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死武
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'&!& 基础研究激动剂吡咯列酮对卵蛋白激发气道变应性炎症的调节作用方萍吴晓明李满祥史红阳张永红卢佳美西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科陕西西安 # 生命科学学院陕西西安 #$ 摘要目的探讨过氧化物酶增殖激活受体 %%&' 激动剂吡咯列酮对卵蛋白 & 激发哮喘小鼠气道变应性炎症的作用及机制方法采用 & 激发制备小鼠气道变应性炎症反应模型同时给予 %%&' 激动剂吡格列酮 % 干预采用有创肺功能检查细胞分类计数 )*+,& 以及组织病理学检查等方法观察气道反应性血清免疫球蛋白肺泡灌洗液 -&* 细胞总数分类计数以及细胞因子化学因子和支气管肺组织病理学改变结果 & 可诱导小鼠气道高反应性和嗜酸性粒细胞炎症 -&* 中细胞总数增加嗜酸粒细胞升高血清总 +)+ 以及特异性 +)++. 增加但总 +. 仅轻度升高 -&* 中 +*/+*/+*/#& 和 "0. +/ %/ 均明显增加气道及肺血管周围炎症细胞浸润 %%&'/ 激动剂 % 可部分抑制小鼠气道高反应性 -&* 细胞总数及嗜酸粒细胞百分比增加同时 +*/+*/+*/#&"0. 和 +/ 也被部分抑制 %/ 仅被轻度抑制相应的病理学改变也被部分逆转而血清总的 +)+ +. 以及特异性 +)++. 未见明显变化结论 %%&'/ 激动剂 % 对 & 激发小鼠气道变应性炎症反应具有调节作用关键词 %%&' 哮喘变应性炎症吡咯列酮肺泡灌注液气道变应性炎症细胞因子化学因子中图分类号 ' 文献标志码 & 文章编号 #/$// #!""# "$%& &'&#! #&"&&# &% 23.0/ *+./.,5+50 /. 5& 60 /0 *37./" 8".9"0:'";9.09 ""","0 &:."50;. ".,000: "9;. #"* : -0".+:09.0 ) ""90:;90:)!.0,000:*:",""." "9;. #$. " #"# )* +,-. /%)"#" 0 # #& )###"/%)+0". /%)#&!# #"#",-.# /%) #& 0 "#".# )" "0 ##"#.)#"# $)" #&/%)#""#"0 # #""/%)##. ","'"!)# &&#)##0#" &&)0 " # 0."/%)+"#&),-.#"#)0" "#"&&)0 收稿日期修回日期 # 基金项目国家自然科学基金资助项目 '&$ 中央高校基本科研业务费 '& $". ''$##"'&$""*#" '& 作者简介方萍 $# 女汉族医学博士副主任医师 & 研究方向哮喘及过敏性疾病的基础与临床 & #&# 网络出版时间网络出版地址 000&#&#"&$$&*&&&#&

