76 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No.9200 点, 即自变量取值在所选因子所构成的三维顶点 ;3 个为零点重复, 即零点试验重复 3 次, 用以估计试验误差 根据相应的试验表进行试验后, 对数据进行二次回归拟合, 分析各因素的主效应和交互效应, 最后通过岭

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,200,30(9):75 79 响应面法优化灵芝药性固体发酵培养基 朱 强 夏艳秋 董克克 杨从发 2 汪志君 ( 淮海工学院海洋学院连云港 扬州大学食品科学与工程学院扬州 22500) 摘要采用单因素试验和响应曲面试验优化灵芝药性固体发酵培养基 优化所得培养基组成为 : 以啤酒糟为基质, 料水比.4, 黄芪 2.52%, 葡萄糖 4.78%,KH 2 0.2%,MgSO 4 7H 2 O 0.25%,V B 微量 在此优化条件下, 灵芪菌质多糖含量高达 8.42mg/g, 较优化前提高了 29.54% 关键词灵芝黄芪灵芪菌质多糖固体发酵啤酒糟中图分类号 Q85 利用药用真菌作为发酵菌种, 添加了中药的药性基质作为培养基, 构建生物转化体系, 不仅可对中药中的纤维 糖类 蛋白质等加以利用, 还可对中药中的某些药性成分进行修饰和转化, 同时中药中的某些成分还可促进或抑制真菌代谢产物的合成与分泌, 生产出包含多种活性成分的制剂或新药材 [ 5], 这是中药二次开发及创制真菌类新药材的一种有效途径, 比起普通固体发酵的菌质, 可能有增效 扩用 解毒等作用 [6] 灵芝和黄芪均具有提高机体免疫和抗肿瘤等多种生物活性功能 [7 8] 若将二者在适宜的条件下构建生物转化体系, 进行组合发酵, 生产灵芪菌质及其次级代谢产物灵芪菌质多糖 (Ganodetmalucidum Astragalus membranaceuspolysaccharide,gaps), 在人及动物新药开发及应用上极具经济价值和社会价值 鉴于此, 在前期实验基础上, 本试验拟采用灵芝 黄芪固体发酵体系, 研究其培养基的最优配比, 为灵芝 黄芪的深层开发利用及中药新药制剂的研制提供参考模型 材料与方法. 材料.. 灵芝 [Ganodermalucidum(Fr.)Karst]5.534 购自中国普通微生物菌种保藏中心..2 黄芪 (Astragalusmembranaceus) 购于连云港市中药店..3 啤酒糟本院生物工程实验室啤酒生产线提供 收稿日期 : 修回日期 : 十一五 国家科技支撑计划重点项目 (2008BADAB05) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :zq7685@63.com.2 培养基.2. 斜面培养基综合 PDA 琼脂培养基.2.2 液体种子培养基 (g/l) 葡萄糖 30, 酵母膏 2, 麸皮 5,KH 2.5,MgSO 4 7H 2 O0.75,V B 微量,pH 自然.2.3 固体发酵基础培养基以啤酒糟为基质, 料水比.4, 葡萄糖 2.5%,KH %,MgSO 4 7H 2 O 0.25%.2.4 药性固体发酵培养基按实验设计, 于固体发酵培养基中添加适量黄芪.3 方法.3. 固体发酵工艺流程菌种活化 液体种子培养 培养基配制, 装入 250ml 罐头瓶, 八层纱布封口, 2 灭菌 40min 接种 0ml/00g 28, 避光培养待菌体结成块后倒置培养 30 天 发酵结束.3.2 菌质多糖的提取与测定将固体菌质于 60~ 70 真空干燥, 粉碎, 过 80 目筛, 用 75% 乙醇 60 水浴醇提 h 去除脂 单糖 低聚糖等物质, 过滤, 滤渣用 75% 乙醇洗涤 2 次后加 20 倍蒸馏水, 超声处理 0min 后于 95 水浴提取 4h, 提取液透析至不再有还原糖反应 透析液在 50 真空旋转蒸发浓缩至原体积的 /5, 再加入 3 倍体积 95% 酒精,4 过夜 8000r/min 离心 20min 沉淀用无水乙醇洗涤 2 或 3 次, 冷冻干燥即得菌质多糖粗品, 热水复溶后用苯酚 硫酸法测定菌质多糖含量.3.3 响应曲面分析试验 (RSA) 根据 Box Behnken 中心组合设计原理, 以 GAPS 含量为响应值, 设计 3 因素三水平共 5 个试验点的响应曲面, 其中 2 个是析因

