高琦等 : 神经生长因子壳聚糖和 PLGA 微球缓释效能的对比 13 GA microspheresaresuperiortochitosanmicrospheresforcontroled-releaseofngf.thengf- PLGA microspheresarehelpfulforob

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岱脱廉
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1 12 南昌大学学报 ( 医学版 )2017 年第 57 卷第 6 期 JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.6 神经生长因子壳聚糖和 PLGA 微球缓释效能的对比高琦 1a, 王琦宇 2, 杨静 1b, 王稚英 1c (1. 锦州医科大学 a. 医疗学院基础教研部口腔教研室 ;b. 附属第一医院病理科 ; c. 附属第二医院口腔科种植中心院长室 ;2. 锦州市中心医院口腔科, 辽宁锦州 ) 摘要 : 目的用聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 微球和壳聚糖微球载体共同运载神经生长因子 (NGF), 观察二者对 NGF 的缓释作用, 为促进种植窝预备时损伤的下齿槽神经及周围神经恢复的药物输送选择上提供可靠的实验依据方法利用 PLGA 和壳聚糖分别制备出空白微球并共同运载 NGF, 模拟体外环境进行药物释放和微球形态及微球载药包封率的检测通过实验的检测及结果, 绘制出 PLGA 和壳聚糖分别载药后的药物体外释放曲线, 并进行对比, 从中选择适合的载体结果壳聚糖和 PLGA 载 NGF 后的缓释微球形态大小药物的载量药物的包封率比较差异均无统计学意义 (P>0.05); 药物的释放过程中二者均能持续释放 NGF, 但壳聚糖微球释放速率较 PLGA 微球释放速率更快 (P<0.05) 结论 NGF-PLGA 微球缓慢释放的速率优于 NGF 壳聚糖微球, 可以更好地进行调控, 有利于观察周围神经损伤的修复, 为靶向治疗下牙槽的神经损伤临床实验研究提供可靠的依据关键词 : 神经生长因子 ; 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 ; 壳聚糖 ; 微球 ; 缓释中图分类号 : R-331 ;TQ460.6 文献标志码 : A 文章编号 : (2017) DOI: /j.cnki.ncdm ComparisonofChitosanandPLGA Microspheresfor Controled-ReleaseofNerveGrowthFactor GAOQi 1a,WANGQi-yu 2,YANGJing 1b,WANGZhi-ying 1c (1a.OralTeaching and Research Room,Basic Research Departmentof Medical Colegeof Jinzhou University;1b.Departmentof Pathology,the FirstAffiliated Hospital; 1c.Dean sofficeof Planting Centerof Departmentof Stomatology,theSecond Affiliated Hospital,Jinzhou Medical University;2.Departmentof Stomatology,Jinzhou Central Hospital,Jinzhou121001,China ) ABSTRACT:Objective Toobservetheeficaciesofpolylactic-co-glycolicacid(PLGA)andchi- tosanmicrospheresforcontroled-releaseofnervegrowthfactor(ngf),andtoprovidereliable experimentaldatafortherepairofinferioralveolarnerveinjuryduringimplantplacementand drugdeliveryforperipheralnerverecovery.methods Blank microspheres wereprepared with PLGAandchitosanasthecarrierofNGF,respectively.Drugrelease,microspheremorphologyand