2 西安交通大学学报医学版第卷 #" # 0# "& 0"#.0 #00,-/%)##.#",",&& ""#,- #0 # ""#"& )*+, )* # +.#"0 ### 支气管哮喘是气道慢性炎症性疾病气道高反应性和可逆性气流阻塞是其主要临床特征哮喘患者的气道炎症具有多种炎性细胞浸润其中以嗜酸粒细胞肥大细胞为主上述炎症细胞激活将会导致一系列前炎症介质和细胞因子释放继而诱发气道高反应性基质血管通透性增加炎症细胞募集以及黏液高分泌过氧化物酶增殖激活受体 "90;0"90:"9/.09/.."9""09/%%&' 是核激素受体超家族成员之一广泛存在于机体的各个器官和组织目前依据编码基因的不同主要分为个亚型 %%&'/ %%&'/ 以及 %%&'/ 其中 %%&'/ 的激活可下调介导炎症反应的多种细胞因子在肺组织中主要表达于气道上皮细胞平滑肌细胞肌成纤维细胞肺血管内皮细胞以及部分炎症细胞例如巨噬细胞中性粒细胞嗜酸粒细胞淋巴细胞以及肥大细胞既往研究提示 %%&'/ 可能参与了气道炎症的调节过程哮喘患者的气道黏膜下组织气道上皮细胞和平滑肌细胞 %%&'/ 表达也较健康人有所增加已有假说提出哮喘患者 %%&'/ 表达增高预示着机体 / 可能存在某种自身调节机制这预示 %%&'/ 激动剂在防治哮喘气道变应性炎症反应方面具有一定应用前景本研究将采用卵蛋白 & 激发制备气道变应性炎症反应模型在此基础上给予 %%&' 激动剂吡格列酮 % 干预探讨其潜在的调节作用及机制 - 材料与方法 -- 动物和试剂,% 级 -. 小鼠只雌性 # 周龄体重 < 购于西安交通大学医学院实验动物中心鸡卵清蛋白 & 级购于,./&9 公司 % 购于日本武田制药公司白细胞介素 +*/ 白细胞介素 +*/ 干扰素 +/ 白细胞介素 #&+*/#& 嗜酸粒细胞趋化因子 "0. 以及巨噬细胞趋化因子 /%/ 的酶联免疫吸附反应检测 )*+,& 试剂盒购于美国 '=8 公司血清总 +) ++. 和 & 特异性 +)++. 检测试剂购自美国 -8 公司 & 特异性 +)++. 检测均采用 & 包被的 )*+,& 专用 $ 孔板 -. 实验分组将小鼠随机分组 %-, 对照组 & 组哮喘模型组 - 组 % 干预组组分别于第天和第 # 天采用 * 含有 & 和氢氧化铝的 %-, 溶液腹腔注射致敏第天采用 *&* 经鼻给药进行攻击干预组于第天至第 # 天开始给予 % * 灌胃对照组均使用 %-, 溶液于最后次攻击后处死动物取血肺泡灌洗液 -&* 及肺组织待测 -/ 有创方法检测哮喘小鼠气道反应性采用 "" 美国有创肺功能仪检测小鼠肺功能在最后次攻击后行腹腔注射麻醉行气管插管有创机械通气采用浓度梯度的乙酰甲胆碱溶液雾化测定给药前后小鼠肺阻力和气道阻力的变化情况 -0 血清收集及细胞分类计数每只小鼠心脏取血约 #*> 放置过夜 9 离心血清移至另一干净 )"09: 管?> 保存待测心脏取血后立即行气管插管支气管肺泡灌洗分次缓慢注入 %-, 液每次 * 缓慢收集将回收的 -&*9 离心收集上清液?> 保存待测细胞沉渣用 *%-, 液重悬取 * 细胞悬液进行离心甩片室温晾干后进行 8:/A! 染色光学显微镜下进行细胞分类计数数个细胞计算 -&* 中各类白细胞百分比另取 * 细胞悬液进行锥虫蓝台盼蓝染色采用血细胞计数板进行细胞计数 - 支气管肺组织病理学检查取小鼠支气管肺组织用 ** 甲醛固定 5) 染色观察气道炎症细胞浸润分别由位研究者采用半定量评分法评价支气管周围炎症细胞的浸润情况 - 血清免疫球蛋白的测定检测血清总 +) 和 & 特异性 +) 时血清标本分别做和倍稀释检测血清总 + 和 & 特异性 + 时血清标本分别做和稀释检测血清总 +. 和 & 特异性 +. 时血清标本分别