2 76 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No.9200 点, 即自变量取值在所选因子所构成的三维顶点 ;3 个为零点重复, 即零点试验重复 3 次, 用以估计试验误差 根据相应的试验表进行试验后, 对数据进行二次回归拟合, 分析各因素的主效应和交互效应, 最后通过岭脊分析求出最佳值 2 结果与分析 2. 单因素试验确定培养基主要组成 2.. 固体发酵基质的确定由表 可看出, 啤酒糟为固体发酵基质时, 灵芝菌丝萌发早, 生长快, 菌丝洁 发酵基质 萌发时间 (d) 表 不同基质对灵芝生长代谢的影响 白 浓密 粗壮, 且菌质多糖含量明显高于其他发酵基质 啤酒糟的主要成分是麦芽壳和未糖化的麦芽, 这些物质含有大量的纤维素, 灵芝在生长过程中能够分泌纤维素酶和半纤维素酶从而分解利用啤酒糟中的纤维 同时, 啤酒糟中尚含有一定量的残糖 含氮化合物和各种无机元素及维生素, 为灵芝提供优质的碳 氮源和矿物质及生长因子, 能充分满足灵芝生长代谢的营养需求 并且用啤酒糟作为固体发酵基质时, 培养基组织状态疏松, 透气性好, 利于菌体生长 因此, 实验确定啤酒糟为灵芝固体发酵最佳基质 Table EfectsofdiferentsolidmaterialonGanodermalucidum 满瓶时间 (d) 平均生长速度 (mm/d) 菌质多糖含量 (mg/g) 菌丝形态 麸 皮 生长快, 菌丝洁白 浓密 粗壮 木 屑 生长慢, 菌丝稀疏, 分泌色素形成黄斑 山芋渣 长势一般, 菌丝稀疏 啤酒糟 生长快, 菌丝洁白 浓密 粗壮 米 糠 长势不齐, 前期较快, 后期较缓, 分泌色素形成黄斑 麦芽根 生长慢, 菌丝稀疏, 分泌色素形成黄斑 2..2 构建灵芪生物转化体系的可行性由图 可知, 灵芝 黄芪组合发酵可行 适量添加黄芪可以促进灵芝菌丝的快速萌发 生长及 GAPS 的产生, 在黄芪添加量为 0% 时 GAPS 的产量最高, 达到 6.50mg/g, 比未加黄芪组约提高 25.00% 但黄芪添加量过高又会抑制灵芝菌丝的生长, 导致菌丝萌发晚, 生长缓慢, 从而影响 GAPS 的产量 因此, 在可行的基础上, 实验初步确定黄芪添加量为 0% 加, 当葡萄糖追加量达到 5% 时 GAPS 产量最高, 而继续追加葡萄糖时,GAPS 的产量反而降低 因此, 实验确定葡萄糖为最适追加碳源, 并初步确定其追加量为 5% 图 2 不同碳源对灵芪多糖的影响 Fig.2 EfectsofdiferentcarbonsourceonGAPS 图 黄芪添加量对 GAPS 的影响 Fig. EfectsofAstragalumembranaceus concertiationongaps 2..3 追加碳源的确定从图 2 可看出, 追加碳源对灵芝固体发酵有明显促进作用, 且碳源种类对 GAPS 的产量影响较大 其中追加葡萄糖 蔗糖和玉米粉时, GAPS 的产量都较高, 以追加葡萄糖的产量最大 由图 3 可知, 随葡萄糖用量的增加,GAPS 的产量也随之增 2..4 追加氮源的确定图 4 结果表明, 以 GAPS 为目的产物时, 高浓度的氮源对灵芝生长及代谢有一定抑制作用, 且无机氮源抑制作用大于有机氮源, 说明啤酒糟中的氮源已经足够灵芝生长代谢用, 无需追加氮源 2..5 追加无机盐的确定由图 5 可知, 追加无机盐可提高 GAPS 产量, 其中钾盐和磷盐的促进作用最明显 磷参与糖代谢及能量代谢, 钾是许多酶的激活剂, 可以促进碳水化合物的代谢, 亦可提高细胞质膜的通透性, 对灵芝生长代谢都非常重要 由于 KH 2 可同时提供钾 磷元素, 并具有较强的缓冲作用, 且 GAPS 产

3 200,30(9) 朱强等 : 响应面法优化灵芝药性固体发酵培养基 响应曲面试验优化培养基主要配比在单因素试验基础上, 选择黄芪 葡萄糖和 KH 2 的用量为变量, 以 GAPS 含量为响应值, 设计 3 因素 2 水平的响应曲面分析试验, 试验因素水平 设计结果 方差分析及响应曲面图分别见表 2 表 3 表 4 和图 7 图 3 葡萄糖添加量以灵芪多糖的影响 Fig.3 EfectsofglucoseconcentrationonGAPS 表 2 Box Behnken 因素水平 Table2 Experim entalvariablesandlevels forbox Behnkendesign 因素 编码 水平 黄芪添加量 (%) A 5 20 葡萄糖追加量 (%) B KH 2 追加量 (%) C 表 3 响应曲面分析试验设计结果 Table3 ResponsesurfaceBox