entrapmenteficiencyweredeterminedinasimulatedenvironment.accordingtotheexperimental testingandstatisticalresults,invitrodrugreleasecurveofplgaandchitosanloadedwithdrug wasdrawnandcomparedtochoosethesuitablecarrier.results Therewerenosignificantdifer- encesinmicrospheresize,drugloadandentrapmenteficiencybetweenplgaandchitosanmicro- spheres(p>0.05).bothofthemcanreleaseofngfsustainedly.however,thereleasevelocityof chitosanmicrosphereswasgreaterthanthatofplga microspheres(p<0.05).conclusion PL- 收稿日期 : 基金项目 : 辽宁省教育厅一般项目 (L ) 作者简介 : 高琦 (1985 ), 女, 硕士, 助教, 主要从事口腔颌面外科肿瘤发生发展的机制口腔种植学的研究通信作者 : 王稚英, 主任医师, wangzhiying@163.com

2 高琦等 : 神经生长因子壳聚糖和 PLGA 微球缓释效能的对比 13 GA microspheresaresuperiortochitosanmicrospheresforcontroled-releaseofngf.thengf- PLGA microspheresarehelpfulforobservingtherepairofperipheralnerveinjuryandprovidere- liableevidenceforclinicalresearchoftargetedtherapyofinferioralveolarnerveinjury. KEY WORDS:nervegrowthfactor;polylactic-co-glycolicacid;chitosan;microspheres; controledrelease 随着人们生活水平的不断提高及对口腔健康认知的加强, 接受种植义齿修复治疗是一种理想的选择, 可以治疗因外伤牙周龋坏等多因素所导致的一颗或多颗牙齿缺失的恢复 [1] 口腔种植学被越来越多的人所接受的同时, 手术过程中的并发症也相 [2] 继出现, 其中以神经损伤最为突出有学者对 30 例神经损伤进行分析, 发现每年种植牙手术的 1% 左右会引起神经损伤, 说话吃饭和接吻时出现疼痛 [3] 不适近年来种植牙手术成上升趋势, 有数据表明在英国, 每年约有下颌种植牙手术, 其中 10% 引起神经损伤周围神经损伤的原因有很多种, 根据手术过程中创伤机制病原学可分为机械热化学术后间接热刺激感染血肿和缺血 [4] 大部分人会出现麻木的症状, 造成的伤害会影响人们的生活质量和身心健康 [5] 神经营养因子中的神经生长因子 (NGF) 的生理作用是维持神经元外周神经系统发育必备的, 同时也是胆碱能神经元在中枢神经系统功能完整的保障 [6] NGF 属于多肽蛋白质, 它的生物半衰期短需要长期给药才能维持有效浓度, 因此 NGF 在临床应用上受到了限制 [7] 微球是指药物分散或被吸附在高分子聚合物基质中而形成的微粒分散体系, 粒径一般为 1~500μm [8], 制成载药试剂后一般用于注射或口服目前微球作为新型药物的载体有淀粉微球壳聚糖微球聚乳酸微球明胶微球及磁性微球等 [9] 这些载药微球可以运载药物的活性分子输送到人体的各个器官, 到达靶器官后缓慢释放药物, 减轻药物的不良反应, 同时根据微球的释放进行控制, 以达到临床治疗或实验研究的目的本实验通过选取壳聚糖微球和聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PL- GA) 微球作为对药物运输的载体, 共同承载 NGF 做对比研究, 观察二者微球的形态微球所能载入的药量以及对 NGF 的缓慢释放的效能, 从中选择出更适合于输送 NGF 的载体, 为 NGF 修复周围神经损伤的药物输送选择提供可靠的实验依据 1 材料与方法 1.1 材料人 NGF 人 NGF-ELISA 检测试剂盒 ( 美国 R&D 公司 ),PLGA(PLA/PGA:75/25( 长春圣博玛生物材料有限公司 ), 壳聚糖 ( 南通兴城生物制品厂 ), 聚乙烯醇 (PVA-124, 黑龙江鸿儒经贸有限公司 ), 聚乙二醇 (PEG400, 辽阳澳克纳米材料有限公司 ), 透析袋 MD45( 截留分子量 10000, 美国 spec- trum 公司 ), 硫胺素焦磷酸 (TPP, 北京鹏林生物生物技术有限公司 ) 1.2 NGF-PLGA 缓释微球的制备采用传统 W/O/W 复乳法制备 NGF-PLGA 缓释微球, 将 5μg 的 NGF 和 50μL 表面活性剂聚乙二醇溶于 100μL 的去离子水中得内水相 (W1); 将 100mg 的 PLGA 溶于 4 ml 的二氯甲烷中得到油相 (O);1.5% 聚乙烯醇溶液为外水相 (W2); 冰浴超声处理 30s 得到初乳 (W1/O), 将初乳倒入 W2 中, 经悬臂式搅拌机 1000r min -1 搅拌 5min, 得到复乳 (W1/O/W2), 将其倒入 10% 的去离子水 Nacl 水溶液 400 ml 中, 在温室中通过磁力搅拌机搅拌 6h, 再通过 0.45μm 滤膜过滤得到微球, 最后用去离子水洗涤 5 次, 用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥 48h, 得到 NGF-PLGA 缓释微球放置于 4 存放 1.3 NGF-PLGA 缓释微球形态检测取少量的 NGF-PLGA 缓释微球, 置于贴有双面胶的金属板上, 制成扫描电镜标本, 在扫描电镜下观察其形态 1.4 NGF-PLGA 缓释微球包封率的测定取 NGF-PLGA 缓释微球 5 mg 放入乙酸乙酯 0.5mL 中, 加入去离子水 5mL, 充分振荡, 静置后, 用下清液萃取出 NGF, 重复操作 3 次, 用 ELISA 在 490nm 波长测定 NGF 的吸光度, 带入标准曲线进行计算, 得出 NGF 含量计算公式 : 微球包封率 = ( 微球中测定的 NGF 含量 / 微球中理论的 NGF 含量 ) 100% 1.5 NGF-PLGA 缓释微球的缓释释放准确称量缓释微球 20mg, 放入已经盛有 5mL PBS 缓冲液的透析袋中, 封闭完好, 放置于盛有 300mLPBS 缓冲液的大烧杯中, 以 150r min -1 的速度进行恒温 (37 ) 振荡, 分别在 h, d 取出, 用高速离心机以 1500r min -1 持续离心 5 min, 取上清液 3 ml 放入 -20 冷冻保存, 加入等量的 PBS 缓冲液于残

3 14 南昌大学学报 ( 医学版 )2017 年 12 月, 第 57 卷第 6 期余的沉淀, 密封后再次放入缓释烧杯中, 最后用 ELISA 法测定 NGF 的质量浓度, 计算出每次取出后的 NGF 释放量, 绘制成微球缓释的曲线图表 1.6 NGF 壳聚糖缓释微球的制备采用乳化交联法制备 NGF 壳聚糖缓释微球取 100mg 的壳聚糖溶于 20 ml L -1 的乙酸溶液 10mL 中, 再将 NGF5μg 溶于 4mmol L -1 HCL 溶液 1 ml 中, 将两种混合液缓慢加入辛醇溶液 100mL 中, 用磁力搅拌机搅拌 2 h, 然后加入 100g L -1 的 TPP 水溶液进行交联, 继续搅拌 1h, 静置沉淀, 用双蒸水反复漂洗, 用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥 48h, 得到 NGF 壳聚糖缓释微球放置于 4 存放 1.7 NGF 壳聚糖缓释微球形态检测取少量的 NGF 壳聚糖缓释微球, 放置于贴有双面胶的金属板上, 制成扫描电镜标本, 在扫描电镜下观察其形态 1.8 NGF 壳聚糖缓释微球包封率的测定取 NGF 壳聚糖缓释微球 5mg 放入 0.5mL 乙酸中, 加入去离子水 5 ml, 充分振荡, 静置后, 用下清液萃取出 NGF, 重复操作 3 次, 采用 ELISA 在 450nm 波长测定 NGF 的吸光度, 带入标准曲线进行计算, 得出 NGF 含量 1.9 NGF 壳聚糖缓释微球的缓释释放准确称量 20mg 的缓释微球, 加入含有溶菌酶的磷酸盐缓冲液 2 ml 中, 以 150r min -1 的速度进行恒温 (37 ) 振荡, 分别在 h, d 取出, 取上清液 100μL, 加入等量的 PBS 缓冲液于残余的沉淀, 最后采用 ELISA 法测定 NGF 的质量浓度, 计算出每次取出后 NGF 的释放量, 绘制成微球缓释的曲线图表 1.10 统计学方法采用 SPSS17.0 软件进行统计学分析所得数据以 x±s 表示, 比较采用 q 检验和 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 