第 期 吴佳等 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子荧光探针高灵敏检测 半胱氨酸 电学性质 光学性质 被广泛地用于生物偶联技术 催化 纳米器件 细胞成像以及生物传感等各个领 ) 域 其中 以蛋白质 氨基酸 为模板合成的荧光纳米粒子 具有不易光漂白 生物相容性好 合成条件温和等优点 比如 双链 稳定的荧

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1 第 卷 第 期 陕西师范大学学报 自然科学版 年 月!" $ "& " "& & " " 文章编号 ) )+- "- 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子荧光探针高灵敏检测 9 半胱氨酸 吴 佳 刘 伟 李保新 陕西省生命分析化学重点实验室 陕西师范大学化学化工学院 陕西西安 ) 摘 要 以聚胸腺嘧啶寡核苷酸为模板分子 利用一步法温和快速合成了稳定性好 荧光性能优异的铜纳米粒子 基于 半胱氨酸能通过巯基高选择性地与铜纳米粒子发生相互作用形成 5 键 从而淬灭铜纳米粒子荧光的现象 建立了测定 半胱氨酸的荧光检测新方法 此方法测定 半胱氨酸的线性范围为 检出限为 可望用于尿液中 半胱氨酸含量的测定 关键词 聚胸腺嘧啶 铜纳米粒子 荧光 半胱氨酸中图分类号 文献标志码 $ $ 9 " "!!!"! $!! " 9"$! A$ " $ A&" ;!" :& 8 " 5 &" "& "& &!" " & 5 &" 5 &" 0" && " 0!" $ "& " 2" )!"5"! " "& & " "&& & & & " &" &7 & 8"& " 0 & & & " &5 &"1& 8 " & && & && & &" & & & & &5 7 && > & & & &" && & 5 5 $ & & ""1& &!& "& " " & 8&&!"8" & &! && & &" & 0& 7" & & " "" < && & &&& 8" 7 & "& && "& & & " & & " " &" &" " & & $! " & & " & & & & &" & 半胱氨酸作为一种重要的生物巯基化合物 在生物体内蛋白质合成 折叠 代谢 解毒及氧化还原 反应等很多过程中起到积极作用 其变化直接反映了生物体的生理状况 半胱氨酸水平较低时可能引起许多健康问题 如造血减少 毛发色素脱失 皮 肤损伤 肝功能损伤和癌症 半胱氨酸还被广泛 应用于各种化妆品和药物制剂中 因此 排除其他氨基酸和类似物的干扰 实现半胱氨酸在环境 药 物和具有高灵敏度和选择性的生物样品或制剂中的检测具有非常重要的意义 目前检测 半胱氨酸 + 的方法主要包括高效液相色谱法 质谱法 电化 ) 学法 比色法 荧光法 化学发光法 然而 这些方法存在检测成本高 消耗时间较长 实验过程繁琐以及需要专业技术人员操作大型仪器等不足 近十年来 贵金属荧光纳米材料由于其独特的 收稿日期 ) 基金项目 国家自然科学基金 ) 第一作者 吴佳 女 硕士研究生 研究方向为纳米材料的光学分析 "7 -" )) 通信作者 李保新 男 教授 博士生导师 ""8!" &