Behnkendesign 图 4 不同氮源对灵芪多糖的影响 Fig.4 EfectsofdiferentnitrogensourceonGAPS 量最高, 故确定在培养基中追加 KH 2 但其浓度要求比较严格, 适量则促进, 过量则抑制 ( 图 6) 因此, 实验初步确定其追加量为 0.25% 图 5 不同无机盐对灵芪多糖的影响 Fig.5 EfectsofdiferentmineralonGAPS 图 6 磷酸二氢钾添加量对灵芪多糖的影响 Fig.6 EfectsofKH 2 ongaps 实验 黄芪添加量 (A,%) andcorrespondingresponse 葡萄糖追加量 (B,%) KH 2 追加量 (C,%) GAPS 含量 (y,mg/g) 变异来源 Source 表 4 回归模型的方差分析 Table4 ANOVAofquadraticpolynomialmodel 平方和 SS 自由度 DF 均方 MS F P>F Model A B C A <0.000 B C AB AC BC Residual CorTotal

4 78 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No.9200 图 7 黄芪 葡萄糖和 KH 2 对 GAPS 影响的响应曲面图 Fig.7 SurfacelayeroftheefectsofAstragalusmembranaceus,glucoseandKH 2 ongaps 利用 SAS8.0 软件拟合得到多元回归模型 :GAPS (y) = A 0.28 B 0.25 C.24 A B C A B+0.20 A C 0.9 B C 由图 7 可得出,A B C 存在极值点,y 的最大估计值为 8.46mg/g, 对应的因素浓度为黄芪 2.52%, 葡萄糖 4.78%,KH 2 0.2% 优化所得灵芝药性固体发酵培养基组成为 : 以啤酒糟为基质, 料水比.4, 黄芪 2.52%, 葡萄糖 4.78%, KH 2 0.2%,MgSO 4 7H 2 O0.25%,V B 微量 2.3 验证试验采用优化所得培养基进行 5 组发酵实验, 所得 GAPS 含量分别为 8.35mg/g 8.45mg/g 8.39mg/g 8.5mg/g 8.40mg/g, 平均含量为 8.42mg/g, 与模型预测值非常接近, 表明该模型能很好地预测实际发酵结果 3 讨论 培养基是灵芝药性固体发酵的重要营养因素, 试验结果表明其各组成之间的微小变化会直接影响发酵过程中各种酶的活性, 进而影响其生长和药用菌质的成分和含量 优化所得药性固体培养基以啤酒糟为基质, 无需额外追加氮源, 组成简单, 成本低廉,GAPS 含量高, 易于生产放大, 同时充分利用啤酒工业固体废渣, 实现二次资源的循环利用 参考文献 国中药杂志,2005,30(2): YangH L,ChenG H,ZhangK C.ChinaJournalofChinese MateriaMedica,2005,30(2): [2] 王玉红, 丁重阳, 徐鹏, 等. 中药黄芪对发酵生产灵芝多糖的影响. 食品与生物技术学报,2005,24(2):38 40,45. WangYH,DingCY,XuP,etal.JournalofFoodScienceand Biotechnology,2005,24(2):38 40,45. [3] 魏巍, 罗霞, 石珏, 等. 灵芝与中药共发酵产物的药理学初步研究. 四川大学学报 ( 自然科学版 ),2007,44(6): WeiW,LuoX, ShiJ, etal. JournalofSichuanUniversity (NaturalScienceEdition),2007,44(6): [4]LiuGQ,ZhangKC.Enhancementofpolysaccharidesproduction inganodermalucidumbytheadditionofethylacetateextractsfrom Eupolyphaga sinensis and Catharsius molosus. Applied MicrobiologyandBiotechnology,2007,74(3): [5] 朱强, 熊晓辉, 王芳. 甘草对灵芝发酵产灵芝多糖影响初探. 中国酿造,2009,24(2): ZhuQ,XiongXH,WangF.ChinaBrewing,2009,24(2): [6] 庄毅, 谢小梅. 