378 WORLDCHINESEMEDICINE February2017,Vol.12,No.2 大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 发病率和病死率逐年上升 [1 2] 目前, 大肠癌的治疗多以手术治疗为主, 但大多数患者发病时已属晚期, 治疗及预后不佳 中医药在防治大肠癌的复发转移及改善患者生存质

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1 世界中医药 年 月第 卷第 期 实验研究 云南藤黄提取物对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的 抑制作用及其机制研究 段琳琳 隋 华 朱 蕾 张 莉 谭红胜 上海中医药大学中药学院上海 中药创新药物研发上海高校工程研究中心上海 上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科上海 昌吉州中医院内四科昌吉 摘要 目的 探讨云南藤黄提取物抑制裸鼠大肠癌植性实体瘤的作用机制 方法 建立裸鼠人结肠癌皮下移植瘤模型随 机分为 模型对照组 阳性对照组 氟脲嘧啶 云南藤黄提取物低 中 高剂量组 连续治疗 于末次给药后 剥 取肿瘤称重计算抑瘤率 并检测肿瘤细胞凋亡情况 免疫组化法检测肿瘤组织中 E M 和 RNPK的表达 结 果 云南藤黄提取物低 中 高剂量对肿瘤的抑瘤率分别为 和 与空白对照组相比差异有统计学 意义 P 肿瘤细胞凋亡率增加并且随着云南藤黄提取物浓度的增加而增加具有剂量依赖性 P 云南 E M 和 RNPK的表达具有剂量依赖性 P 结论 云南藤黄具有 藤黄提取物能明显降低肿瘤组织中 较好的体内抗肿瘤作用可能是通过降低 E M 和 RNPK的表达抑制肿瘤细胞在体内增殖 关键词 云南藤黄 大肠癌 裸鼠 凋亡 E M RNPK I E G Y E S I T H C C NM I M D L S H Z L Z L T H S P S U T C M S C E R S C D M O C S C TCM N wd D S H S U T C M S C N D I M C H T C M X U A R C A O T M A w w F w A w w w w C E M RNPK w R T w w w w w T w w P w w P G E M RNPKw P C G E M RNPK K W G C N A C E C M H RNPK 中图分类号 R 文献标识码 A 基金项目 国家自然科学基金面上项目 编号 藤黄属植物抗肿瘤活性成分及其作用机理研究 国家自然科学基金青年项目 编号 怒江藤黄中 N A抗肿瘤作用机制研究 新疆自治区科技支疆项目 编号 作者简介 段琳琳 女硕士研究生研究方向 中药活性成分研究及新药开发T E 通信作者 谭红胜 女博士研究生副研究员研究方向 中药活性成分研究及新药开发T E

2 378 WORLDCHINESEMEDICINE February2017,Vol.12,No.2 大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 发病率和病死率逐年上升 [1 2] 目前, 大肠癌的治疗多以手术治疗为主, 但大多数患者发病时已属晚期, 治疗及预后不佳 中医药在防治大肠癌的复发转移及改善患者生存质量方面具有较好的治疗优势 [3 4], 但临床治疗效果个体差异较大, 作用机制和作用靶点仍有待进一步明确 我们前期研究表明云南藤黄及其提取的单体成分具有对大肠癌抗凋亡作用 [5], 但是云南藤黄抗大肠癌的作用机制仍不明确 因此, 我们建立裸鼠人结肠癌皮下移植瘤耐药模型, 采用云南藤黄提取物进行治疗, 观察其对裸鼠人结肠癌的治疗效果, 旨在探讨云南藤黄提取物体内抑制大肠癌的作用机制, 为其在临床应用提供实验依据 1 材料与方法 1 1 材料 细胞株人肠癌 SW620 细胞购自上海细胞研究所 动物 Babl/c/nu 代小鼠 30 只, 雄性, 体质量 (18±2)g,SPF 级, 购自中科院动物实验中心, 合格证编号 :SCHK( 新 ) 实验前在实验室常规饲养 1 周 药物云南藤黄 (Garciniayunnanensis) 