2 第 期 吴佳等 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子荧光探针高灵敏检测 半胱氨酸 电学性质 光学性质 被广泛地用于生物偶联技术 催化 纳米器件 细胞成像以及生物传感等各个领 ) 域 其中 以蛋白质 氨基酸 为模板合成的荧光纳米粒子 具有不易光漂白 生物相容性好 合成条件温和等优点 比如 双链 稳定的荧光铜纳米粒子已被成功应用于各类生物传感器的构 建 主要包括 的检测 小分子的测 定 酶活性的检测 最近 王柯敏课题组报道了聚胸腺嘧啶寡核苷酸作为一种特殊的单链 也可用作模板合成荧光性能优异的铜纳米粒 子 并利用此荧光探针实现了 核酸酶及铜 + 离子的检测 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的荧光铜纳米粒子与其他荧光纳米材料相比 合成方法更为简单快速 室温下即可生成 且合成时间只需 " 双链 稳定的荧光铜纳米粒子因需要进行 ) 链杂交反应 合成时间大于 银纳米簇的合成需要控制温度 还需避光 反应时间相对较长 金纳米簇的合成对实验温度要求很严格 反应时间至少 为 因而 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的荧光铜纳米粒子为生物及化学分析检测提供了新颖的传感平台 本文以聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子作为荧光探针 基于 半胱氨酸能通过巯基高选择性地与铜纳米粒子发生相互作用形成 5 键 从而淬灭铜纳米粒子荧光的现象 建立了测定 半胱氨酸的荧光新方法 实现了对 半胱氨酸的简单 快速 高灵敏 高选择性检测 该方法测定 半胱氨酸的线性范围为 检出限为 考察了可能的干扰组分对该体系的影响 并将该方法已应用于尿液中加入 半胱氨酸含量的测定 实验 仪器和试剂 型荧光分光光度计 " 公司 < 型透射电子显微镜 日本 & 公司 ; 酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司 B+ 漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 吗啉基 丙磺酸 < 抗坏血酸钠购于 "0 公司 半胱氨酸 5 购于国药集团化学试剂有限公司 硫酸铜 5 氯化钠 5 氯化钙 5 5 氯化钾 :5 氯化镁 <05 葡 萄糖购于上海化学试剂有限公司 甘氨酸 苯丙氨酸 & 脯氨酸 丙氨酸 谷氨酸 精氨酸 0 蛋氨酸 <& 亮氨酸 & 酪氨酸 色氨酸 尿素购于阿拉丁试剂 上海 有限公司 聚胸腺嘧啶寡核苷酸 由生工生物工程有限公司合成 纯化方式为 溶解在 < 缓冲液 < 5@ 中 并储存在 所用试剂均未进一步纯化 实验用水均为超纯水 <"" &B+ < 荧光铜纳米粒子的制备及 9 半胱氨酸的检测向 / 溶液中加入 ) < 缓冲液 < 5@ 和 抗坏血酸钠溶 液 最后加入 5 溶液 充分振荡混匀后 室温下孵育 " 以形成荧光铜纳米粒子 5 分别进行荧光光谱测定 在 离心管中 分别加入 以 为模板合成的荧光铜纳米粒子溶液和 不同浓度的 半胱氨酸 充分混匀后 室温下反应 " 后分别进行荧光光谱测量 发射和激发狭缝宽度均为 扫速为 " 平均采样时间为 < 检测电压为 结果与讨论 荧光探针设计 半胱氨酸的检测原理如图 所示 聚胸腺嘧啶寡核苷酸是铜纳米粒子形成的有效模板 且形成的铜纳米粒子具有强的荧光发射 但是 当加入一定量的 半胱氨酸到该传感体系中时 铜纳米粒子的荧光响应强度明显降低 半胱氨酸淬灭铜纳米 粒子荧光的机理仍在探究之中 根据卿志和等的报道 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子形成过程可能是 胸腺嘧啶与 5 首先特异性结合形成络合物 然后由抗坏血酸钠沿着模板聚胸腺嘧啶寡核苷酸的轮廓将 5 还原为铜原子 推测 半胱氨酸淬灭铜纳米粒子荧光的机理可能是 一方面 半胱氨酸与 5 具有很强的结合作用 可形成络 合物 另一方面 相比其他氨基酸 半胱氨酸含 有巯基 可形成 5 键 破坏了铜纳米粒子的结构 从而引起荧光信号的减弱

3 ! B 陕西师范大学学报!自然科学版" 第!! 卷 图 ;! 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子检测 Q 半胱氨酸原理示意图 ;!M 1 & / "" +Q 0!"" &! " -" 0 2B!! 本文在 设 计 序 列 时 选 择 了 JD) 作 为 模 板 合 成 铜纳米粒子 J` 检测及粒径分 布图图 $确 证 了 铜纳米粒子的形成其平均粒径为 & )5 图 D 表 明铜纳 米 粒 子 的 荧 光 性 能 良 好最 大 激 发 波 长 为 D!)5最大发射波长为 "B5图! 为聚胸腺嘧 啶寡核苷酸介 导的铜纳米 粒子 与 "))&5$ "QQ@半 胱氨酸作 用 前 后 的 荧 光 响 应 光 谱 图 当 没 有 Q@半 胱氨酸存在 时铜 纳 米 粒 子 保 持 其 荧 光 特 性加 入 Q@半胱 氨 酸 后铜 纳 米 粒 子 的 荧 光 被 淬 灭在 "B 5 处的荧 光 强 度 明 显 降 低 基 于 以 上 现 象本 文 以聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子为荧光探 针构建了检测 Q@半胱氨酸的新方法 图 <! 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子的透射电镜图" -和粒径分布柱状图" 2 <!BG8 " --! O! 2/ " 1 " -& " 2" +" &! " -" 0 B 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米 粒子激发光谱" -和发射光谱" 2 " /& - -!& " /& " 2" +" &! " -" B 图 A! 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子在 ;FF&" Q Q 半胱氨酸不存在" -和存在" 2条件下的荧光发射光谱 A!G& " -" +" &! " -" B QQ 1-2 " --! " 2" +;FF&"

