7月19期

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种冀
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1 中国农学通报 2011,2(1):22-2 Chinese Agricultural Science Bulletin 薄皮甜瓜种质资源遗传多样性的 RAPD 分析智海英, 马海龙, 岳青 ( 省农业科学院园艺研究所, 太原 0001) 摘要 :RAPD 分子标记对来源不同的 1 份薄皮甜瓜种质资源进行了遗传多样性分析 11 个随机引物共扩增出条带, 平均每个引物扩增的多态性带数为 5. 条, 多态性带百分率为.% 利用 NTSYS-pc 软件计算种质间的遗传距离, 用 UPGMA 法进行聚类分析, 将供试的 1 份种质可分为个类群组, 用 EIGEN 方法进行主坐标分析, 将其分为个类群 12 组 2 种分类方法结果基本一致, 后者能更为直观地反映群体之间的关系关键词 : 薄皮甜瓜 ; 种质资源 ; 遗传多样性 ;RAPD 中图分类号 :S52,S02. 文献标志码 :A 论文编号 : RAPD Analysis of Genetic Diversity on Germplasm Resources of Oriental Melon Zhi Haiying, Ma Hailong, Yue Qing (Institute of Horticulture, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 0001) Abstract: The genetic diversity of oriental melon resources was analyzed with RAPD. 11 RAPD random primers produced polymorphic bands, averaged 5. bands each primer pair. The average percentage of polymorphic bands was.%. Genetic distance was calculated by the NTSYS-pc software. A dendrogram was constructed by using UPGMA based on genetic distance matrix. 1 accessions were clustered into groups and subgroups based on the RAPD data by the method of clustering analysis, and groups and 12 subgroups by the method of principal coordinates analysis. The results from these methods were similar, but the result from the principal coordinate analysis was more informative. Key words: oriental melon; germplasm resources; genetic diversity; RAPD 0 引言薄皮甜瓜 (Cucumis melon L. 2n=2x=2) 是葫芦科 (Cucurbitaceae) 甜瓜属植物, 在世界各地均有栽培, 是全球十大水果之一中国的黄淮及长江流域种植薄皮甜瓜历史久远, 是甜瓜植物的次生起源地之一, 薄皮甜瓜在中国华北及东北地区广泛种植, 其类型和品种 [1-2] 十分丰富目前, 在薄皮甜瓜育种中有集中利用少数亲本的倾向, 导致育成品种亲缘关系相近遗传基础狭窄, 同时遗传的均质性也带来了遗传的脆弱性分析甜瓜种质资源的亲缘关系, 明确种质资源特性, 减少同名异物同物异名带来的混乱, 对提高引种效率有效利用种质资源进行品种改良及优异种质创新等具有重要的意义国内外学者用分子标记对甜瓜作物的种质遗传多样性进行了系统研究, 通过聚类分析, 将甜瓜分为厚皮 [-] 甜瓜和薄皮甜瓜 2 个大类, 但专门针对薄皮甜瓜种质 [10] 资源遗传多样性的研究尚少 RAPD 分析方法简便快捷, 在葫芦科蔬菜作物的品种鉴定遗传多样性的研 [11-1] 究中应用较多本试验应用 RAPD 分子标记技术对 1 份薄皮甜瓜种质资源材料的遗传多样性进行了聚类分析及主坐标分析, 目的是为薄皮甜瓜遗传资源之间的亲缘关系鉴定及在杂种优势利用提供依据基金项目 : 省科技攻关项目早熟优质薄皮甜瓜新品种选育 ( ); 省农业科学院攻关项目薄皮甜瓜移动大棚高效栽培技术研究 (ygg02) 第一作者简介 : 智海英, 女,1 年生, 太谷人, 助理研究员, 硕士, 研究方向 : 瓜类作物育种及种质资源通信地址 :0001 太原市许坦东街 21 号省农业科学院园艺研究所, haiyingzhi@1.com 收稿日期 : , 修回日期 :