3 期方萍吴晓明李满祥等 %%&'/ 激动剂吡咯列酮对卵蛋白激发气道变应性炎症的调节作用 # 做和稀释分别用 +)+ +. 捕获抗体或 & 抗原包被酶标板 > 过夜孵育洗板次 ** 小牛血清 -,& 室温封闭加入待测样品室温孵育洗板次后加入抗小鼠 +)++. 的二抗室温孵育洗板次再加入辣根过氧化物酶 5'% 室温孵育洗板 # 次后加入 - 底物显色液室温避光孵育最后加入终止液内采用紫外分光光度计在处检测吸光度值根据标准曲线计算待测样品浓度总 +) 和 & 特异性 +) 检测时 5'% 与二抗同时加入室温避光共育 -0 中细胞因子及化学因子的测定细胞因子及化学因子测定按照 )*+,& 试剂盒说明书进行依次进行捕获抗体包被 -,& 封闭标准品及待测样品上样室温孵育洗板后加入二抗 * 室温孵育洗板次后加入 * 5'% 室温孵育洗板 # 次再加入底物工作液 -* 室温避光反应加入 * 终止液终止反应在读取值绘制出对应细胞因子浓度标准曲线根据待测样品值计算出样品中待测指标浓度 - 统计学分析采用,%,, 软件进行数据的统计学分析计量资料均以均数 < 标准差 < 表示多组均数比较采用单因素方差分析多重比较采用 *,8/ 检验为差异有统计学意义. 结果.0-2 抑制 ' 激发哮喘小鼠气道高反应性 % 干预组小鼠气道阻力肺阻力在较高浓度乙酰甲胆碱雾化吸入下较哮喘模型组有所降低肺顺应性较相同条件下模型组未见明显变化图图 -2 对哮喘小鼠气道高反应性的影响 ):";0:%0.9."99"..;.".0.2 抑制 ' 激发哮喘小鼠炎症细胞的增殖哮喘模型组小鼠出现了典型的哮喘特征 -&* 中炎症细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比明显增加 % 干预组小鼠 -&* 细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比较对照组有不同程度的增加但其增加幅度均低于哮喘模型组图图.2 对哮喘小鼠细胞总数及白细胞分类计数的影响 ):";0:%0 0.".":"9".0.;." &%-,-&&B%.0/2 对 ' 激发哮喘小鼠血清免疫球蛋白的影响哮喘模型组及 % 干预组小鼠血清 /+) /+ 及 ;/+);+;/+. 较 %-, 对照组均明显升高而血清 /+. 与对照组比较未见明显变化但 % 干预组小鼠血清免疫球蛋白 /+)/+ 及 ;/+);+;/+. 升高幅度与哮喘模型组小鼠比较未见明显差异图

#!O " 西安交通大学学报!医学版 " 第!" 卷图 G"!OP 对哮喘小鼠血清免疫球蛋白的影响!A 7<=H2 3>>>32H? H0 2 > 7ED!

Q 亚型细胞因子及化学因子的影响 "7<= 干预组哮喘小鼠 E8B 中细胞因子及化学因子 CBG & CBG %!

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4 #!O " 西安交通大学学报!医学版 " 第!" 卷图 G"!OP 对哮喘小鼠血清免疫球蛋白的影响!A 7<=H2 3>>>32H? H0 2 > 7ED! $go"% :;8! $g%n"% :;8f7<=! $g%5"' FH "!OP 对 &9" 激发哮喘小鼠 =" 中?Q 亚型细胞因子及化学因子的影响 "7<= 干预组哮喘小鼠 E8B 中细胞因子及化学因子 CBG & CBG %! H F/ 2 CKG! CBG %58 均较对照组明显升高!! #$+ $%"&但升高幅度低于哮喘模型组!!#$+ $""&LM7 G % 两组比较未见明显差异!!$$+ $"&图 &"' 图 "!OP 对哮喘小鼠肺泡盥洗液细胞因子及化学因子的影响 &A 7<=H2E8B. H@ 2 F2-'>H@ 2 > 7ED! $go"% :;8! $g%n"% :;8f7<=! $g%5"' FH K"!OP 对 &9" 激发哮喘小鼠支气管肺组织病理的影响 " 支气管肺组织病理学检查提示& 7<= 可部小鼠气道炎症细胞浸润程度介于对照组和哮喘模型组之间!!#$+ $"&图 ""' 分抑制哮喘模型组小鼠气道炎症反应& 7<= 干预组图 K"!OP 对哮喘小鼠气道炎性细胞浸润的影响 "A 7<=H2 2 F>>F H 2 F H2 >. 7ED% :;8% :;8f7<=% V#半定量评分' $$***+ $$.//0+ ' -./0+ 2%' / )#, )#,