药用真菌新型 ( 双向性 ) 固体发酵工程对雷公藤解毒持效的初步研究. 中国中药杂志,2009,34(6): ZhuangY,XieXM.ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2009,34(6): [7]ChienCC,TsaiM L,ChenCC,etal.Efectsontyrosinase activityby the extracts ofganoderma Iucidum and related. MushroomsMycopathologia,2008,66(2):7 20. [8]WuJ,WangYX,SuW L,etal.EfectofAstragalusinjectionon seriousabdominaltraumaticpatients celularimmunity.chinese JournalofIntegrativeMedicine,2006,2():29 3. [] 杨海龙, 陈高洪, 章克昌. 利用药用真菌深层发酵加工中药. 中

5 200,30(9) 朱强等 : 响应面法优化灵芝药性固体发酵培养基 79 OptimizationofGanodermaLucidum MedicinalSolidFermentation Medium byresponsesurfacetest ZHUQiang XIAYan qiu DONGKe ke YANGCong fa WANGZhi jun 2 (ColegeofMarine,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang ,China) (2ColegeofFoodScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou 22500,China) Abstract Single factorandresponsesurfacetestwereusedforoptimizationofganodermalucidum medicinalsolidfermentationmedium.optimizedmedium compositionwereasfolows:brewer'sspentgrainas substrate,theratioofmaterialtowaterwas.4,astragalusmembranaceus2.52%,glucose4.78%, KH 2 0.2%,MgSO 4 7H 2 O 0.25%,V B trace.undertheoptimizedconditions,gapsconcertration reachedup8.42mg/g,increasedby29.54% comparedwithunoptimization. Key words Ganoderma lucidum Astragalus membranaceus Ganodetma lucidum Astragalus membranaceuspolysaccharide(gaps) Solidfermentation Brewer sspentgrain 第二届中国第三方检测实验室发展论坛圆满闭幕 第二届中国第三方检测实验室发展论坛于 200 年 8 月 26 日至 27 日在北京国家会议中心举行 本届论坛由中国检验检疫科学研究院主办, 检科院综合检测中心承办, 梅特勒 - 托利多中国公司协办 本届论坛以 提升检测质量 共创行业品牌 为主题, 开展了一系列主题演讲和专题研讨活动 来自全国各地的检验检疫 第三方检测机构及相关企业检测实验室的百余位代表参加了此次论坛 中国检科院院长李怀林先生 国家认监委实验室与检测监管部副主任肖良博士 中国检科院综合检测中心主任陈彦长先生 梅特勒 - 托利多大中华区总裁 EricLim 先生 SGS 通标标准技术服务公司总裁申屠献忠先生 InterTek 集团中国区总裁柏学礼先生 华测检测董事长万峰先生等数十名来自政府主管部门 监管认证机构 国内外检测机构的领导和专家发表演讲, 就第三方检测实验室发展战略 行业自律和协作 实验室管理和检测技术等论题进行深入探讨 本届论坛还同期举办实验室展览, 梅特勒 - 托利多 安捷伦等多家国内外知名检测技术和设备供应商参加了现场展示活动

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