧 孙军 张艺兵 于金玲 丁葵英 郭礼强. 05. 黄曲霉毒素生物防控菌的筛选及鉴定 J. 微生物 学杂志 Gg X M M R H S J Zg Y B Y J L Dg K Y G L Q. 05. Sg f f fx -g J. J f Mg 蒋琳 马承铸 生物农药研究进展 综述 J. 上海农 业学报 6 S Jg L M C Z Pg f vw J. A Ag Sg 6 S 李菲 高程海 余炼 易湘茜. 07. 秋茄内生细菌多样性及 抑制甘蔗黑穗霉菌活性研究 J. 中国抗生素杂志 L F G C H Y L Y X X. 07. Dv f f K -v v g Ug Sw J. C J f A 廖咏梅 张桂英 黄定安 覃蔓萍 姚普远 甘蔗黑穗 病菌拮抗细菌的筛选及鉴定 J. 广西农业生物科学 L Y M Zg G Y Hg A D Q M P Y P Y Sg f f g f Ug J. J f Ggx Ag Bg S 齐爱勇 赵绪生 刘大群. 0. 芽孢杆菌生物防治植物病害 研究现状 J. 中国农学通报 Q A Y Z X S L D Q. 0. R f g B. J. C Ag S B 覃媚 于清武 竺利波 李菲 颜栋美 余炼 高程海. 06. 三 种江蓠共附生细菌多样性及抑菌活性分析 J. 南方农 业学报 Q M Y Q W Z L B L F Y D M Y L G C H. 06. Dv f f f G v J. J f S Ag 熊国如 赵更峰 伍苏然 冯翠莲 张树珍. 03. 甘蔗黑穗 病菌拮抗菌HAS的筛选和鉴定 J. 热带作物学报 Xg G R Z G F W S R Fg C L Zg S Z. 03. Sg f f HAS g S S J. C J f T C 徐滔明 罗志威 易子霆 徐妹华 丰来. 06. 拮抗微生物在 防治烟草病害中的研究与应用 J. 江西农业学报 X T M L Z W Y Z T X M H Fg L. 06. R f g g f J. A Ag Jgx 周双清 黄小龙 黄东益 胡新文 陈吉良. 00. Cx-00 快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板 J. 生物技术 通报 Z S Q Hg X L Hg D Y H X W C J L. 00. A f xg DNA f Cx-00 J. Bg B K K H R S W Cg H W N Y D Y J H C O J O H M B J W N. v. f k J. I J f S & Ev Mg Sg N S B M P D M fg v g gg f Ug J. FEMS Mg L S Y C Wg S S G J L X B T X L P Q Y X. 03. A TqM - PCR f qf f S g J. T Sf W J T K P D P N S G N M K S. 0. MEGA5 v g g x k v x J. M Bg & Ev T J M S Lvz F P E C C F J P Ug E M z-t R P D L E N R D J L M Tw g J. Ev Mg Vák K T w f f fg w w g J. Mx W P S Mzg D A Hg R. 99. Cx 00 f x f DNA f PCR- g f f J. Bq 责任编辑 麻小燕

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