5 期方萍吴晓明李满祥等 %%&'/ 激动剂吡咯列酮对卵蛋白激发气道变应性炎症的调节作用 $ / 讨论已有很多研究表明 %%&'/ 激动剂作为 %%&'/ 受体的配体在许多炎症性疾病如变应性鼻炎银屑病心血管疾病慢性阻塞性肺疾病中发挥着抗炎作用但也有部分研究认为 %%&'/ 激动剂在某些情况下具有促炎作用因此有关 %%&'/ 激动剂对气道变应性 /# 炎症反应的作用及机制研究尚存在争议本研究采用经典的 & 激发方法制备哮喘气道变应性炎症反应模型并分别从组织细胞及分子水平验证模型的可靠并给予 % 干预结果显示 % 可抑制气道高反应性和嗜酸粒细胞炎症但血清中代表免疫反应的特异性 +) 和 + 未受到明显影响而 -&* 中代表免疫反应的细胞因子 +*/+* 以及化学因子 "0. 以及代表 # 反应的细胞因子 +*/#& 受到不同程度抑制其中以 +*/ 为著这种改变与 -&* 中细胞总数嗜酸粒细胞百分比以及细胞因子化学因子改变相平行 % 是噻唑烷二酮类抗糖尿病药物它可激动 %%&'/ 受体发挥相应的生物学效应上述结果提示 %%&' 激动剂对气道变应性炎症具有一定的抑制作用 %%&' 受体广泛表达于机体的各类组织器官与细胞具有广泛的生物学作用已有研究表明它在上皮细胞巨噬细胞树突状细胞等多种组织细胞和免疫细胞均有表达生物学作用涉及呼吸消化泌尿等多个系统我们的研究进一步验证了 %%&' 激动剂在抑制免疫反应的同时对 # 免疫反应也有部分抑制作用后者是近年备受关注的免疫反应的新亚型这与 %&' 等的研究结果一致然而与之研究不同的是我们的实验体系中并未发现 %%&' 激动剂 % 能够明显抑制血清免疫球蛋白 +)+ 的产生分析原因可能与我们采用的 )*+,& 检测方法的敏感性有关但不能完全除外 %%&' 激动剂 % 主要影响淋巴细胞和气道上皮细胞介导的免疫反应的可能而对 - 淋巴细胞介导的体液免疫反应影响较为微弱由此提示在气道变应性炎症反应体系中 %%&' 激动剂可能主要通过抑制细胞增殖和分化以及上皮细胞分泌发挥抗炎效应的并且以局部作用为主但其深入的细胞分子机制仍需进一步探讨可能与抑制炎症反应因子 /- 有关有学者提出 $/ 调节性细胞介导了该作用综上 %%&' 激动剂最早因其对脂代谢的调节作用被广泛应用于糖尿病的治疗近年因其广泛抗炎作用的特点而倍受关注目前已有新一代副作用更小的 %%&' 激动剂如 '$/%7 逐渐进入临床前研究阶段它们具有相似的临床疗效和更小 / 的副作用相信在不久的将来这些新型的 %%&' 激动剂将会在哮喘气道变应性炎症防治方面发挥重要作用参考文献 *2$$3!5! 6$& #"# )*")*. #"#+ #& 5"& )$!!)3&#)* "" "/6&* & )*5$2&#"# #&) & )', &+ # ""# "# #&)*) & -/ 7 3-3&$ # )*""0 # #" 0. *) & 3#& )', & #"#"# # "#&/3" '# $ & #2/%*,!/*!&6 #"#"## 6 "#""" 0 ##&* & )*5$ 5$5! $*& #"#"0# "#0 & $$#& $3)$,))!/*2)!)!5*!//')5)!)! &#"# + "# #& & )', &+ # ""# "# #&)*) & */2$,)',!&## 0 ""0. "&!#$$& )*'$6)$$'89/ $)%$ )**,)*/ %&)* ","# #0#& #$& /' 32!' 3)3'3&)## " #5*$"#" 0 &# ##$ $& 编辑国荣

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