2 智海英等 : 薄皮甜瓜种质资源遗传多样性的 RAPD 分析 22 1 材料与方法 1.1 供试材料供试的 1 份薄皮甜瓜种质材料, 为省农科院园艺研究所从东北华北及西北等地历年收集的地方品种及市售商品品种, 经多代自交提纯优选获得的优良自交系 ( 表 1) 表 1 供试材料及来源编号材料名称来源编号材料名称来源 1 绿麻瓜 22 C-1 2 R-1 河北 2 B-2 河南 J-11 2 白沙蜜世纪甜 25 Z- 辽宁 5 H-5 内蒙古 2 G-2 甘肃 R-2 河北 2 J-1 L-1 2 HY-2 L-2 2 HY- 红城脆内蒙古 0 HY-1 10 Z- 辽宁 1 L- 11 H-2 内蒙古 2 J-2 12 G-1 甘肃 J- 1 T-1 J- 1 T-2 5 J-5 15 八里香 J- 1 芝麻 J- 1 T- J- 1 T- J-10 1 L-5 0 J- 20 L- 1 L- 21 灯笼红 1.2 试验方法试验于 200 年在省农业科学院园艺研究所进行总 DNA 的提取以真叶露心期幼苗为材料, 每份材料随机选取 5 个植株的地上部分混合取样, 总基因 [1] 组 DNA 提取方法采用改良 CTAB 法, 将提取到的 DNA 样本用紫外分光光度计在 20 nm 和 20 nm 下测定 OD 值, 检测样本 DNA 质量并计算出 DNA 浓度, 稀释至 0 ng/µl 备用首先, 对薄皮甜瓜的 RAPD-PCR 反应体系进行了优化设计, 最终确定了 PCR 扩增体系的总体积为 25 µl, 具体为 :1 Buffer,1.5 mmol/l MgCl 2,0.1 mmol/l dntps,1.0 µmol/l 引物,1 U Taq DNA Polymerase, 0 ng 模板 DNA,ddH 2O 补足 25 µl 随机引物 dntps 和 Taq DNA Polymerase 均由上海生物工程技术有限公司提供在 PCR 扩增仪 (Eppendorf Mastercycler Gradient) 上进行 RAPD-PCR 反应, 经优化确定的扩增程序为 : 预变性 5 min; 变性 0 s, 退火 0 s, 2 延伸 0 s,0 个循环 ;2 延伸 min; 保存用 DYY-B 型稳压稳流电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ) 对扩增产物进行电泳, 使用 0.5 TBE 缓冲液, 在 1.% 琼脂糖凝胶 ( 含 0.5 µl/ml 的溴化乙锭 ) 中, 在水平电泳槽中以 5 V/cm 电压下电泳 1~2 h,marker 为 DL2000, 取出后在凝胶成像仪 (Bio-rad,doc-100) 上照相记录将电泳图谱清晰且可重复的 DNA 条带记为 1, 同一迁移位置上未出现的带记为 0, 生成由 0,1 矩阵用 NTSYSpc 2.10e 软件进行聚类分析和主坐标分析用 SimQual 程序建立 Jaccard 相似系数矩阵, 用 SAHN 程序中的 UPGMA 方法进行聚类分析, 主坐标分析用 DCENTER 程序对系数矩阵进行转换, 用 EIGEN 程序求特征值和特征向量

20 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 2 结果与分析 2.1 1 份薄皮甜瓜材料基因组 DNA 的 RAPD-PCR 结果从条随机引物中筛选出 11 个多态性高重复性好的随机引物进行 RAPD 扩增结果表明,11 条引物在 1 份薄皮甜瓜材料中共扩增出条条带, 其中包含多态性带 5 条, 平均每条引物获得多态性带 5. 条, 引物多态性信息含量变幅 25.

