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1 复旦学报 医学版 全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶中 选择素及 ;- 表达的影响 张玉保 董果雄 张社华 山东省青岛大学医学院附属医院心内科 青岛 山东省青岛大学医学院实验中心 青岛 摘要 目的 观察全反式维甲酸 ( 对兔颈动脉粥样硬化病灶中内膜增殖和 %% 选择素及 6% 表达的影响 方法 新西兰雄性大白兔随机分为 组 假手术组 对照组 治疗组 假手术组给予普通饮食并分离暴露颈动脉但不损伤内膜 对照组给予高脂饮食 动脉内膜空气干燥术损伤颈动脉内膜 治疗组给予 ( 灌胃 其余操作同对照组 分别于术后 天处死 组动物 取病变血管进行形态学观察及测定 采用免疫组化法检测 %% 选择素及 6% 表达水平 结果 假手术组未见内膜增生 % 及 % 选择素仅有微量表达 未见 6% 表达 对照组术后 天内膜开始增生 天时内膜增生明显 管腔狭窄 管壁有粥样斑块形成 %% 选择素及 6% 有多量表达 治疗组内膜增生较轻 和 天时内膜面积显著低于对照组 均 %% 选择素及 6% 阳性表达指数也显著低于对照组 均 结论 ( 能明显抑制粥样硬化病灶中内膜增殖 其机制可能是通过抑制 % 的激活和表达 下调 % 的靶基因 % 选择素及 6% 的表达从而抑制炎症过程 关键词 维甲酸 动脉内膜 炎症 核因子 血管细胞黏附分子 % 选择素 兔 中图分类号 ( 文献标志码 %%( #% (;-%%%&& ;) /%- ) )% ;)#%# - %& & %& & &%&-"#%" " ("# &""# %%"6%"#" --" ( ;--" &" #&% " " "" # --" ## #&%" "#"#" "#""#&#" "# ###"# -"""#""#-"" #"" &"(-"#& "# & "#" # --" "# "" " # "" &" #"##&"-" " &&#"#&"""""# %%"6% "# #&%" &" ""# % %" &# 6% "-"# "# " &" """ " "# "#" " # %%" 6%" "" "#"" "# &"" " "#"#"# "#%&-

2 复旦学报 医学版 年 月 " "# %%"6% #" #"#"(#-"&" "#" --" "# -&#& "#"(#-" "#" %"# "# %"6%##"- %"# ""#-" "#&&" )%("""&&"%6%%"--" 炎症反应在再狭窄 尤其是支架置入术后再狭窄的发生 发展过程中起着重要作用 故抗炎治疗有 可能对预防再狭窄有效 既往研究发现全反式维甲酸 %" "( 能通过抑制血管平滑肌细胞增殖信号传导途径而抑制平滑肌细胞 增生 但其对动脉粥样硬化斑块形成中炎症反应的抑制作用却少有报道 随着对再狭窄分子机制的深入研究 人们发现参与再狭窄过程中的许多分子特别是多种黏附分子如 % 选择素 % 选择素 血管细胞黏附分子 %6% 细胞间黏附分子 % % 等都受到核因子 " % 的调控 本文旨在通过建立兔动脉粥样硬化内膜损伤模型 观察 ( 对动脉粥样硬化病灶中内膜增殖的抑制作用 研究其对 % 及其靶基因 % 选择素和 6% 表达的影响 探讨其通过抑制炎症反应减轻内膜增殖的机制 为动脉粥样硬化及再狭窄的药物防治提供理论依据 材料和方法 材料 健康新西兰雄性大白兔 只 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 许可证号 鲁 月龄 体重 ( 山东良福制药有限公司 胆固醇 上海如吉生物科技发展有限公司 %% 选择素 6% 多克隆抗体浓缩型 武汉博士德公司 6% 二步法免疫组化检测试剂盒 北京中杉金桥 奥林巴斯 显微镜 &% 图像分析系统 动物分组及模型制作 只新西兰大白兔随机分为 组 假手术组 治疗组 对照组 每组 只 假手术组每日每只喂养 基础饲料 对照组和治疗组每日进食 高脂饲料 猪油 