两种缓释微球的表现形态扫描电镜下观察发现 NGF 壳聚糖和 NGF-PLGA 两种缓释微球大小比较匀称, 微球表面光滑, 大体形态趋向于圆形, 且分布较均匀 ( 图 1) 两种微球在超水中分散良好,NGF-PLGA 微球直径为 (22.14± 4.32) μ m,ngf 壳聚糖微球直径为 (51.25±3.74) μ m, 两种微球直径均略小于各自的空白微球 A B 图 1 A:NGF-PLGA 缓释微球 ;B:NGF 壳聚糖缓释微球 NGF-PLGA 和 NGF 壳聚糖缓释微球的扫描电镜观察 2.2 两种缓释微球载药量和包封率对比 NGF 壳聚糖和 NGF-PLGA 两种缓释微球均以各自的空白微球降解作为空白对照组, 通过微球包封率计算公式得出各自的包封率 NGF 壳聚糖 NGF-PLGA 缓释微球的载药量和包封率比较差异无统计学意义 ( 均 P>0.05), 见表 1 表 1 两种缓释微球载药量和包封率对比 x±s,% 类别载药量包封率 NGF 壳聚糖 (100mg) 7.4± ±3.27 NGF-PLGA(100mg) 7.6± ± 两种缓释微球药物累积释放率对比 NGF 壳聚糖和 NGF-PLGA 缓释微球载药后均能够持续释放 NGF, 在载药微球释放的初期, 两

4 高琦等 : 神经生长因子壳聚糖和 PLGA 微球缓释效能的对比 15 者就有明显的差异在 2h 时, 壳聚糖缓释微球药物累计释放率为 (21.3±2.1)%, 而 NGF-PLGA 缓释微球药物累计释放率为 (6.5±2.3)%, 随着时间的推移, 两种不同的载药微球对 NGF 的释放均逐渐升高在第 7 天时壳聚糖载药微球的释放量逐渐达到平稳,NGF-PLGA 缓释微球在第 21 天时趋于平稳 2h 14d 两种载药微球药物累计释放率比较差异有统计学意义 ( 均 P<0.05),21 28d 两种微球药物累计释放率比较差异无统计学意义 (P> 0.05) 见表 2 图 2 表 2 两种缓释微球不同时间药物累积释放率对比 x±s,% 类别累积释放率 2h 4h 8h 16h 24h 2d NGF-PLGA(20mg) 6.5±2.3 * 7.4±1.6 * 9.3±1.5 * 12.7±2.1 * 19.8±2.5 * 21.7±2.7 * NGF 壳聚糖 (20mg) 21.3± ± ± ± ± ±2.1 累积释放率类别 4d 7d 14d 21d 28d NGF-PLGA(20mg) 28.9±2.4 * 40.8±2.3 * 49.7±2.6 * 60.2± ±2.3 NGF 壳聚糖 (20mg) 49.5± ± ± ± ±2.4 *P<0.05 与 NGF 壳聚糖比较累积释放率 /% h 4 h 8 h 16 h 24 h 2 d 4 d 7 d 14 d 21 d 28 d 时间 A:NGF-PLGA 缓释微球 ;B:NGF- 壳聚糖缓释微球图 2 NGF-PLGA 和 NGF 壳聚糖缓释微球释放曲线 3 讨论随着种植牙的广泛应用, 手术过程中所发生的神经损伤病例也有逐年上升的趋势如何在损伤后进行神经修复, 已经引起了学者们的关注微球载药系统已经逐步完善, 并越来越多的应用于多种方面理想中的药物载体应该具备 :1) 载体可降解 ; 2) 药理学稳定且易于药物释放 ;3) 载体对于药物释放有控制性 ;4) 具有一定的靶向性 ;5) 载体本身无毒 [10] 性通过载药微球作用在损伤神经中进行修复, 能够安全稳定持续地滋养周围神经本实验选取了壳聚糖微球和 PLGA 微球作为载体材料包裹 NGF 类药物壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物, 具有生物相容性和可降解性, 是自然界 [11] 中不可多得的天然高分子载体材料海洋化合物中, 壳聚糖是生物高聚物作为甲壳素脱乙酰作用的结果, 其主要组成部分为保护角质层的甲壳类动物, 如螃蟹虾节肢动物外壳中, 也可以在真菌藻类的细胞壁中获得 [12] 近年来用壳聚糖作为药物载体运输吲哚美辛阿司匹林塞来昔布化疗药物胰岛素等控制缓释在临床上取得了一定的效果 [13] [14] 有学者使用胰岛素和壳聚糖微球形成一个复杂的封装纳米颗粒, 药物的包封率和载药量分别为 87% 和 9.5%, 通过模拟人体肠道内环境发现累积释放胰岛素高达 40% 以上胰岛素在壳聚糖微球核心内保护良好, 避免了在模拟胃液中的消耗 PLGA 是聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物, 是最有吸引力的聚合物, 多用于制造药物输送和组织工程应 [15] 用 PLGA 的降解产物是乳酸和羟基乙酸, 同时也是人代谢途径的副产物, 所以它应用在医药和生 [16] 物材料中时不会有毒副作用 PLGA 在其他实验中以纳米粒子, 微球疫苗和层状神经导管被广泛应用 [17] PLGA 纳米微球的出现有效地治疗了心血管疾病包括预防式的改变, 药物治疗和外科手术 [18] 等从体外研究表明细胞内化 PLGA 微球可以用来作为抗增殖剂同时可能提供一个新的局部给药途

