复旦学报 医学版 年 月 "- # '#' ' "$##$#$ -2 "!-# # #' # # #$!#.! -( 2"! "- # #$#$ 2 "!-# #$ # #' #-'##$!!##. ## /2%1 ' /" $ '$'-#$ $/#-#$ '! # #'" #$ # # #$ '

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1 复旦学报 医学版 蜂毒素 /" 对裸鼠骨肉瘤的抑制作用与影响肿瘤血管生成 细胞增殖和凋亡的关系 高启龙 李寒冰 姚亚民 陈永强 杨 峰 郑州大学附属肿瘤医院中西医结合科 郑州 河南中医学院药学院 郑州 上海中医药大学附属市中医医院骨伤科 上海 摘要 目的 探讨蜂毒素 '# 抑制骨肉瘤裸鼠移植瘤的作用机制 方法 用 大鼠成骨肉瘤 ) 细胞株建立骨肉瘤原位移植瘤裸鼠模型 将 只裸鼠随机等分为 组 生理盐水组 组和顺铂组 观察各组裸鼠骨肉瘤的体积和体质量抑制率 应用免疫组织化学法检测各组裸鼠瘤体 ( 2 蛋白表达 应用 2%1 法检测肿瘤细胞凋亡 运用相关性分析法研究 抑制骨肉瘤血管生成与细胞增殖 凋亡的关系 结果 组肿瘤体积和体质量抑制率分别为 和 能明显抑制 标记的血管生成密度 能明显抑制肿瘤细胞增殖 促进细胞凋亡 且 抑制肿瘤血管生成与细胞增殖呈正相关及与细胞凋亡呈负相关 结论 具有抑制骨肉瘤裸鼠移植瘤生长的作用 其作用机制可能与其能够抑制肿瘤血管生成 诱导肿瘤细胞凋亡及抑制细胞增殖有关 关键词 蜂毒素 骨肉瘤 血管生成 细胞凋亡 裸鼠 中图分类号 ) 文献标志码 * & ' "! " "/" "" 0 & " 1&/",,&' %2,"& ", 20 ".# 7#. )!# " % &# ' "! & '!% &# '. # "! & 6#. #!# % &# '.# #!! # #$ ##' -# '$' - '#. #! # ' - ' /= #! # ' -##' )&#$ &$#/- '#/ $%"$## ' ' #' "!!## "! "! #$ ' --# # #' #$ ; "$#-#' '#$ #' ' #$ $/## -#' # $.! - ( 2 # / ''$# $ '' #$2%1 '& ### # # #$ '#&!!# $ #-$/#""" "!!# ; /## # 1 " $ '# # #$ $ 国家自然科学基金项目 河南省基础与前沿项目 河南省科技攻关重点项目!"#$%&' ;.; $'

2 复旦学报 医学版 年 月 "- # '#' ' "$##$#$ -2 "!-# # #' # # #$!#.! -( 2"! "- # #$#$ 2 "!-# #$ # #' #-'##$!!##. ## /2%1 ' /" $ '$'-#$ $/#-#$ '! # #'" #$ # # #$ ' / # #$ #$ $/# -"" #! # #' #$ '#!!# $%&'# #'""!!# ' '& &!%" "(:)3#.<. ( ((: (( <'"%1. (( ((- 蜂毒素 '# 是蜂毒的主要成分 具有较强的表面活性 能通过卵磷脂膜和混合膜 研究证 明 对肝癌细胞 骨肉瘤细胞 胃癌细胞等都有明显的抑制作用 我们的前期实验表明 能够抑制裸鼠骨肉瘤的生长 这种作用与抗裸鼠骨肉瘤血管生成有关 本实验我们进一步研究 抑制骨肉瘤血管生成与肿瘤细胞增殖 凋亡的相互关系 为 产品的研发及临床应用奠定基础 材料和方法 实验动物 1& 裸鼠 上海斯莱克实验动物有限责任公司 动物合格证号 = 沪 周龄 体重 " 雌性 在第二军医大学动物实验中心 ( 条件下饲养 试剂 大鼠成骨肉瘤 )& 细胞株由美国麻省总医院提供 蜂毒素 由第二军医大学长海医院中医科实验室提取 纯化 < 冷冻保存 使用时以生理盐水新鲜配制 实验仪器 医学图像定量分析系统 上海求为生物科技有限公司 兔抗鼠 单克隆抗体 美国 2 公司 兔抗鼠 ( 2 单克隆抗体 美国 # ; 公司 即用型 &( 免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 2%1 试剂盒 德国宝灵曼公司 成骨肉瘤 0/1(* 细胞裸鼠胫骨移植瘤模型 建立 分组及给药 参照 $ 提供的方法建模 麻醉裸鼠 消毒 )& 细胞悬液吸入 '1 注射器 针尖对准胫骨下部粗隆部位的骨皮质刺入骨髓腔 注射约 '1 细胞悬液 含 个细胞 接种 大鼠成骨肉瘤 )& 细胞于 只裸鼠的左侧胫骨 将裸鼠等分为 组 生理盐水组 '1 组 " " 顺铂组 '" " 肿瘤长至 ' ' 大小时开始进行瘤内多点注射给药 组与生理盐水组每天 次 天为一疗程 给药两个疗程 两个疗程中间停药 天 顺铂组在第 天给药 共给药 次 给药结束次日处死裸鼠 取瘤 /" 对骨肉瘤裸鼠胫骨移植瘤生长的抑制作用 计算肿瘤体积抑制率 ' $/# # ) 测最长径 和最短径 / 肿瘤体积 #' '/ 肿瘤 ) 对照组 实验组 对照组 计算肿瘤重量抑制率 "$#$/## + ) 剥离肿瘤 比较各组肿瘤重量 #'"$# + 肿瘤 + ) 对照组 + 实验组 + 对照组瘤重 抑瘤效果评价 参照文献 用肿瘤 ) 和 + ) 评价药物抗肿瘤效果 疗效评价标准 ) 为无效 ) 且 为有效 免疫组化检测增殖细胞核抗原 " " ". # 蛋白表达 应用 &( 免疫组织化学法检测各实验组裸鼠瘤体 ( 2 蛋白表达 剥离肿瘤 用 福尔马林固定 脱水 透明 石蜡包埋 切片 二甲苯脱蜡 梯度酒精脱水 漂洗 微波抗原修复 冷却至室温 ( 冲洗 滴加山羊血清室温下封闭 ' 倾去多余液体 滴加 稀释的一抗即兔抗鼠 ( 2 单抗 湿盒内 < 冰箱过夜 滴加 稀释的羊抗兔的第二抗体 显色 蒸馏水洗涤 苏木素复染 常规脱水 透明 干燥 封片 显微镜下观察 以 ( 代替一抗作为阴性对照 阳性染色为棕黄色颗粒 定位于血管内皮细胞的细胞膜和细胞质 ( 2 定位于细胞核 观察染色切片中具有代表意义的高倍视野 以每个视野中的

3 高启龙 等 蜂毒素 对裸鼠骨肉瘤的抑制作用与影响肿瘤血管生成 细胞增殖和凋亡的关系 阳性面积和相应吸光度 值作为结果 免疫组化阳性表达指数 阳性面积比 值 比较各组免疫组化阳性表达指数 肿瘤微血管密度 " %/A2 计 数 肿瘤 计数参照 + 的方法 免疫组化分别检测 蛋白表达 观察经 蛋白染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞群 只要它们与邻近微血管 肿瘤细胞或其他结缔组织分开 就视为一个微血管 同一个血管的 头 和 尾 正好在一个切面上 也作为两个微血管计算 血管腔和红细胞不作为判断血管的标准 先在低倍镜下 观察整张切片的血管分布情况 选择肿瘤区域内微血管最密集的 个区域 即 热点 再在光镜下 计数每个区域内的血管数 记录 个视野不同区域的微血管数 取其平均数作为该例的 值 '0 6 原位细胞凋亡检测 常规石蜡包埋 切片 采用 2%1 试剂盒 2%1 染色阳性物质呈棕褐色颗粒状 结果判定 光镜下以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞 采用 计算机细胞图像分析系统进行阳性表达强度的定量分析 光镜下 随机选 个视野 通过预设采样程序得出阳性细胞数目和总细胞数目 细胞凋亡阳性指数!