4 !! 第 " 期!! 吴佳 等&聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子荧光探针高灵敏检测 B? 起了铜纳米粒子荧光的淬灭当反应时间较短时体 <& <! 实验条件优化 根据实验原理检测 胱 氨 酸 传 感 体 系 的 灵 系荧光强度未能达 到 稳 定 值为 保 证 反 应 的 充 分 进 敏度极大程度上取决于聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的 行以及实验结 果 的 准 确 性选 择 B 5 作为铜纳米 铜纳米粒子荧光探针的性质本文考察了铜纳米粒 粒子与 Q@半胱氨酸的反应时间 子的合成条件包括 JD) 的浓 度& S 的浓度&抗坏 方法灵敏度和选择性 在最佳的实验条件下对该方法的灵敏度进行了 [ 血酸钠的浓度以及铜纳 米 粒 子 与 Q@半 胱 氨 酸 的 反 应时间对整个传感体系的影响JD) 作为形成铜纳 米粒子的模板其浓 度 对 铜 纳 米 粒 子 的 荧 光 强 度 有 很大的影响随着 JD) 浓 度 的 增 加铜 纳 米 粒 子 的 荧光强度也逐渐增加JD) 的浓度为")))5$ "Q 时所形成的铜纳米 粒 子 荧 光 相 对 较 强达 到 了 检 测 考察实验结果如图 B/ 所 示当 Q@半 胱 氨 酸 浓 度 在 "Q 范围内时均能不同程度地淬灭铜纳米 D$B)&5$ 粒子的荧光其最大淬灭效率可达 Ai 随着 氨酸加入浓度的逐渐增大荧光强度减小的程度也越 要求更有利于提高 Q@半 胱 氨 酸 检 测 的 灵 敏 度 铜 来越大铜纳米粒子在 "B5 处的荧光强度逐渐降 低根据铜纳米粒子荧光强度变化与 纳米粒子的形成包含 S[ 被还原为铜原 子的过程 度 之 间 的 关 系我 们 建 立 一 种 基 于 荧 光 法 定 量 检 测 随着 S[ 浓度的 增 加荧 光 强 度 也 逐 渐 升 高而 当 G 与 的关系如图 BV 所示其中 ) 和 分别表示不存在和 "Q 时形 成的 铜 纳 米 粒 子 的 S[ 浓度高于?)&5$ "Q 荧光强度略有降低因此 S[ 浓 度 选 择?)&5$ 较为合适抗坏血酸钠作为形成荧光铜纳米粒子的 "Q 范围内时 ) G 与 &5$ 还原剂其 浓 度 达 到 55$ "Q 时荧 光 强 度 最 大 为)& AA?)该荧光方法对 不同浓度的 Q@半胱氨酸刚 加 入 铜 纳 米 粒 子立 刻 引 "Q )& B&5$ 图 H! 不同浓度 Q 半胱氨酸对铜纳米粒子荧光淬灭光谱图" -$荧光强度差值" F ]与 Q 半胱氨酸浓度关系图" 2 H! " - /" & " -" + " -" ) "/ " " " +Q " 2 9 " 1 F ]-! 1 " "" +Q /" N/ "!! 为了进 一 步 探 究 所 设 计 的 荧 光 法 检 测 Q@半 胱 氨酸的选择性本文 考 察 了 体 系 对 其 他 氨 基 酸 的 响 素 以 及 ")GB 5$ "Q /[ &X[ &S/[ &`H[ 均 无 干扰 应情况如 甘 氨 酸&Q@苯 丙 氨 酸& Q@脯 氨 酸& Q@丙 氨 <& A! 样品分析 为 了 进 一 步 考 察 该 方 法 的 实 用 性 及 准 确 性本 酸& Q@谷氨酸& Q@精 氨 酸& Q@蛋 氨 酸& Q@亮 氨 酸& Q@酪 氨酸& "Q Q@半 胱 氨 酸 的 加 入 使 Q@色氨 酸B)&5$ 文将不同浓 度 的 Q@半 胱 氨 酸 加 入 到 稀 释 ")) 倍 的 得铜纳米粒 子 的 荧 光 明 显 减 小淬 灭 程 度 极 大而 尿液样品中将铜纳米粒子作为荧光探针以上述标 "Q 其他氨基酸独自存在于铜纳 米粒子 溶 液 B)&5$ 中对铜纳米粒子的荧光信号强度基本没有影响其 准曲线进行 Q@半胱氨酸含量的检测结果列于表 " 对铜纳米粒子荧光强度变化率为 lbi 同时本文 还考察了尿 液 中 可 能 含 有 的 干 扰 物 质 对 Q@半 胱 氨 在 AB& i $ "))& Ai 之 间相 对 标 准 偏 差 范 围 为 & Bi$B& "i 这 些 结 果 表 明 该 传 感 体 系 对 尿 液 中 酸检测的影 响 "Q 葡 萄 糖& "Q 尿 ")G? 5$ ")G! 5$ Q@半胱氨酸含量的测定具有适用性和可靠性 本方法对尿 液 中 Q@半 胱 氨 酸 加 入 量 检 测 的 回 收 率