胆固醇 基础饲料 均自由饮水 喂养 周后假手术组分离暴露血管但不损伤内膜 治疗组和对照组行颈动脉内膜空 气干燥术 治疗组术前 天开始给予 ( &" 溶于植物油中灌胃至处死 对照组 假手术组给予等量植物油灌胃 颈动脉内膜空气干燥术 手术过程无菌操作 以 的乌拉坦 经耳缘静脉麻醉家兔后 沿颈前正中线剪开皮肤 游离右颈总动脉 & 近心端和远心端用动脉夹临时夹闭 以 号头皮针穿刺阻断血管的两端 生理盐水冲洗后向夹闭血管腔内注射空气 持续时间 & 然后松开动脉夹压迫止血 血流通畅后逐层缝合 术后每只大白兔每天肌注 万单位青霉素 连续 天 于术后第 天分别处死 组动物 取病变部位血管等距切分 段 中性缓冲甲醛溶液固定 石蜡包埋 血管标本横截面切片 & 血管形态学测定 切片行 染色 显微镜下观察血管结构 &% 系统进行图像分析 测定各血管截面的内膜面积 中膜面积 内膜 中膜面积比率 取平均值 免疫组化 用 二步法进行 %% 选择素及 6% 免疫组化染色 一抗稀释度分别为 和 显色 苏木精复染 % 胞核及胞质棕黄 棕褐色为阳性 % 选择素及 6% 胞膜棕黄 棕褐色为阳性 代替一抗作阴性对照 用 进行图像分析 随机测量每张切片 个高倍视野中阳性面积百分比及阳性染色的平均光密度 各取平均值 用两者乘积再乘以 作为阳性表达指数 统计学处理 计量资料数据以 表示 使用 统计软件进行 检验及方差分析 为差异有统计学意义 % 分别与 % 选择素和 6% 阳性表达指数行直线相关分析 结 果 一般情况 实验过程中假手术 组有 只家兔死亡 各实验组动物均未出现局部伤口或全身感染及其他患病情况 实验结束时同期假手术组 对照组 治疗组家兔的体重差别无统计学意义 血管组织形态情况 肉眼观察 假手术 组取材血管弹性良好 内膜光滑 对照组管壁僵硬 其 组内膜可见脂点脂纹 组可见斑块形成 内膜不平整 组内

3 选择素及 T/C # 表达的影响 张玉保#等 =全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶中 B O &% 膜明显增厚#斑块隆起于内膜表面&治疗 C O /组 狭窄均可见#内膜层可见大量泡沫细胞并有脂质池 分别与对照 C O / 组相比病变程度较轻& 脂质核心形成#炎 性 细 胞 浸 润 更 加 严 重& 中 膜 亦 有 光学显微镜观察 假手术各组内膜结构完整连 平滑肌细胞向泡沫细胞转变&治疗组各组与对照组 续#紧贴于内弹力板&内弹力板结构完整#中膜层厚 相比#其内膜增厚平 滑 肌 细 胞 增 生 移 行内 弹 力 板 度均匀#平滑肌细 胞 呈 环 形 排 列#可 见 梭 形 胞 核#排 破 坏炎 性 细 胞 浸 润 及 细 胞 泡 沫 化 程 度 均 较 轻 列方向一致&对照 C 组内膜可见 增 生#为 单 层 至 数 图 # 层细胞&内弹力板 多 处 断 裂#可 见 平 滑 肌 细 胞 穿 过 内弹力板#中膜层近内弹力板处细胞外基质增多#细 内膜面积" C#中膜面积"C#内膜%中膜面积 比率" %# 术后 % 天治疗组C - 值与对照 C 胞排列紊乱&对照 O 组内膜增生较 C 组 明显 加重# 组相比#差 别 均 无 统 计 学 意 义 &/#= ()(& (%" 粥样斑块形成#平滑肌细胞聚积于内皮下#尚可见炎 性细胞浸润#以 内 膜 层 为 主& 内 弹 力 板 破 坏 更 为 严 - 值 #= %"# 术后 #) ( 天治疗组C 低于同期对照组#差别有统计学意义表 #同期处 重#中 膜 细胞 排列更加 紊乱& 对 照 / 组粥 样 斑块 向 死假手术组对照组治疗组中膜 面积差 异无 统计学 管腔隆起#环形均匀 性 增 厚 和 典 型 粥 样 硬 化 偏 心 性 意义 /#= # "# 图 E 术后 IU 天各组实验兔颈动脉 S 染色KELL% ES KELL% 58 % "O% /% "/% L 8% "= 表 E#)# 对兔颈动脉内膜增殖的影响?