#.( 阳性细胞数目 总细胞数目 统计学分析 测定结果采用 ( 软件包进行统计分析 所有计量资料均以 + # 表示 进行单因素方差分析 肿瘤 与细胞增殖凋亡之间做! 相关分析 3 为差异有统计学意义 结 果 /" 抑制裸鼠骨肉瘤移植瘤生长 裸鼠胫骨接种 )& 细胞约 天 成瘤率 肿瘤长至直 径 ' 左右 瘤体呈椭圆或圆形 表面有结节 组织学检查证实为成骨肉瘤 实验过程中还观察到经 处理的裸鼠行动自如 反应灵敏 食欲良好 体重增加 与生理盐水组无明显区别 生理盐水组瘤体积为 ' 瘤质量为 " 组瘤体积为 ' 瘤质量为 " 顺铂组瘤体积为 ' 瘤质量为 " 组的瘤体积抑制率为 瘤质量抑制率为 与其他两组相比差异具有统计学意义 3 图 图 /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤生长的影响 6/" &! /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤 /A2 的影响 肿瘤组织内的血管内皮细胞呈棕色或棕黄色 组及顺铂组 明显低于生理盐水组 3 表 图 图 表 /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤 /A2 的影响 '! 6/" /A2! + # 0! & & 2 '1 " " ( '" " &# 2 "! ' #(! # 图 /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤 2 /A2 的影响 8,( 6/"2 /A2! 8,( $ # $#$##' - &(&# # "! $ $ $$ ## '!#$ #$# #'.! -#'-' &# # "! '1 +.! - #'- &# # "!" " +.! -#'-(&# # "!'" "

4 复旦学报 医学版 年 月 图 /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤 2 (, /A2 的影响 8,( 6/"2 (, /A2! 8,( $ # $#$##' - &(&# # "! $ $ $$ ## '!#$ #$# #'.! -#'-' &# # "! '1 +.! - #'- &# # "!" " +.! -#'-(&# # "!'" " /" 对裸鼠胫骨原位骨肉瘤. # 的影响 处理后 各组骨肉瘤细胞 ( 2 表达量均有所降低 与生理盐水组相比差异有统计学意义 3 表 图 表 /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤. # 的影响 '! 6 ". # 0! ( 2 2 '1 + # # " " ( '" &#32 "! 332 2' # (! # '0 6 法检测细胞凋亡 光镜下观察 对照组仅个别视野可见自发凋亡细胞 经 处理的各组均有凋亡细胞出现 可见到细胞核浓缩 染色质凝集 呈圆形或新月形 体积变小 细胞核被标记成棕黄色 表 图 表 '0 6 法检测 /" 诱导裸鼠骨肉瘤组织细胞凋亡 '! /" "!%'0 6% + # 0!!!#. 2 '1 " " ( '" " &#32 "! 332 2' #(! # 图 :/" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤细胞. # 表达的影响 8,( :6/". #! 8,( $ # $#$##' - &(&# # "! $ ( 2!#.! $ $$ ## '!