462 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4): 第 48 卷 T 细胞的活化需要两个不同的细胞外信号的共同刺激 [1] : 即由抗原递呈细胞 (APC) 表面的 MHC Ag 肽复合物与 TCR 特异性结合作为第一信号和

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省鑫梅
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1 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2017,48(4): B7 H4 单抗 3C8 的纯化及对肿瘤免疫逃逸的阻断作用研究陈亚莉, 李安琪, 张宁癑, 章良 ( 苏州大学药学院, 苏州 ) 摘要采用 ProteinG 亲和色谱及 DEAE 阴离子交换柱色谱分离纯化精制鼠源性 B7 H4 单克隆抗体 3C8, 结合流式检测可与 B7 H4/293T 转基因细胞株结合的目标抗体组分, 获得了纯化的鼠源性 B7 H4 单克隆抗体 3C8 反相柱色谱检测其纯度为 93%,SDS PAGE 凝胶电泳鉴定证明经过两步柱色谱, 目标抗体的纯度大大提高流式细胞术检测发现 3C8 只与 B7 H4/293T 转基因细胞株结合, 不与 Mock/293T 细胞结合, 并且 3C8 也不与 B7 家族其他成员的转基因细胞株结合激光共聚焦实验显示 3C8 可特异性染色 B7 H4/293T 转基因细胞,Westernblot 实验发现, 以 3C8 作为一抗,B7 H4/293T 转基因细胞有阳性条带而 Mock/293T 细胞没有条带用 3C8 作为一抗进行免疫组化, 结果显示, 前列腺癌和肾癌组织特异性高表达 B7 H4 分子, 而前列腺癌旁组织和肾癌癌旁组织 B7 H4 呈阴性表达 T 细胞体外实验显示,B7 H4 Ig 可特异性与活化 T 细胞结合, 但 3C8 可阻断这种结合作用, 并可逆转 T 细胞增殖抑制作用及 T 细胞因子分泌抑制作用关键词单克隆抗体 3C8;B7 H4; 纯化 ; 负性共刺激 ; 免疫逃逸 ; 阻断作用中图分类号 R730 3 文献标志码 A 文章编号 (2017) doi: /j.isn 引用本文陈亚莉, 李安琪, 张宁癑, 等 B7 H4 单抗 3C8 的纯化及对肿瘤免疫逃逸的阻断作用研究 [J]. 中国药科大学学报,2017,48(4): Citethisarticleas:CHENYali,LIAnqi,ZHANGNingyue,etal Purificationofmonoclonalanti B7 H4antibodyandtheblockadeofB7 H4 medi atedtumorimmuneevasionbytheantibody[j].jchinapharmuniv,2017,48(4): Purificationofmonoclonalanti B7 H4antibodyandtheblockadeofB7 H4 mediatedtumorimmuneevasionbytheantibody CHENYali 牞 LIAnqi 牞 ZHANGNingyue 牞 ZHANGLiang ColegeofPharmaceuticalScience 牞 SoochowUniversity 牞 Suzhou 牞 China Abstract Thepurified3C8wasobtainedbytwostepcolumnpurification 牞 includingproteingafinitypurifica tionanddeaeanionexchangepurification Thepurityofpurified3C8wasabout93% whenanalyzedbyreverse column SDS PAGEshowedthatthepurityof3C8wasincreasedgreatlybytwosteppurification Byflowcytometry