/" )8E #)#- 6 ; / ; A " 58 C 58 O 58 / /% C /% O /% / L 8% C L 8% O L 8% / ( & " C 88" C 88" " - " "% "# # ) ) #& ) % "( " "# # # "#" "#" # "" ) " &( #" " &/= (= &##"#8 /M-% O # &/= &##= #"#8 /M-% /= # # 免疫组化结果 假手术各组内皮层及中膜细胞 胞质内可见少量 B O& 表 达&术 后 % 天对 照 组 治疗组各组 选择素表 达 规 律 与 对 照 组 相 同#但 阳 中膜及内膜层细胞胞质和胞核内可见 B O& 多 性表达指数低于对照组图 表 量表达#以 新 生 内 膜 为 主& 术 后 #) ( 天 对 照 组 假手术组血管未见 T/C # 表达#对照组 术后 天时血管 内 膜 中 膜 可 见 棕 黄 棕 褐 色 颗 粒#呈 网 % B O& 表达 量 增 加#泡 沫 细 胞 亦 有 表 达& 治 疗 组各组 B O& 表 达 规 律 与 对 照 组 相 同#但 阳 性 表达指数低于对照组图 表 假手术 各 组 内 皮 层 可 见 微 量 选 择 素 表 达& 行平滑肌细胞内 皮 细 胞泡 沫 细 胞 均 可 见 其 表 达& 格状#部分融合成片#以内膜为主#内皮细胞泡沫细 胞及 浸 润 的 炎 性 细 胞 表 达 明 显术 后 #) ( 天 时 术后 % 天对 照 组 内 膜 层 及 中 膜 层 细 胞 胞 膜 可 见 T/C # 持续 高 表 达#血 管 各 层 均 可 见 棕 黄 色 物 质#以新生内膜深面粥样硬化病灶处为主&治疗组 选择素大量表达#内 皮 表 面 和 移 行 的 平 滑 肌 细 胞 及 血管 T/C # 表达部位及规律与对照组 一 致#但阳 浸润的炎性细胞胞膜表达更加明显&术后 #) ( 天 对照组 选择 素 持 续 高 表 达# 中 膜 平 滑 肌 细 胞 移 性表达指数明显低于对照组图 )表 选择素 及 T/C # 表 达 水 平 与 B & 表 O

4 复旦学报医学版""#" 年 月# % &" &( 达均呈 显 著 正 相 关 %/ (# # %/ ("# # 图 I 术后 IU 天各组实验兔颈动脉 " C"[6VQ 表达KOLL% - " C"[6VQ 88 - I56 KOLL% 58 % "O% /% "/% L 8% "= 图 J 术后 IU 天各组实验兔颈动脉 D C选择素表达KOLL% - D C / J56 KOLL% 58 % "O% /% "/% L 8% "= 图 O 术后 IU 天各组实验兔颈动脉 Y(#%C E 表达KOLL% - Y(#%C E 88 - O56 KOLL% 58 % "O% /% "/% L 8% "= 表 I#)# 对兔颈动脉 " C"[& D C选择素及 Y(#%C E 表达的影响 )8I #)# " C"[D C / --@Y(#%C E - 88 ( B O& % T/C # /% C = " ( = # % )##= # /% O &#= ## ) %" = #= # /% / = ( %# = ( ) (= (= " A " L 8% C L 8% O L 8% / #" & " )& = " = )& #" = ) ("#" " = ##= (" " &= ##= " #= # )" = #( ( = #) ) " &/= ##)#= #%#= &)"#8 /M-% C"# &/ )#&= ##= (##"#8 /M-% O"# &/ )## # # )#= "#8 /M-% /= 粥样硬化狭窄模型#肉眼及镜下所见证明造模成功& 讨 论 对照组与治疗组镜 下 可 见 大 量 炎 性 细 胞 浸 润#提 示 粥样斑块形成过程中炎症可能起着重要作用&治疗 本研究应用高脂饮食联合内膜损伤法复制动脉 组各组与对照 组 的 镜 下 比 较 说 明 CL@C 能 够 减 轻