#$#$# #'.! -( 2 #'-' &# # "!'1 +.! -( 2 #'- &# # "!" " +.! -( 2 #'-(&# # "!'" " 图,'0 6 法检测 /" 对裸鼠胫骨骨肉瘤移植瘤细胞凋亡的影响 8,(,/""!!%'0 6%8,( $ # $#$##' - & (&# # "! $$"$!!# #$ $$ ## '!#$#$# #' $!!# # #'-' &# # "!'1$ $"$!!# # #'- &# # "!" "$ $"$!!# # #'-(&# # "!'" "

5 高启龙 等 蜂毒素 对裸鼠骨肉瘤的抑制作用与影响肿瘤血管生成 细胞增殖和凋亡的关系 /" 抑制裸鼠骨肉瘤血管生成与肿瘤细胞凋亡 增殖的关系 显微镜下观察可以看到生理盐水组血管密度较高 坏死细胞较少见 多为小灶性坏死或凋亡 组血管密度降低 凋亡或坏死细胞明显增多 多为片状坏死 统计学分析显示 抑制血管生成与诱导肿瘤细胞凋亡之间存在负相关 相关系数 33 抑制血管生成与骨肉瘤细胞增殖之间存在正相关 相关系数 3 3 讨 论 肿瘤血管生成是实体肿瘤赖以生存的微循环模式 能为肿瘤提供各种养分 促进肿瘤的生长和转移 血管生成贯穿了骨肉瘤生长 侵袭和转移的全 过程 肿瘤细胞凋亡与血管生成呈显著负相关 高度血管化的肿瘤其凋亡指数显著低于低血管化肿瘤 提示诱导血管生成可能导致肿瘤细胞凋亡抑 制 因此 阻断血管生成可促进肿瘤细胞凋亡 最终抑制骨肉瘤生长及转移 是评价肿瘤血管生成的量化指标 可以通过对血管内皮细胞不同分子标记进行染色来检测 是一种泛血管内皮细胞标记物 主要定位于血管内皮细胞的细胞膜和细胞质 是一种相对分子质量为 的同源二聚体跨膜糖蛋白 其存在于血管内皮细胞膜和细胞质 是 0& 受体复合物的组成部分 是 0& 的附属受体 能与多种 0& 超家族成员结合 是内皮细胞增殖相关膜抗原 在培养的高增殖活性内皮细胞和许多恶性肿瘤组织血管内皮细胞中高表达 参与血 管生成 仅在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞上强表达 而在正常组织的血管内皮细胞上较少表达或不表达 因此 以 作为新生血管标记物易于区分肿瘤边缘的新生血管与正常 血管 能够辨明 对血管生成的抑制作用针对的是肿瘤诱导的新生血管 而不是肿瘤组织边缘的那些已经存在的血管 本研究结果显示 可以明显降低裸鼠骨肉瘤的血管密度 及新生血管密度 有关 诱导肿瘤细胞凋亡的体外研究很多 有研究发现 能通过插入 0 骨肉瘤细胞等肿瘤细胞膜内形成孔道 细胞膜 1 型 通道开放 引起 内流 使细胞内 浓度升高 导致 细胞凋亡 $ 等报道 诱导肺癌细胞凋亡与增加. 蛋白表达 激活半胱氨酸蛋白酶有关 另外 对人神经胶质瘤细胞 和 细胞 大鼠主动脉血管平滑肌细胞均有诱导凋亡作用 可以降低 通路的磷酸化诱导人白 血病 细胞调亡 陈永强等发现 对骨肉瘤 细胞株的增殖具有较强抑制作用 起效迅速 可下调 ( 2 的表达 阻止 期细胞进入 0 期 产生 期细胞阻滞 最终促进细胞凋亡 但这些都停留在体外研究阶段 没有进行更深入的体内研究 为了进一步研究 抗肿瘤作用及其机制 我们构建了裸鼠原位骨肉瘤移植瘤模型 在预实验中发现 高剂量 " " 组主要通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞 诱导肿瘤细胞凋亡和坏死 从而发挥抗肿瘤的效应 但是高剂量 有导致溶血的危险 而低剂量组 " " 没有明显的抗肿瘤效应 中剂量组 " " 则具有明显的抗肿瘤效应且无不良反应 因此我们选择中剂量组进一步研究 的体内抗肿瘤机制 本结果表明 在 