5 16 南昌大学学报 ( 医学版 )2017 年 12 月, 第 57 卷第 6 期径, 防止再狭窄或搭桥等心血管疾病 [19] PLGA 具有载药量多, 使用方便, 是各种微球载药材料的优选者, 具有易于在体内降解吸收等特点本实验发现壳聚糖和 PLGA 所制备出的微球大小较均匀, 表面光滑, 壳聚糖微球的直径略大于 PLGA 微球, 两者之间的载药含量和药物的包封率无明显差别实验中, 两者载药微球释放药物的速率有明显的差异, 对释放药物可以分成 2 个阶段 : 快速释放和缓慢释放在释放初期, 壳聚糖在很短的时间内就释放出大量药物, 而 PLGA 初期时释放率较少随着时间的变化, 两者皆有攀升的现象,7d 时壳聚糖释放药物就趋于平缓, 而 PLGA 微球在 21d 时趋于稳定在 21d 以前两种微球对药物的释放率有明显不同 (P<0.05) 结果表明, 壳聚糖前期释放药物速率过快, 而 PLGA 则对于 NGF 达到了缓慢释放, 从可控性来看,PLGA 微球要优于壳聚糖微球, 有利于观察周围神经损伤的修复总之, 本实验表明 PLGA 微球更适合作为输送 [20] NGF 的载体,Jayakumar 等亦认为, 通过 PLGA 的运载可以持续释放药物长达 7 周本实验的结果为靶向治疗下牙槽周围神经损伤临床实验研究提供了可靠的依据但 NGF-PLGA 在实验过程中是否存在生物活性丧失, 是否有更适合 NGF 输送的载体, 还有待于在以后的实验中进一步研究参考文献 : [1] OshidaY,TunaE B,Akt ren O,etal.Dentalimplantsyste- ms[j].intjmolsci,2010,11(4): [2] TaeK Y,PangK M,JongJH,etal.Clinicaloutcomeofcon- servativetreatmentofinjuredinferioralveolarnerveduring dentalimplantplacement[j].jkoreanassocoral Maxilofac Surg,2013,39(3): sia[j].intjoralmaxilofacsurg,2006,35(9): ormandible:aninitialquestionnaireapproachfolowedbya psychcphysicalassessment[j].clin OralInvestig,2006,10 (4): [5] AloeL,Rocco M L,BianchiP,etal.Nervegrowthfactor:from theearlydiscoveriestothepotentialclinicaluse[j].jtrausl Med,2012,10:239. [6] FumagaliF,MadaschiL,BrennaP,etal.Singleexposureto erythropoietinmodulatesnervegrowthfactorexpressionin thespinalcordfolowingtraumaticinjury:comparison with methylprednisolone[j].eurjpharmacol,2008,578(1): [3] MalamedSF.Nerveinjurycausedbymandibularblockanalge- [4] Abarca M,vanSteenbergheD,MalevezC,etal.Neurosensory disturbancesafterimmediateloadingofimplantsintheanteri- [7] 刘建刚, 刘志超, 钱志勇, 等. 聚乙二醇修饰磁性 5- 氟尿嘧啶白蛋白微球的制备与表征 [J]. 