5 张玉保 等 全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶中 %% 选择素及 6% 表达的影响 内膜增厚程度 平滑肌细胞增生移行程度 内弹力板破坏程度和炎性细胞浸润程度 内膜面积 中膜面积 内膜 中膜面积比率结果证明 ( 能明显抑制内膜增殖 统计结果还表明内膜损伤后粥样硬化性狭窄的形成主要归因于内膜增厚 而血管中膜增厚并不明显 研究表明 炎症反应在再狭窄的整个过程起着 重要作用 球囊损伤和支架置入引起的内膜增生在病理生理机制上不尽相同 支架置入术后炎症反 应起着更为重要的作用 核因子 % 信号通路与动脉粥样硬化及再狭窄的关系越来越受到关注 大量实验证明多种药物是通过抑制 % 通路 影响炎性因子的表达从而发挥其抗粥样硬化及再狭窄的 作用的 % 选择素及 6% 是重要的黏附分子 它们的表达受 % 的调控 % 选择素在血小板 内皮细胞 血管损伤后的平滑肌细胞 巨噬细 胞 再生内皮细胞表面均有表达 有研究表明 % 选择素缺失小鼠血管损伤后新生内膜增生明显减少 证明了 % 选择素在血管损伤反应中的重要作 用 6% 在 术后再狭窄中也发挥了重要作用 它可刺激平滑肌细胞迁移 加重单核 % 巨噬细胞浸润及内膜增殖 而应用 6% 抗体能使 小鼠动脉损伤模型的新生内膜增厚明显减轻 本实验观察到 % 在正常血管即有少量表达 但主要集中在胞质 而对照组可见 % 多量表达 平滑肌细胞 单核细胞和内皮细胞中均可以检测到 % 而且胞质胞核均有表达 胞核检测到 % 处于激活状态 本实验观察到 % 选择素在多种细胞胞膜上广泛表达 还观察到对照组血管内皮细胞 平滑肌细胞和泡沫细胞 6% 表达明显增高 局部呈现炎症状态 这些细胞的黏附 迁移功能增强 促进了血管内膜增殖及粥样硬化病变形成 这些结果与上述理论相符 但本研究发现 % 选择素及 6% 在粥样斑块形成过程中持续表达 这与黏附分子主要参与动脉粥样硬化及再狭窄的早期过程的观点并不相符 本研究结果提示黏附分子在动脉粥样硬化及再狭窄的进展期同样发挥着重要作用 治疗组与对照组阳性表达指数比较结果证明 ( 能够下调 %% 选择素及 6% 的表达水平 直线相关分析结果表明 % 与 % 选择素及 6% 的表达呈正相关 说明 ( 对 % 选择素及 6% 的抑制作用可能是通过下 调 % 的表达实现的 金红芳等研究大鼠支气管哮喘模型发现 全反式维甲酸能抑制 % 的激活与表达 下调 % 靶基因的表达 从而有效 抑制炎症 本研究进一步证实 ( 对动脉粥样硬化狭窄模型具有类似作用 综上所述 ( 抑制动脉粥样硬化病灶中内膜增殖的作用的机制之一可能是通过抑制 % 的激活和表达从而下调 % 的靶基因 % 选择素及 6% 的表达进而抑制炎症过程 但是鉴于再狭窄过程炎症机制的复杂性 对于 ( 抑制炎症反应的机制还需要进一步深入的研究 参 考 文 献 - " % " "" # 张青青 董果雄 张社华 等 全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶 6 增殖及 表达的影响 中国分子心脏病学杂志 张先明 董果雄 张社华 等 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后 及增殖细胞核抗原表达的影响 中国动脉硬化杂志 王凯 王涛 张占普 等 颈动脉狭窄动物模型的构建及核因子 % 和胰岛素样生长因子 % 的表达 中华神经科杂志 " &- " &&" " "" "" # / 马志强 成蓓 曾永利 等 缬沙坦对动脉粥样硬化兔核因子 % 和单核细胞趋化因子 % 的影响 微循环学杂志 (( (# &" " %##% "( -" #"#"%&" 6 ) 5) # # " "# %" "#%"%- / &"#( ;# %"% -""%"%# "" "#"" "#""" #"# #& ;# "- "# &%#-" &" " "" " " " ## & - 金红芳 方红 王宏伟 全反式维甲酸抗支气管哮喘大鼠气道炎症的作用及机制 中华结核和呼吸杂志 收稿日期 编辑 张秀峰

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