采集于中国云南省, 由中国科学院西双版纳热带植物园王洪教授鉴定, 样品保存在上海中医药大学创新中药实验室 云南藤黄的果皮经剥离粉碎成粗粉, 取 100g 果皮粗粉, 用 500mL95% 乙醇于室温浸泡 24 h 后,90 加热回流 3 次, 第 2 次与第 3 次均为 500 ml, 每次 1h 合并 3 次滤液, 浓缩至浸膏 实验前定量称取, 紫外线照射灭菌, 无菌蒸馏水溶解,4 冰箱保存备用 试剂 5 氟脲嘧啶 (5 FU) 为上海旭东海普药业有限公司生产 ( 批号 : ), 抗体, 四甲基偶氮唑盐 MTT 购自 Sigma 公司 1 2 方法 细胞培养人肠癌 SW620 细胞于含 10% 胎牛血清的 L 15 培养液 ( 含青霉素 链霉素各 100(U/ ml) 中,37 5% CO 2 饱和湿度培养箱中常规培养 每 2~3d 传代 1 次, 取对数生长期细胞用于实验 模型制备与分组取对数生长的人肠癌 SW620 细胞, 以 / 只数量接种于小鼠腋下 7 ~10d 后形成肿瘤, 生长旺盛期的瘤组织剪切成 1 mm 3 左右, 在无菌条件下, 接种于小鼠右侧腋窝皮下, 如此传 3 代后, 大批接种裸鼠腋下, 待瘤体生长约 100mm 3 随机分为 5 组 给药方法 每组 6 只, 分别为模型组, 阳性 对照 (5 FU) 组, 云南藤黄提取物低 中 高剂量联合 5 FU 组 云南藤黄提取物低 2 56mg/(kg d) 中 5 12mg/(kg d) 高 10 24mg/(kg d) 剂量组分 别每只灌胃,5 FU 组尾静脉注射 0 5mg/(kg d) 的 5 FU, 模型组每天注射等量的生理盐水, 连续给药 28d 后, 每组中随机取 6 只荷瘤裸鼠以颈椎脱臼法 处死, 剥离肿瘤组织, 称重, 测量肿瘤长 宽及质量 计算抑瘤率 : 抑瘤率 (%)=( 对照组平均瘤质量 给 药组平均瘤质量 )/ 对照组平均瘤质量 100% 检测指标与方法 免疫细胞化学法检测 Ki 67 蛋白的表达水平在 LNCaP 组织采用中性福尔 马林 4 过夜固定, 进行常规的石蜡包埋并切片 表面抗原修复后孵育一抗 hnrnpk,cycline1 和 c Met(1 500) 并在 4 过夜 ; 室温放置 10min, 孵育二 抗 30min 后, 与 HRP 生物标志链反应 ; 苏木素染色 5~20min, 蒸馏水冲洗 2min, 盐酸乙醇分化 15s 后 蒸馏水冲洗泛蓝 5min; 脱水后以中性树脂封片, 晾 干, 置于显微镜下拍照观察 1 3 统计学方法 采用 SPSS13 0 统计软件包处 理数据 各组数据采用均数 ± 标准差 ( 珋 x±s) 表示, 两独立样本均数比较, 采用 Independent SamplesT Test, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 均数间 两两比较采用 SNK q 检验 (Student Newman Keuls 法 ), 求出组间差异 以 P<0 05 为有统计学意义, P<0 01 为有显著统计学意义 2 结果 2 1 云南藤黄提取物对大肠癌 HCT 116 细胞裸鼠 移植瘤生长情况的影响 给药前用游标卡尺测量给 药前各组小鼠肿瘤体积大小, 各组之间差异无统计 学意义 (P>0 05) 给药 1 周各组瘤体差别不明 显, 进食饮水如常, 随给药时间延长, 各组瘤体大小 逐渐出现差距, 在用药 24d 开始, 各组瘤体体积差 异有统计学意义 其中, 阳性对照组和云南藤黄提 取物高剂量组的瘤体体积相比, 有明显的缩小, 差异 有统计学意义 (P<0 01) 但是云南藤黄提取物各 剂量组对肿瘤的抑制作用不如阳性对照组 提示云 南藤黄提取物可以抑制裸鼠肠癌皮下移植瘤的生 长, 且呈剂量依赖性 2 2 云南藤黄提取物对大肠癌裸鼠皮下移植瘤抑 制率的影响 依表 1 可见, 云南藤黄提取物各个剂 量组和 5 FU 组的皮下移植瘤质量均低于模型对照 组 (P<0 05),5 FU 组的抑瘤率最高, 云南藤黄提取 物剂量组随云南藤黄取物剂量的升高, 抑瘤率逐渐