wefoundthat3c8specificalybindedwithb7 H4/293TcelsanddidnotbindwithMock/293Tcels 牞 moreover 3C8didnotbindwithotherB7familymemberstransgenecels Inconfocalexperiment3C8couldspecificaly stainedb7 H4/293Tcels InWesternblotonlyB7 H4/293TcelsshowedpositivebandwhileMock/293Tcels showednegativeresult TheresultofimmunohistochemistryshowedthatB7 H4washighlyexpresedinprostate cancerandrenalcelcarcinoma 牞 whilepara cancertisuesdidnotexpresb7 H4 TheTcelproliferationexperi mentshowedthatb7 H4 IgcouldbindtoactivateTcelsandinhibitTcelproliferation 牞 while3c8couldblock thebindingofb7 H4 IgandreversetheTcelproliferationinhibitionefectofB7 H4 IgbyCFSEandCCK8 asay.thecytokineifn γandil 2secretedbyactivatingTcelswasdecreasedbyB7 H4 Igand3C8could reversetheefectofb7 H4 Ig Keywords monoclonalantibody3c8 牷 B7 H4 牷 purification 牷 negativecostimulation 牷 immuneevasion 牷 blockade ThisstudywassupportedbytheNationalNatureScienceFoundationofChina 牗 No 牘收稿日期通信作者 Tel: E mail:cpuzl@163 com 基金项目国家自然科学基金资助项目 (No )

2 462 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4): 第 48 卷 T 细胞的活化需要两个不同的细胞外信号的共同刺激 [1] : 即由抗原递呈细胞 (APC) 表面的 MHC Ag 肽复合物与 TCR 特异性结合作为第一信号和来自 APC 表面的共刺激分子与 T 细胞表面相应受体的结合作为第二信号第二信号包括正性共刺激信号和负性共刺激信号, 主要是由 B7 家族与其受体 CD28 家族的相互作用而产生 [2] B7 家族成员中的正性共刺激分子包括 B7 1(CD80) B7 2(CD86) CD28 B7RP1(ICOSL), 负性共刺激分子包括 CTLA4 PD 1 PD ligand(pl1) PDL2 B7 H3 B7 H4 和 VISTA 正性共刺激分子与负性共刺激分子的表达能够正性或负性调控 T 细胞的功能, 造成 T 细胞的活化或抑制, 从而在肿瘤免疫过程中发挥着杀伤肿瘤细胞或抑制 T 细胞的活性这两种截然不同的功能正性共刺激分子表达缺失, 或者负性共刺激分子表达上调, 均会保护肿瘤细胞避免效应 T 细胞的破坏, 最终造成肿瘤细胞的免疫逃逸因此, 通过设计针对负性共刺激分子的单克隆抗体, 阻断对 T 的免疫抑制作用, 促进 T 细胞的增殖活化及细胞因子分泌, 从而有效地杀伤靶细胞, 这也为肿瘤的治疗提供了新的途径因此, 近年来以负性共刺激分子家族成员为靶点的单抗类药物的研发进入了一个快速发展期目前, 以负性共刺激分子 CTLA 4 及 PD 1/PD L1 为靶点的单抗类药物已成功上市, 对这些分子靶点的抑制均能显著抑制肿瘤生长临床研究结果显示, 使用 CTLA 4 以及 PD 1 单克隆抗体药物的晚期黑色素瘤以及其他肿瘤患者, 