中华实验外科杂志,2008,25(1): [8] GarbayoE,Montero MeneiC N,AnsorenaE,etal.Efective GDNFbraindeliveryusing microspheres-apromisingstrategy forparhinson sdisease[j].jcontrolrelease,2009,135(2): [9] Gu H,LongD,SongC,etal.RecombinanthumanNGF-loaded microspherespromotesurvivalofbasalforebraincholinergic neurousandimprovememoryimpairmentsofspatiallearning intheratmodelofalzheimersdiseasewithfimbria-fornixle- sion[j].neuroscilet,2009,453(3): [10] FukudaK,IchinoheT,KanekoY.Painmanagementfornerve injuryfolowingdentalimplantsurgeryattokyodentalcol- legehospital[j].intjdent,2012,2012: [11] Islam M A,FirdousJ,ChoiYJ,etal.Desiguandapplication ofchitosanmicrospheresasoralandnasalvaccinecarriers:an updatedreview[j].intjnanomedicine,2012,7: [12] WeiW,MaG,WangL.Holowquaternizedchitosanmicroph- eresincreasethetherapeuticefectoforalyadministeredin- sulin[j].actabiomaterialia,2010,6(1): [13] Yuan W,LiuZG.Controled-releaseandpreservedbioactivity ofproteinsfrom(self-assembled)core-sheldouble-waledmi- crospheres[j].intjnanomedicine,2012,7: [14] Alameh M,DejesusD,Jean M,etal.Low molecularweight chitosannanoparticulatesystematlow N:Pratiofornontoxic polynucleotidedelivery[j].intjnanomedicine,2012,7: [15] DesaiK G H,SchwendemanSP.Activeself-healingencapsu- lationofvaccineantigensinplga micropheres[j].jcontrol Release,2013,165(1): [16] MakadiaH K,SiegelSJ.Polylactic-co-glycolicacid(PLGA) asbiodegradablecontroleddrugdeliverycarrier[j].polymers (Basel),2011,3(3): [17] JeongYI,JinSG,KimIY,etal.Doxorubicin-incorporated nanoparticlescomposedofpoly(ethyleneglycol)-graftedcar- boxymethylchitosan and antitumor activity againstglioma celsinvitro[j].coloidssurfbbiointerfaces,2010,79(1): [18] Zhang N,LiJ,Jiang W,etal.Efectiveprotectionandcon- troledreleaseofinsulinbycationicbeta-cyclodextrinpoly- mersfrom alginate/chitosannanoparticles[j].intjpharm, 2010,393(1/2): [19] Dash M,ChieliniF,OtenbriteR M,etal.Chitosan-Aversa- tilesemi-syntheticpolymerin biomedicalapplications[j]. ProgPolymSci,2011,36(8): [20] JayakumarR,ChennazhiK P,MuzzareliR,etal.Chitosan conjugateddnananoparticlesingenetherapy[j].carbohydr Polym,2010,79(1):1-8. ( 责任编辑 : 钟荣梅 )

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