3 20 中国农学通报 2 结果与分析份薄皮甜瓜材料基因组 DNA 的 RAPD-PCR 结果从条随机引物中筛选出 11 个多态性高重复性好的随机引物进行 RAPD 扩增结果表明,11 条引物在 1 份薄皮甜瓜材料中共扩增出条条带, 其中包含多态性带 5 条, 平均每条引物获得多态性带 5. 条, 引物多态性信息含量变幅 25.0%~100.0%, 平均为.% ( 表 2) 引物 S15 对 1 份薄皮甜瓜材料的 RAPD 带型见图 1 表 2 引物序列及其多态性引物编号引物序列 5 - 总带数 / 条多态性带数 / 条多态性比率 /% S2 GAAACGGGTG S12 TGAGAAGCGG 2. S0 GTTGCGATCC 5. S15 ACGGCGTATG. S125 GGCAGCAGGT. S1 AGGGAACGAG S2 CAGCCTACCA. S TGCTCTGCCC S11 GTAGACCCGT 5 1. S GTCCCGACGA S22 TGCCGAGCTG 总计 5. M M bp 1500 bp 50 bp 500 bp 图 1 对 1 个薄皮甜瓜材料的 RAPD-PCR 扩增电泳图 ( 引物为 S15) 2.2 聚类分析以 RAPD 条带建立的遗传相似矩阵, 用聚类分析的方法构建亲缘关系树状图 ( 图 2) 聚类结果表明, 1 份材料的相似系数分布在 0.2~0.0 之间 R-1(2) 与世纪甜 () 相似性系数最大, 为 0.0, 表明它们之间的亲缘关系最近在相似系数 0. 处可将 1 份材料分为大类群第 Ⅰ 类群为种质资源材料最多的类群, 共含有 0 份材料, 在相似系数为 0. 处可细分为组第 1 组为绿麻瓜 (1),Z-(10) 等 1 份种质, 表现为绿皮, 椭圆形中熟类型 ; 第 2 组仅为 Z-(25)1 份种质, 表现为白皮, 圆形小瓜早熟类型 ; 第组为芝麻 (1),C-1(22) 共 2 份种质, 分别来源于和, 表现为绿皮黄条带, 椭圆形晚熟类型 ; 第组为 L-1(),J-() 等 1 份种质, 其中 10 份来源于, 表现为白绿皮, 近圆形中熟类型第 Ⅱ 类群共份种质, 在相似系数为 0.2 处可细分为 2 组第 1 组为 H-5(5), 八里香 (15)2 份种质, 分别来源于内蒙古和, 表现为绿皮, 椭圆形中熟类型 ; 第 2 组为 T-(1),L-(1) 等份种质, 表现为黄绿皮, 近圆形中熟类型第 Ⅲ 类群共 5 份种质, 在相似系数为 0.1 处可细分为 2 组第 1 组仅为 J-11()1 份种质, 来源于, 表现为绿皮, 椭圆晚熟类型 ; 第 2 组为 L-5(1),J-1 (2) 等份种质, 其中 2 份来源于, 表现为绿皮, 椭圆晚熟类型 2. 主坐标分析将 RAPD 分子标记获得的相似系数矩阵经过主坐标分析, 得出第 1 个主坐标解释的变异为 1.11%, 第 2 个主坐标解释的变异为.%, 第个主坐标解释的变异为.0% 将 1 份薄皮甜瓜材料绘制出第 1 2 主坐标二维图及第 1 2 主坐标三维图 ( 图, 图 ) 1 份

智海英等 : 薄皮甜瓜种质资源遗传多样性的 RAPD 分析 21 1 2 1 11 12 2 2 2 1 10 25 1 22 2 20 1 2 0 5 5 15 1 0 1 1 1 2 21 2 0.2 0. 0. 0. Coefficient 0.

4 智海英等 : 薄皮甜瓜种质资源遗传多样性的 RAPD 分析 Coefficient 0.0 图 2 1 份薄皮甜瓜材料的 RAPD 标记聚类图 1~1 为供试薄皮甜瓜材料编号图 1 份薄皮甜瓜的主坐标散点图材料在第 1 2 主坐标排序中可以划分为大类群, 在三维主坐标图中可再细分为 12 个小组第 Ⅰ 类群有 1 份种质, 位于二维坐标图的第 Ⅱ Ⅴ 区, 结合第主坐标,1 份种质又可以分为组第 1 组为世纪甜 () Z-(10) T-2(1) R-2(); 第 2 组为 G-1(12) T-(1) B-2(2) G-2(2); 第组为 R-1 (2) HY-2(2); 第组为 L-2() 红城脆 () 芝麻 (1) C-1(22) Z-(25); 第 5 组为 H-2(11)1 份种质 ; 第