5 + 陕西师范大学学报 自然科学版 第 卷 表 尿液中测定加入 9 半胱氨酸含量的分析结果 $ "!! 9"$! 样品 加入量 测得量 回收率 9 编号 / / E E 空白 / / / + ) )+ )+ + ) 结论 本文报道了以聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子为荧光探针检测 半胱氨酸 当 半胱氨酸存在时 铜纳米粒子的荧光被淬灭 依据加入 半胱氨酸前后的荧光信号强度的变化 实现了对 半胱氨酸的定量分析 与常规测定法相比 该方法无需对 进行标记从而极大地降低了检测成本 过程中无须任何洗涤 分离等操作步骤 操作简单方便 同时 整个实验过程在 " 内即可完成 高效快速 此外 该方法还具有较好的选择性 不受其他组分的干扰 方法灵敏度也较高 检出限达到了 已成功应用于尿液中 半胱氨酸含量的测定 在实际应用方面具有较好的前景 参考文献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

6 第 期 吴佳等 聚胸腺嘧啶寡核苷酸介导的铜纳米粒子荧光探针高灵敏检测 半胱氨酸 ) +) ) + + $ 2 BA & & &! " & &" " 8""1& "& & " 8 " & " " & & " 0 "&!& " 0& " & & " 5 &" "& ++) ) A$ 2@ 22A :& $ & " & 0 & & & &" 0" 0 " " &) & & & & & & " & "" " " 0& & " & " 22& 5 && " & & & " & &0 7" " & & " "" 8"" 8 & " 0 " & &" " " " " " " 9 & & " " 5&" + ) )+ $ & "& & " "&& " & & " " & " " 0 & & & " & & & 8& $ & 9 & & " & " & & & & & 8& 8& &&& " & & " 5&" 5 " " $ <& "8" " & & & " &8 & 8& && & & &0 " & & " 5 &" + 8& & & & " & & & & &" " 8& && & & " & " &" & "" ;"& ;"&& " ) 22@ & " & & & && "& " & & & " & 0&7 &5 &"& & " " " ) )) 2 2B & " & & & & & & " & & " "& 8& && & & " " "8" && " 0 " 5 &" B & " 8& &0 & & & " 8 & ""& " & 0& " 7& " & 0& " 5 &" + + ) 2 9$ 9$;9 < 9 & & & "& & & " & " &" " 0&7 &5 &"& & " " " A A$5 $ & & &8 &" & & & " & " " 0 5" & & " & &) 2 9 & 5 8 & & 8& $ & & " 5 &" &" > & " ;"& ;" && " 责任编辑 王 勇

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