3 世界中医药 年 月第 卷第 期 升高呈剂量依赖性 云南藤黄提取物对裸鼠移植瘤组织细胞内 E M 和 RNPK的影响 治疗后模型对照 组肿瘤组织中 E M 和 RNPK的表达阳 性率均高于治疗组 P 阳性对照组中 RN E和 M 的表达与模型对照组无统计学 PK 意义提示 FU对大肠癌 SW 裸鼠皮下移植瘤 的抑制作用可能与 RNPK E和 M 无关 但是与 对 照 组 相 比云 南 藤 黄 提 取 物 各 剂 量 组 的 RNPK E和 M 的表达明显低于模型对 照组且成剂量依赖性 P 提示云南藤黄提 图 云南藤黄提取物对瘤体大小的影响 取物能够降低大肠癌 S W裸鼠皮下移植瘤组织 表 云南藤黄提取物对各组大肠癌裸鼠皮下移植 珋± 瘤质量及抑瘤率的影响 内 E M 和 RNPK的表达 结果见图 组别 瘤质量 模型组 ± 云南藤黄提取物低剂量组 ± 云南藤黄提取物中剂量组 ± 云南藤黄提取物高剂量组 ± ± 阳性对照组 FU 表 表 表 抑瘤率 P 注 与模型组比较 P 云南藤黄提取物对大肠癌裸鼠移植瘤组织中 细胞凋亡 的 影 响 TUNEL检 测 显 示 与 模 型 组 相 比阳性对照组中肠 癌 组 织 细 胞 凋 亡 率 最 高 P 云南藤黄提取物剂量组肿瘤组织中肠癌组织 细胞凋亡率明显高于模型组 P 见图 图 图 结果显示云南藤黄提取物治疗的裸鼠其 图 免疫细胞化学法检测 E M 云南藤黄 肿瘤内凋亡的细胞明显增加 P 和 RNPK蛋白的表达水平 提取物低 中 高剂量组与阳性对照组 FU 相比 凋亡细胞均明显减少且具有剂量依赖性云南藤黄 讨论 目前在 多 种 肿 瘤 中 均 可 发 现 细 胞 周 期 素 E 提取物低剂量组与高剂量组相比差异有统计学意 C E 的基因扩增和蛋白表达失调C E的 义 P 异常表达可促进肿瘤的发展该基因已经被证实是 E的过度表达与大 一种癌基因 有报道称C 肠癌的恶性程度和预后密切相关 抑制 C E的 S期限制点的转 表达可以通过抑制细胞周期在 G 化阻滞细胞周期控制肿瘤发生发展 图 各组裸鼠肿瘤细胞凋亡率的影响 M 属于具有酪氨酸激酶活性的生 原癌基因 长因子 受 体 类编 码 肝 细 胞 生 长 因 子 H G w F HGF 受体它参与细胞信息传导 细 胞骨架重排的调控是细胞增殖 分化和运动的重要 因素 目前研究表明 M 基因在大肠癌组织 中的表达明显高于大肠腺瘤组织和正常大肠黏膜组 织且与肿瘤的浸润深度 Dk 分期 淋巴转移及 远处转移密切相关提示 M 的过度表达在大肠 图 云南藤黄提取物对各组大肠癌裸鼠 皮下移植瘤细胞凋亡率的影响 腺瘤发 展 至 大 肠 腺 癌 的 过 程 中 可 能 发 挥 一 定 作 用

4 380 WORLDCHINESEMEDICINE February2017,Vol.12,No.2 表 2 cycline1 蛋白在各组大肠癌裸鼠皮下移植瘤阳性表达情况 [n(%)] 模型组 云南藤黄提取物低剂量组 云南藤黄提取物中剂量组 阳性对照组 (5 FU) 表 3 c Met 蛋白在各组大肠癌裸鼠皮下移植瘤阳性表达情况 [n(%)] 模型组 云南藤黄提取物低剂量组 云南藤黄提取物中剂量组 阳性对照组 (5 FU) 表 4 hnrnpk 蛋白在各组大肠癌裸鼠皮下移植瘤阳性表达情况 [n(%)] 模型组 云南藤黄提取物低剂量组 云南藤黄提取物中剂量组 阳性对照组 (5 FU) hnrnps 是存在于细胞核中, 由 30 多个蛋白质小分子组成的一种 RNA 结合蛋白族 [12] 在调节转录 前体 mrna 剪切 mrna 输出和降解等方面起着重要的作用 [13] hnrnpk 是该家族中的一员, 与多种癌基因及生长因子有密切的关系 [14] 课题组前期研究发现 : 从中国藤黄属植物怒江藤黄 (Gar cinianujiangensisc Y WuetY H Li) 中分离的化合物 NujiangexanthoneA(NJXA) 通过下调宫颈癌细胞 HeLa 中 hnrnpk 和 CyclinE 的表达, 从而抑制肿瘤细胞的合成 死亡以及细胞周期的改变 [15] 云南藤黄为其同属植物, 且已证实云南藤黄及其提取的单体成分具有对大肠癌抗凋亡作用 [5], 其单体成分 OblongifolinC 对 c Met 蛋白激酶具有较好的抑制活性 [16], 但对大肠癌体内的研究目前尚未开展, 因此本实验旨在探索云南藤黄对大肠癌裸鼠实体瘤的抑制效果以及具体的作用机制 云南藤黄 (GarciniayunnanensisHu) 为中国藤黄属植物, 又名小姑娘果, 是我国特有种, 分布于云南省西南部, 生于海拔 1300~1600m 丘陵 坡地的杂木林中 其果实成熟后味酸甜, 当地民族喜食用 [17] 现代研究表明, 云南藤黄所含化合物具有抗 肿瘤和抗炎活性 [18 19] 近年来, 本课题组对云南藤黄进行了系统的抗肿瘤活性成分研究, 提取并发现了多个具有显著抗肿瘤活性的化合物 体外实验表明, 云南藤黄中的有效成分对多种肿瘤细胞具有抗癌活性, 包括人肝癌细胞 (HepG2 细胞 ) 人结肠癌细胞株 (HCT116 细胞 ) 人乳腺癌细胞株 (MCF 7) 以及小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) [20 27] 本研究旨在建立大肠癌裸鼠皮下移植瘤动物模型的基础上, 探讨云南藤黄对大肠癌的抑制效果及其作用机制 本实验结果显示, 模型对照组与治疗组在裸鼠体重 生活质量方面无明显差异 治疗前 3 周, 模型对照组与云南藤黄各剂量组瘤体大小差异不明显, 无统计学意义 进入第 4 周后, 随给药时间延长, 各组瘤体大小逐渐出现差距, 在用药 28d 时, 云南藤黄各组呈现剂量依赖性的抑制肿瘤的生长 (P< 0 01) 该结果与课题组前期的体外实验结果一致, 说明云南藤黄能够抑制人大肠癌肿瘤细胞的生长 TUNEL 结果显示, 云南藤黄对裸鼠肿瘤细胞的凋亡也具有抑制作用, 且成剂量依赖性 此外, 本研究结果还显示, 大肠癌 SW620 裸鼠皮下移植瘤组织内 cycline1,c Met 和 hnrnpk 的表达较高, 给予云

5 世界中医药 年 月第 卷第 期 南藤黄治疗后其表达明显下降 P 提示 云南藤黄抑制大肠癌的生长可能与调节 E M 和 RNPK三者相关 说明云南藤黄可能是通 E M 和 RNPK等蛋白的表达抑 过下降 制大肠癌的生长 G TB DT V T RNP H G B PF NB C E K RNPK C L 综上所述本研究在前期证实云南藤黄及其有 C MB RB O R 效成分具有抗肿瘤的基础上发现云南藤黄提取物 AKT RNPK AR β 可以抑制人肠癌皮下移植瘤的生长增加肿瘤抑制 I JC 率诱导肿瘤细胞凋亡 并且以剂量依赖的方式降 低 E M 和 RNPK蛋白的表达 因此 明确云南藤黄在人肠癌中的作用及具体机制将是 我们今后需要深入研究的方向鉴于其来源于植物 在当地具有可食用 不良反应小的临床使用价值 后期研究云南藤黄抗肿瘤活性的靶向性将是我们进 一步需要深入探讨的课题 参考文献 O K SJ D N R G H P CJ K MV L F N R C O S HZHRWJ E J J R P COX w C JI M S HP S FF Y Z J W P PI K Ak NF κb w BMCC A M LHM XXZ L O C K G A P S 张百蕾武栋成 NI RF蛋白和 C E在细胞周期调控及肿瘤发 生中的作用 中国肿瘤 杨宏梅郑美珍刘云鹏 COX C E的表达与大肠癌临床病 理因素关系的研究 临床肿瘤学杂志 W YYHZ J H H L w BMCC S HA MK HS I GFR B P Z J J XJ Y R VEGFR M EJM C 姜英俊孔心涓张可爽等 M 在大肠癌中的表达及在大肠 癌发生发展中的作用 山东大学学报 医学版 Z LF J K S N A G w C L RNPK W LWRFW S M O C M B C 中国科学院昆明植物研究所 云南植物志 M 北京 科学出版 社 付文卫谭红胜徐宏喜 中国产藤黄属植物中抗肿瘤活性化学 成分的研究概况 药学学报 LYC ST H I C M C B XGF CZ Y B G H JA F C W XL YXN O C k S R S KXZX J G K O XWC ML Y DNA ER C k B B k B B R C L YW GL Z T C A WML YXN G K P F CZ LYYT A w C w H L B I JC XZY MLY G K FBXW MYC C D D 收稿 责任编辑 洪志强

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