均表现出较为积极的结果尤其是以 PD 1/PD L1 为靶点的单抗类药物, 疗效显著, 开创了肿瘤免疫治疗的新纪元 [3] [4] B7 H4 分子是 2003 年 Sica 等发现的 B7 家族的一个成员, 表达在专职 APC 中, 并广泛分布于非淋巴组织中 RT PCR 分析显示, 在胎盘肝骨骼肌肾胰腺前列腺睾丸卵巢小肠等器官, 有其 mrna 表达, 但在脑组织和心脏未发现其表达研究表明,B7 H4 是一种负性共刺激分子, 作用与 PD L1 类似, 可抑制 T 细胞的增殖细胞因子分泌及细胞周期的进行, 从而下调 T 细胞的免疫功能 [4-6] 虽然对 B7 H4 分子的功能了解得还不很全面, 但其在正常组织中几乎不表达, 而在一些肿瘤细胞上异常表达, 如卵巢癌乳腺癌直肠癌子宫内膜癌肺癌肾细胞癌等提示其与多种肿瘤的发生具有相关性以及在保护肿瘤细胞逃避免疫监视的过程中起着重要作用 [7-8] 本实验室在已获得的抗 B7 H4 的鼠源性单抗杂交瘤细胞 3C8 的前期研究工作基础上, 通过亲和色谱及 DEAE 离子交换柱色谱两步纯化法, 获得了纯化的鼠源性抗人 B7 H4 单克隆抗体 3C8, 反相柱色谱检测其纯度为 93 16% 对其应用研究发现, 该抗体可特异性与 B7 H4 分子结合, 并可用于流式细胞术免疫荧光 Westernblot 及免疫组化 3C8 可阻断 B7 H4 Ig 介导的 T 细胞增殖抑制及 T 细胞因子分泌抑制材料 1 1 药品与试剂 HitrapProteinG 色谱柱 ( 美国 GE 公司 ); DEAEFF 阴离子交换色谱 A 柱 ( 美国 GE 公司 ); Zorbax300SB C 18 (9 4mm 25mm) 反相分析柱 ( 美国 Agilent 公司 );DAB 试剂盒 ( 北京博奥森生物科技有限公司 );HRP 偶联羊抗鼠二抗 ( 美国 CST 公司 ); 羊血清 ( 中科晨宇北京生物科技有限公司 ); 苏木素 ( 上海索莱宝生物科技有限公司 ); 中性树胶 ( 国药集团化学有限公司 ); 高效切片石蜡 ( 上海华永石蜡有限公司 );RPMI1640 培养基粉剂 ( 美国 Gibco 公司 ); 小牛血清 ( 杭州四季青生物工程材料有限公司 ); 胰蛋白酶 ( 上海沃凯公司 ); Cy5 标记的羊抗鼠 IgG PE 标记的羊抗鼠 IgG 和鼠 IgG 同型对照 ( 美国 Biolegend 公司 ); 牛血清白蛋白 BSA( 上海前尘生物科技有限公司 ); 多聚甲醛 PFA( 上海生物工程技术有限公司 );TritonX 100 ( 美国 Pharmacia 公司 );DMSO 细胞冻存液多聚赖氨酸碘化丙叮 RNA 酶 ( 美国 Sigma Aldrich 公司 ); 其余试剂均为市售分析纯, 实验用水为纯净水 1 2 仪器分离纯化色谱仪 MiniProteanCel 垂直电泳槽 ( 美国 Bio Rad 公司 );FC500 流式细胞仪 ( 美国 BeckmanCoulter 公司 );LeicaTCSSP2 激光共聚焦显微镜 ( 德国 Leica 公司 ) 1 3 动物取 8~10 周龄的雌性 BALB/c 小鼠, 由昭衍公司提供, 实验动物许可证号 :SCXK( 苏 )

3 第 48 卷第 4 期陈亚莉, 等 :B7 H4 单抗 3C8 的纯化及对肿瘤免疫逃逸的阻断作用研究 463 所有动物均符合动物伦理委员会标准方法 2 1 抗 B7 H4 单克隆抗体的制备及分离纯化抗 B7 H4 单克隆抗体的制备本实验室前期通过免疫 BALB/c 小鼠, 取小鼠脾脏细胞并与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 融合, 再通过筛选获得的单克隆杂交瘤细胞株 3C8, 该杂交瘤细胞株培养在含 10%FCS 的 DMEM 培养基中传代本实验室采用体内诱生腹水法生产单克隆抗体每只腹腔注入 Pristane0 5mL 1 周后每只腹腔注射 3C8 杂交瘤细胞个, 同时另一侧腹腔再次注入 Pristane 和 IFA 的等体积混合物 0 2mL, 轻轻按摩小鼠腹部, 使杂交瘤细胞分散于腹腔中观察小鼠的腹部变化并及时收集腹水一般在 7~10d 后收集腹水, 离心取上清液分装与 -80 保存 ProteinG 免疫亲和色谱纯化单克隆抗体将腹水解冻, 离心去除凝块, 每 10mL 腹水加入 1mol/L CaCl 2 1 ml,5% Sulfate dextran 溶液 0 1mL, 室温搅拌 15min,4 离心 (12000r/min, 20min) 去除纤维蛋白取上清液按 50% 饱和度缓慢加入等体积饱和 (NH 4 ) 2 SO 4, 混匀后置 4, 4~6h, 离心弃上清液取沉淀加 0 01mol/L,pH 7 0 的 PBS 复溶透析去除 (NH 4 ) 2 SO 4, 上样色谱条件 : 结合缓冲液 ph7 0,0 02mol/L 磷酸钠缓冲液 ; 洗脱缓冲液 ph3 0,0 1mol/L 柠檬酸钠缓冲液样品经 FPLC 系统上 HitrapProteinG 亲和色谱柱, 采用洗脱液洗脱, 收集蛋白峰流出液, 及时用 ph9 0 的 Tris 溶液矫正 ph 至 7 0, PBS 透析后用紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量, 其浓度的计算公式为 : 抗体蛋白含量 (mg/ml)= A A 产品过滤除菌后分装与 -80 保存 DEAE 离子交换柱色谱精制单克隆抗体 DEAEFF 阴离子交换色谱柱, 以 0 03mol/L 的 ph 7 0 的磷酸纳缓冲液为 A 液, 在 A 液中加入 1mol/L NaCl 配制成的溶液为 B 液, 设置洗脱梯度为 0~ 0 5mol/L 的 NaCl(20 柱体积 ), 进行梯度洗脱, 收集目标峰 2 2 反相柱色谱进行纯度鉴定采用 Zorbax300SB C19(9 4mm 25mm) 反相色谱柱, 以含 0 1% 三氟乙酸的纯水溶液为 A 液, 以纯乙腈为 B 液, 设置洗脱梯度为 0% ~50%B 液 (250mL), 进行梯度洗脱, 峰面积回归 2 3 流式细胞仪检测离心收集细胞, 加入 PBS 洗涤液 3 0mL, 1800r/min 离心 5min, 小心吸弃上清液, 并重复洗涤 1 次, 吸去上清液 ; 加入适当稀释度的小鼠抗人 B7 H4 单克隆抗体 3C850μL, 小心混匀, 对照管中加入鼠 IgG 同型对照稀释液, 于 4 冰箱放置 30min, 加入 PBS 洗涤两次,1800r/min 离心 5min, 收集细胞沉淀, 加入稀释的 PE 标记的羊抗鼠 IgG 15μL, 吹打混匀,4 冰箱放置 30min,PBS 洗涤两次, 收集细胞沉淀, 加入 PBS 吹打混匀, 上流式细胞仪检测荧光表达量, 鼠 IgG 同型对照管调零 2 4 激光共聚焦显微镜进行免疫荧光观察细胞爬片,4%PFA 固定 10min,0 5%TritonX 100 穿孔 15min,PBS 漂洗两次, 每次 5min,1% BSA 封闭 30min, 加入 1% BSA 稀释的 3C8, 于 37 杂交 2h,PBS 漂洗 2 次, 每次 5min, 加入 1% BSA 稀释的二抗, 于 37 杂交 2h,PBS 漂洗 2 次, 每次 5min,10μg/mLRNA 酶作用 30min,PBS 清洗 1 次,50μg/mLPI 作用 30min,PBS 漂洗 1 次, 激光共聚焦显微镜观察 3C8 染色情况 2 5 Westernblot 分析采用化学发光显色的 Westernblot 分析, 具体实验操作参考试剂盒说明书进行简述如下 : 分别取细胞, 用预冷的 RIPA 细胞裂解液 0 5mL, 同时加入蛋白酶抑制剂, 裂解细胞取细胞裂解液 30μL, 经 12%SDS PAGE 电泳, 并电转移 (0 65mA/cm 2 ) 至硝酸纤维素膜上, 用 5% 脱脂奶粉封闭液 4 封闭过夜第 2 天分别加入纯化的 3C8 抗体室温孵育 1h, 用 TBST 洗去未结合的抗体, 加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗, 继续孵育 1h, 洗涤后加入 ECL 曝光显色 2 6 免疫组织化学染色 (SABC 法 ) 所有标本经 4% 甲醛液固定, 常规脱水石蜡包埋将石蜡组织块做厚度 4μm 连续切片脱蜡前将组织芯片及对照组织切片放在 60 恒温箱中烘烤 1~2h; 置于新鲜二甲苯 Ⅰ 和 Ⅱ 中分别浸泡 15min; 无水乙醇 Ⅰ,Ⅱ 中各浸泡 5min;95% 乙醇中浸泡 5min;85% 乙醇中浸泡 5min;75% 乙醇中浸泡 5min;PBS 洗涤 3 次, 每次 3min 37 3%

4 464 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4): 第 48 卷的过氧化氢 (H 2 O 2 ) 封闭 10min,PBS 洗 3 次, 每次 5min 取适量的 0 01mol/L 柠檬酸盐缓冲液 (ph 6 0) 于压力锅中大火加热至沸腾, 进行抗原热修复 10% 羊血清封闭液 37 孵育 30min 一抗 37 孵育 1h,PBS 洗涤 3 次二抗 37 孵育 30min,PBS 洗涤 3 次 DAB 显色 3~5min, 在显微镜下掌控染色程度 ; 自来水流水冲洗 10min, 终止染色苏木精复染, 自来水冲洗 50~60 温水复蓝,0 5% 盐酸酒精分化, 流水冲洗芯片依次放入 75% 乙醇 85% 乙醇 95% 乙醇无水乙醇二甲苯 Ⅰ 二甲苯 Ⅱ, 每次 1min 中性树胶封片, 待其自然干燥后镜下观察结果及分析 2 7 外周血淋巴细胞 (T 细胞 ) 的制备取正常志愿者外周血用 Hank s 缓冲液 1 1 稀释后, 缓慢加于 Ficol 分离液上,2000r/min 离心收集单核细胞层 (PBMCs), 洗涤 2 次后用 RPMI 1640 培养基置于 6 孔培养板中培养 4h(37,5% CO 2 ), 轻轻吸出悬浮细胞, 用 37 培养基轻洗依次, 富集 T 细胞用于后续实验 2 8 淋巴细胞增殖实验 CFSE 染色检测淋巴细胞增殖磁珠分选 CD4 + 和 CD8 + T 细胞,CFSE 染色 10min,PBS 清洗, 激发型鼠抗人 CD3 单抗包被 24 孔板,4 过夜, 吸去上清液,PBS 洗涤 3 遍用含 10%FCS 的 RPMI1640 培养基将 T 细胞调整为每毫升个, 接种于 24 孔板, 并加入 B7 H4 Ig, 或再加入 3C8, 将 CFSE 染色的 T 淋巴细胞放置 24 孔板培养 72h, 收集细胞, 流式检测 CCK8 法检测淋巴细胞增殖处理 96 孔板的方法同上, 收集的 T 淋巴细胞置于 96 孔板培养 24,48,72h 后加入 CCK8, 检测 495nm 处吸收度 T 细胞分泌细胞因子的检测取 T 细胞培养上清液,ELISA 法检测 IFN γ 和 IL 2 的分泌量, 按试剂盒说明书操作结果 3 1 鼠抗人 B7 H4 单克隆抗体 3C8 的纯化制备首先用杂交瘤细胞 3C8 注射小鼠腹腔, 获得腹水, 然后进行抗体的纯化抗体纯化的第 1 步是 HitrapProteinG 亲和色谱, 色谱条件及结果见图 1 A, 收集两个峰, 流式细胞仪检测与 B7 H4/293T 转基因细胞株的结合 ( 图 1 A), 发现峰 Ⅱ 可特异性地与 B7 H4 转基因细胞株结合, 说明峰 Ⅱ 是目标抗体接下来对亲和色谱获得的峰 Ⅱ 进行精制采用离子交换柱, 色谱条件及结果见图 1 B, 收集 5 个峰, 流式细胞仪检测与 B7 H4/293T 转基因细胞株的结合 ( 图 1 B), 发现峰 Ⅳ 可特异性地与 B7 H4 转基因细胞株结合, 说明峰 Ⅳ 是目标抗体接着对两步纯化法制备获得的样品进行纯度检测首先对第 2 步离子交换柱色谱获得的收集峰 Ⅳ 用反相柱色谱进行纯度检测, 色谱条件及结果见图 1 C, 软件分析其纯度为 93 16% 接着采用 SDS PAGE 电泳分析小鼠腹水亲和色谱获得的抗体组分及离子交换柱精制获得的抗体组分, 结果显示通过两步色谱纯化, 抗体的纯度越来越高, 最后获得的抗体电泳结果显示含有重链和轻链, 轻链相对分子质量约为 25kD, 重链相对分子质量约为 55kD ( 图 1 D) 3 2 单克隆抗体 3C8 结合特异性将纯化精制的 3C8 单克隆抗体与 Mock/293T 和 B7 H4/293T 转基因细胞结合, 结果显示 3C8 可特异性与 B7 H4/293T 转基因细胞结合, 而不与 Mock/293T 转基因细胞结合 ( 图 2 A), 说明 3C8 可特异性识别 B7 H4 分子由于 B7 家族成员一级序列及空间结构有高度相似性, 为进一步确认 3C8 识别 B7 H4 分子的特异性, 又检测了 3C8 与 B7 家族其他成员的转基因细胞的结合情况, 结果显示 3C8 不和 B7 家族其他成员的转基因细胞结合 ( 图 2 B) 3 3 单克隆抗体 3C8 的应用范围 3C8 抗体是通过流式筛选获得的, 因此该抗体明确可用于流式检测, 但是否能用于其他实验方法的检测尚未知, 因此通过一系列实验方法验证其用途首先进行免疫荧光实验, 结果显示 3C8 可成功染色 B7 H4/293T 转基因细胞株, 而 Mock/293T 细胞 3C8 不染色 ( 图 3 A), 说明该单抗可用于免疫荧光试验接着又进行免疫印迹, 发现 B7 H4/ 293T 细胞提取液用 3C8 进行 Westernblot 呈阳性结果,Mock/293T 则呈阴性结果 ( 图 3 B), 说明 3C8 抗体也可用于免疫印迹实验根据文献报道, 人正常组织基本不表达 B7 H4, 而肿瘤组织往往特异性高表达 B7 H4 [9], 因此收集了临床肾癌组织标本和癌旁正常组织, 前列腺癌组织标本及癌旁正常组织, 免疫组化染色结果显示前列腺癌旁正常组织

5 第４８卷第４期陈亚莉等Ｂ７Ｈ４单抗３Ｃ８的纯化及对肿瘤免疫逃逸的阻断作用研究４６５及肾癌旁正常组织Ｂ７Ｈ４都呈阴性表达图３Ｃ细胞ＣＤ３单克隆抗体刺激Ｔ细胞使其激活Ｈ４图３ Ⅰ Ⅲ 而肿瘤组织都特异性高表达Ｂ７Ｈ４可作为肿瘤诊断和治疗的ＣⅡ Ⅳ 说明Ｂ７一个靶分子３Ｃ８可作为特异性识别肿瘤组织Ｂ７分子与Ｔ细胞结合ＰＥ二抗染用购买的Ｂ７Ｈ４的一个抗体但可特异性与活化Ｔ细胞结合当加入３Ｃ８抗体３４３Ｃ８抗体可阻断Ｂ７Ｈ４分子的负性共刺激时由于３Ｃ８与Ｂ７的竞争结合阻断了Ｂ７活性与活化Ｔ细胞的结合图４Ａ当用ＣＦＳＥ由于已知Ｂ７Ｈ４通过与活化Ｔ细胞表面未知的结合情色流式细胞仪观察Ｔ细胞与Ｂ７况结果显示Ｂ７不与未活化的Ｔ细胞结合对活化Ｔ细胞染色后流式细胞仪观察ＣＤ４和受体结合而抑制Ｔ细胞功能为进一步研究３Ｃ８ＣＤ８Ｔ细胞的增殖分裂发现未激活的Ｔ细胞基抗体对Ｂ７Ｈ４功能的影响采集健康人外周血本不增殖分裂而被ＣＤ３单克隆抗体激活后Ｆ分离获得人单核细胞贴壁培养收集人淋巴时Ｔ细的Ｔ细胞分裂增殖旺盛当加入Ｂ７Ｆ１ＰｐＢ７Ｈ４ｍＡｂ３Ｃ８ｍｐＡＭｐＨｐｐＧｍＴｐｍｗｂｂｗＢ７Ｈ４２９３ＴｗｗｍＮｂＢＢＦｍｍｗｐＤＥＡＥＦＦｘｍｐｗＦｗｐＴｂｂｗＢ７Ｈ４２９３ＴｗｗｍＮｂＢＣＴｐｐＤＴｐｍｗＺｂｘ３００ｓｂＣ１９ｍｐｗｍｍｘｍｗＳＤＳＰＡＧＥｂ１Ａｂ２Ｆｍｍｂ３ＦＶｍｄｅａｅｆｆｍｂ４ＭｋＦ２Ｓｐｂｂｗｍａｂ３ｃ８Ｂ７Ｈ４ｗｍｂｂｗ３Ｃ８Ｂ７Ｈ４２９３ＴＢＦｗｍ３Ｃ８Ｂ７ｍｍｍｂＡＦ

6 ４６６学报ＪＣＰｍＵ２０１７４８４４６１４６８第４８卷Ｆ３Ｕ３Ｃ８ｍｍＷｂｍｍｍＡＵ３Ｃ８ｍｍｂＬｍｐＢＵ３Ｃ８ＷｂｂＭｋ２９３ＴＢ７Ｈ４２９３ＴＣＵ３Ｃ８ｍｍｍｂｍｐｍＰｍｐＰｍＰｍｍＶＲｍＦ４３Ｃ８ｂｋｂＢ７ｗＴｂＢ７ＴｐＡ３Ｃ８ｂｋｂＢ７ｗＴＢ３Ｃ８ｂｋｂＢ７ＴｐＣＴｐｗＣＣＫ８ｋ胞的增殖受到抑制但如果再加入３Ｃ８抗体则可３５３Ｃ８阻断Ｂ７对Ｔ细胞因子分泌的抑制阻断Ｂ７抑制Ｔ细胞的增殖作用图４Ｂ作用除了使用ＣＦＳＥ染色外又采用ＣＣＫ８检测了活化除了检测Ｔ细胞增殖的相关参数又采用Ｔ细胞的增殖作用结果显示Ｂ７可抑制Ｔ细ＥＬＳＡ法检测了Ｔ细胞因子ＦＮＡ和Ｌ２ γ 图５胞的增殖而３Ｃ８可阻断Ｂ７的抑制使Ｔ细图５Ｂ的分泌发现Ｂ７可抑制活化Ｔ细胞胞恢复正常的增殖作用图４Ｃ分泌细胞因子但３Ｃ８可阻断这种抑制作用

7 第 48 卷第 4 期陈亚莉, 等 :B7 H4 单抗 3C8 的纯化及对肿瘤免疫逃逸的阻断作用研究 467 Figure5 B7 H4 IginhibitedTcelcytokinesecretionand3C8abrogatedtheinhibition A:InterferonγandIL 2;B:SecretedbyTcelswasasayedbyELISA B7 H4 Iginhibitedthecytokinessecretionand3C8abrogatedtheinhibition 讨论 B7 H4 与 PD L1 和 CTLA 4 同属于 B7 家族分子, 作为免疫卡控点之一, 已被免疫学列入干预肿瘤免疫逃逸的靶点之一 [10-11] 由于 B7 H4 在肿瘤免疫逃逸中的作用机制与 PD L1 高度相似, 所以开发单克隆抗体干预肿瘤免疫逃逸的临床疗效预期性很高通常认为, 干预 B7 H4 的作用, 可以提高肿瘤浸润 T 淋巴细胞的作用, 提高免疫治疗的效果 [11] 有研究者将 B7 H4 的单克隆抗体 1H3 和 12D11 给小鼠注射, 发现它们可以显著抑制肿瘤生长, 增加 T 细胞和 NK 细胞的浸润, 降低 MDSC 的浸润, 延长生命 [12] 此外, 将幸存的小鼠给予 1H3 处理, 则发现这些小鼠能够抵抗肿瘤的再次侵袭 [12] 由实验结果可以推测 B7 H4 的单抗药物在肿瘤的免疫治疗中具有远大的前景, 并且 1H3 可能对其他的肿瘤的免疫治疗同样有效在卵巢癌小鼠肿瘤模型中,B7 H4 单克隆抗体单链可变区片段 (scfv) 能够延缓肿瘤的生长, 并且能够解除体外 B7 H4 + APC 细胞对肿瘤特异性 T 细胞活性的抑制 [13-14] 最近有学者研究发现, 将 B7 H4 单抗与抗有丝分裂药物偶联能够治疗乳腺癌 [15] 本研究发现,3C8 作为识别 B7 H4 的特异性单抗, 可阻断 B7 H4 Ig 对 T 细胞的增殖抑制及 T 细胞因子分泌的抑制作用, 具有潜在的应用价值 3C8 对肿瘤免疫逃逸的阻断作用的体内试验及其在肿瘤诊断和肿瘤治疗中的应用有待进一步研究参考文献 [1] BretscherPA.Atwo step,two signalmodelfortheprimaryacti vationofprecursorhelpertcels[j].procnatlacadsciusa, 1999,96(1): [2] SchildbergFA,KleinSR,FreemanGJ,etal.Coinhibitorypath waysintheb7 CD28 ligand receptorfamily[j].immunity, 2016,44(5): [3] SwaikaA,HammondWA,JosephRW.Curentstateofanti PD L1andanti PD 1agentsincancertherapy[J].MolImmunol, 2015,67(2PtA):4-17 [4] SicaGL,ChoiIH,ZhuG,etal.B7 H4,amoleculeoftheB7fam ily,negativelyregulatestcelimmunity[j].immunity,2003,18 (6): [5] PrasadDV,RichardsS,MaiXM,etal.B7S1,anovelB7family memberthatnegativelyregulatestcelactivation[j].immunity, 2003,18(6): [6] ZangX,LokeP,KimJ,etal.B7x:awidelyexpresedB7family memberthatinhibitstcelactivation[j].procnatlacadscius A,2003,100(18): [7] AwadalahNS,ShroyerKR,LangerDA,etal.DetectionofB7 H4 andp53inpancreaticcancer:potentialroleasacytologicaldiag nosticadjunct[j].pancreas,2008,36(2): [8] MiyatakeT,TringlerB,LiuW,etal.B7 H4(DD O110)isover expresedinhighriskuterineendometrioidadenocarcinomasand inverselycorelatedwithtumort celinfiltration[j].gynecol Oncol,2007,106(1): [9] PodojilJR,MilerSD.PotentialtargetingofB7 H4forthetreat mentofcancer[j].immunolrev,2017,276(1):40-51 [10] NiL,DongC.NewB7familycheckpointsinhumancancers[J]. MolCancerTher,2017,16(7): [11] MacGregorHL,OhashiPS.Molecularpathways:evaluatingthe potentialforb7 H4 asanimmunoregulatorytarget[j].clin CancerRes,2017,23(12): [12]JeonH,VigdorovichX,Garet ThomsonSC,etal.Structureand

8 468 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4): 第 48 卷 cancerimmunotherapyoftheb7familymemberb7x[j].cel Rep,2014,9(3): [13]DangajD,LanitisE,ZhaoA,etal.Novelrecombinanthumanb7 h4antibodiesovercometumoralimmuneescapetopotentiatet celantitumorresponses[j].cancerres,2013,73(15): [14] DangajD,ScholerN.IsolationandvalidationofAnti B7 H4 scfvsfrom anovariancancerscfvyeast displaylibrary[j]. MethodsMolBiol,2015,1319:37-49 [15] LeongSR,LiangWC,WuY,etal.Ananti B7 H4antibody drug conjugateforthetreatmentofbreastcancer[j].molpharm, 2015,12(6): 征订启事欢迎订阅 2018 年中国药科大学学报中国药科大学学报是由国家教育部主管中国药科大学主办的药学中文核心期刊, 主要刊登合成药物化学天然药物化学生药学中药学药剂学药物分析药代动力学药物生物技术药理学药事管理等学科的原创研究论著中国药科大学学报在药学界享有较高的学术声誉, 目前已被国际上多家著名权威数据库 (CA,IPA,SCOPUS, JST,IC,EMBASE/ExcerptaMedica,CAS) 等所收录, 被国内权威数据库 : 中国科学引文核心数据库 (CSCD 核心 ) 中文核心期刊要目总览 (2014 年版 ) 中国科技论文统计源数据库等列为药学类核心期刊, 屡获原国家新闻出版总署教育部科技部等各种优秀期刊奖 2008 年, 中国药科大学学报被评为中国精品科技期刊, 年连续 3 次被教育部评为中国高校精品科技期刊据中国知网, 中国学术期刊 ( 光盘版 ) 电子杂志社中国学术期刊影响因子年报 (2010 版 ) 公布的最新数据, 中国药科大学学报复合影响因子为 1 171, 位居中国药学学术期刊第 4 位学术影响力极高, 在高等院校科研机构制药企业医院等单位拥有众多读者本刊为双月刊,128 页国际标准开本, 国内外公开发行欢迎到当地邮局订阅, 漏订者可直接与编辑部联系国内刊号 :CN /R ISSN: 国内邮发代号 : 定价 :40 元 / 期, 全年 240 元地址 : 南京市童家巷 24 号邮政编码 : 电话 : 传真 : E mail:xuebao@cpu.edu.cn htp://www zgykdxxb cn

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人