体内具有明显的抗肿瘤效应 与凌昌全等报道的对皮下荷 肝癌小鼠的治疗结果一致 本实验还发现 抗裸鼠骨肉瘤作用与其抑制血管生成有 关 这与宋长城等发现的 通过下调 %0 和 /0 的表达抑制裸鼠肝癌移植瘤血管生成进而抑制肿瘤生长一致 本实验中 2%1 检测结果表明 组肿瘤凋亡指数明显高于生理盐水组 抑制血管生成与诱导细胞凋亡的相关性分析显示 肿瘤血管新生与细胞凋亡呈负相关 本实验还发现 组 ( 2 表达指数较生理盐水组显著降低 在相关性分析中 我们用 标记的新生血管密度与 ( 2 进行分析 发现肿瘤新生血管生成与细胞增殖成正相关 表明 不但可以明显降低骨肉瘤内的整体血管密度 还可以明显减少肿瘤所诱导的新生血管数量 从而减少裸鼠胫骨骨肉瘤的血液供应 导致骨肉瘤细胞凋亡或坏死 抑制骨肉瘤的生长 另外 在本研究中 抑制血管生成能力比顺铂强 但抑制肿瘤生长能力比顺铂弱 分析原因可能是小剂量 直接抑制肿瘤细胞增殖 诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的能力不如顺铂 综上所述 抑制骨肉瘤血管生成与骨肉瘤

6 复旦学报 医学版 年 月 细胞增殖呈正相关 与细胞凋亡呈负相关 提示 的抗肿瘤作用与其抑制血管生成 减少肿瘤血液供应 抑制骨肉瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡等有关 参 考 文 献 张晨 李柏 吕书琴 等 蜂毒素对人肝癌细胞线粒体膜蛋白 和凋亡相关基因产物 及其配体 表达的影响 中西医结合学报 高启龙 陈永强 李柏 等 蜂毒素对成骨肉瘤血管生成拟态的抑制作用及对 & 和 (& 蛋白表达的影响 肿瘤 李爱剑 梁枫 蜂毒素对人胃癌 0 细胞生长抑制作用的实验研究 中国中医急症 $ 1( 1 $.! - #$! '" ## # ' ' ### ' #' # )$0!" #$! -# '. #! #'- $' "). " +1' ( + $ +) ' "" ' ## # / # ' (*, ' #0 -"" - #!# # #$ ' #0 ) ( $ -# - # #$/# " %0 1.!!!# ' ' #$ &#,!' 2 #0 /"''$# $ ' # - #$ ' # #$"$ #$.! - 0&/ # "!#.! - #$ #$ " #$ - # %0 " " ' (" ' 00 '1 %1 " ' # &-# # #.! /# # # #$ " #$- # &.! )# $ $ " " ($!$!&!# # / #!!# / '#$' 0#' - $ ' + '!!## #$/ '##$"$ #-. ##-!!# $' "', )" + 杨志林 柯以铨 徐如祥 等 蜂毒肽对人神经胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用 南方医科大学学报 " #$/# '#$ '! - # #$"$ # -!!#!! - - #&!! # ## $' # -!!##!#.!, *+. (, $,# &! &&!#!!# #$"$ & " #-#!$!$#$''.+ 陈永强 朱振安 郝永强 等 蜂毒素诱导骨肉瘤细胞 凋亡与坏死的实验研究 中西医结合学报 凌昌全 李琦 刘晓华等 颈动脉灌注蜂毒素 & 聚乳酸 羟乙酸微球治疗大鼠肝肿瘤 世界华人消化杂志 宋长城 吕祥 程彬彬 等 蜂毒素对人肝癌 & 细胞裸鼠皮下移植瘤生长及肿瘤血管生成的影响 癌症 收稿日期 编辑 王蔚

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