5 22 中国农学通报 1~1 为供试薄皮甜瓜材料编号图 1 份薄皮甜瓜材料的三维主坐标图组为绿麻瓜 (1) 和 L-(20) L-(20) 被分在这一类中, 但与周围其他种质的距离都较远第 Ⅱ 类群共 12 份种质, 位于二维坐标图的第 Ⅲ Ⅳ 区, 结合第主坐标, 分为 2 组第 1 组为 T-1(1) J-2(2) 白沙蜜 (2) J-5(5) L-1() J-() J- (0); 第 2 组为 J-() J-() J-() J-() J-10 () 等 5 份种质第 Ⅲ 类群共份种质, 位于二维坐标图的第 Ⅵ 区, 结合第主坐标, 分为 2 组第 1 组仅为八里香 (15)1 份种质 ; 第 2 组为 T-(1) HY-1(0) L-(1) H-5 (5) L-(1) 等 5 份种质第 Ⅳ 类群共 5 份种质, 位于二维坐标图的第 Ⅰ 区, 结合第主坐标, 分为 2 组第 1 组仅为 J-11()1 份种质 ; 第 2 组为 L-5(1),HY-(2) J-1(2) 及灯笼红 (21) 等份种质比较基于 1 份薄皮甜瓜种质资源的 RAPD 扩增结果建立的聚类图主坐标散点图及三维主坐标图, 发现系统聚类分析与主坐标分析结果相类似, 其中主坐标分析能够更为形象直观全面地体现出 1 份材料之间的遗传相似性关系结论与讨论本试验利用 RAPD 多态性分析结果, 对 1 份薄皮甜瓜材料进行了分析, 成功构建出了甜瓜材料间的系统聚类及主坐标分析图, 试验结果说明将 RAPD 分子标记分析技术用于薄皮甜瓜材料的遗传相似性分析, 可以有效地解释薄皮甜瓜材料间的遗传变异关系, 这一方法完全可以用于薄皮甜瓜遗传多样性分析本试验结果的系统聚类分析和主坐标分析结论近似, 系统聚类分析通过详细的量化信息体现各个材料间的相互关系, 主坐标分析更便于直观地体现薄皮甜瓜种质之间的关系因此, 在研究薄皮甜瓜种质资源遗传多样性时 2 种方法缺一不可, 同时进行系统聚类分析与主坐标分析, 更能全面体现所有材料间的相互遗传关系通过本试验发现, 薄皮甜瓜材料的植物学特征与 RAPD 分子标记分析的结果存在相关性本试验对薄 [] 皮甜瓜种质的划分结果与金基石关于中国北方主要薄皮甜瓜种质资源的研究, 按照果皮颜色分类具有一定正确性的研究结果基本保持一致, 由于本试验未包含灰皮材料, 使其在亲缘关系聚类图中未得到体现将聚类分析及主主坐标分析的结果结合材料来源地综合分析发现 : 在供试的 1 份薄皮甜瓜种质资源材料中, 来自东北三省的 2 份材料具有最为丰富的遗传多样性, 被分别聚类到不同的类群在今后的研究中尚需进一步扩充种质资源的种类和数量, 引种时要兼顾材料的地域来源及植物学特征的多样性, 使其更能代表薄皮甜瓜种质资源的遗传多样性参考文献 [1] 林德佩. 中国栽培甜瓜植物的起源分类及进化 [J]. 中国瓜菜,2010, 2():-. [2] 中国园艺学会西甜瓜专业委员会, 中国园艺学会西甜瓜协会, 中国农业科学院郑州果树研究所. 中国西瓜甜瓜 [M]. 北京 : 中国农业出版社,2000. [] 刘万勃, 宋明, 刘富中, 等.RAPD 和 ISSR 标记对甜瓜种质遗传多样

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AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L 2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis