中国水稻科学 (ChinJRiceSci),2013,27(5):447-456 htp://www.ricesci.cn DOI:10.3969/j.issn.1001G7216.2013.05.001 447 水稻 CYP81A6 基因干扰对其他基因表达的影响 杨阳 1 刘金华 1 高其康 1,2, (1 浙江大学农业与生物技术学院昆虫科学研究所, 杭州 310058;2 浙江大学农生环测试中心, 杭州 310058; 通讯联系人,EG mail:qkgao@zju.edu.cn) KnockdownofCYP81A6 GeneAfectsExpressionofOtherGenesinRice YANGYang 1,LIUJinGhua 1,GAO QiGkang 1,2, (1 Instituteof Insect Sciences,Colege of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University, Hangzhou 310058,China; 2AnalysisCenterof AgrobiologyandEnvironmentalSciences,Zhejiang University,Hangzhou310058,China; Corresponding author,egmail:qkgao@zju.edu.cn) YANG Yang,LIUJinhua,GAO Qikang.KnockdownofCYP81A6geneafectsexpressionofothergenesinrice.Chin JRiceSci,2013,27(5):447G456. Abstract:TostudytheefectsofknockdownthegeneCYP81A6 ongeneexpressionoftransgenicrice,wereportthe transcriptomeprofilinganalysisoftransgenicrice450g3andnormalcontrolricexiushui110.inthisstudy,mrnaof transgenicriceanditsparent(control)weredeeplysequenced,sequencesinformationobtainedandfunctionalgenes comparisonagainstthericegenedatabasewereanalyzed.resultsshowedthat3529genesintotalweresignificantly diferentialexpressed,amongwhich1018geneswereupregulatedand2511genesweredownregulated.thediferential expressedgenesdistributionofthetwosamplesshowedthattherewere2533genesexpressedinbothxiushui110and 450G3,633genesonlyexpressedinXiushui110,while363genesexpressedjustin450G3.Comparativeanalysiswith 296resistancegenesinthericedatabaseshowedthat64resistancegeneswereinvolvedinriceresistance,includingtwo insectgresistantgenes,17diseasegresistantgenesand45stressgresistantgenes,indicatingthatresistanceoftransgenic plant450g3wouldbeafected.geneenrichmentstudiesandfurtheranalysisshowedthatdiferentialexpressedgenes weresignificantlyenrichedin 38 GO termsand 13 KO termsin 450G3, heme binding (GO:0020037)and photosynthesis (KO00195)wereenrichedmostdramaticaly.Comparativetranscriptomeanalysisofthetransgenic rice450g3andxiushui110wasconductedtoclarifythechangesofgeneexpressionlevelin450g3.knockdownofgene CYP81A6 mayresultinextensiveandvariablechangeinthetranscriptomeof450g3.viewedfromthegeneevology point,theseobservationsmayprovidevaluableinformationtoaddressthesafetyofgeneticaly modifiedcrops,andit couldbeusedasanew methodforthesafetyevaluationofgeneticalymodifiedorganisms. Keywords:transgenicrice;CYP81A6;highGthroughputsequencing;diferentialexpressedgene;resistancegene 杨阳, 刘金华, 高其康. 水稻 CYP81A6 基因干扰对其他基因表达的影响. 中国水稻科学,2013,27(5):447G456. 摘要 : 为了明确抑制基因 CYP81A6 的表达对水稻的自身功能基因表达的影响, 对亲本水稻秀水 110 和转基因水稻 450G3 的 mrna 进行深度测序, 并将获得的序列信息通过水稻基因数据库和生物信息学手段进行注释和功能基因比较. 结果表明, 在 3529 个差异表达的基因中, 上调表达基因 1018 个, 下调表达基因 2511 个 ; 秀水 110 与 450G3 中共同表达的基因有 2533 个, 仅在 450G3 中表达的基因有 363 个, 仅在秀水 110 表达的基因有 633 个. 与水稻基因数据库功能已知的 296 个抗性基因对比, 发现 450G3 中差异表达的基因有 64 个功能已知且与水稻抗性相关, 包括 2 个抗虫相关基因,17 个抗病相关基因和 45 个抗逆相关基因, 预示着基因 CYP81A6 的抑制表达对水稻抗性会产生一定的影响.GO 功能和通路显著性富集分析显示, 差异表达基因显著富集在 38 个 GO 条目和 13 个通路上, 在结合能力 (GO:0020037) 和光合作用 (KO00195) 通路上富集最为显著. 通过对转基因水稻的转录组分析, 阐明转基因水稻基因与亲本相比发生的变化, 进而分析这些变化对转基因水稻产生的影响, 从基因生态学角度为转基因水稻的安全性评价提供科学依据, 可作为一种新的方法应用于转基因生物的安全性评价. 关键词 : 转基因水稻 ;CYP81A6; 高通量测序 ; 差异表达基因 ; 抗性基因中图分类号 :Q785;S511 032 文献标识码 :A 文章编号 :1001G7216(2013)05G0447G10 转基因作物给全球带来了巨大的经济和社会价 值, 随着该技术的广泛应用, 转基因作物已在全球大 面积种植.1997-1998 年, 在英国的实验显示转基 因土豆喂食老鼠后导致老鼠出现肝脏癌症早期症 收稿日期 :2013G05G15; 修改稿收到日期 :2013G08G05. 基金项目 : 浙江省自然科学基金重点资助项目 (Z3080241).
448 中国水稻科学 (ChinJRiceSci) 第 27 卷第 5 期 (2013 年 9 月 ) 状 睾丸发育不全以及免疫系统和神经系统部分萎 缩的异常现象 ;1999 年 «Nature» 杂志报道了转 Bt 基因的玉米花粉对美国的君王斑蝶 (Danaus plexippus) 产生了有害作用 [1], 转基因生物安全问题开始引起了人们的关注. 为了加强对转基因生物安全性评价的研究工 作, 国际组织和研究机构制定了 基于实质等同性 的转基因生物安全评价原则和标准. 该原则主要是 指将转基因作物及其转基因产品与非转基因同源对 照物在农艺性状 表型以及组成成分等方面进行比 较, 从而确定转基因产品与非转基因对照物的成分 是否实质等同, 基于这一原则对转基因生物进行安 全性评价 [2]. 目前, 转基因作物安全性所面临的问 题主要有两个方面 :1) 转基因作物的食用安全性 ;2) 基因释放 漂移对生态安全的影响. 而对转基因生 物自身功能基因影响评价的问题, 至今未能得到明 确的答案. 转基因技术对转基因水稻原有的功能基 因是否有影响, 这种影响对该转基因水稻的安全性 是否有威胁, 也就是目前我们基于对转基因生物的 安全评价是否科学全面. 细胞色素 P450 氧化酶系是植物体内一类具有 催化次生代谢物质生物合成的代谢酶系.P450 家 族基因庞大, 植物 P450 家族基因的编号从 CYP71 至 CYP99. 目前, 水稻中生物学功能已明确 P450 基因仅有 6 个 :CYP81A6 [3] CYP74A [4] CYP78A11 [5] CYP87A3 [6] CYP90D2 [7] CYP714D1 [8] [9].Lin 等发现可通过 RNA 干扰方 法抑制水稻体内抗苯达松和磺酰脲类除草剂的 P450 家族基因 CYP81A6 的表达, 从而达到用苯达 松对转基水稻进行选择性的灭杀. 本研究采用高通 量测序技术对苯达松敏感型转基因水稻 450G3 和亲 本秀水 110 所有 mrna 进行深度测序, 获得的序列 信息通过水稻基因数据库和生物信息学手段进行注 释和功能基因比较, 以阐明转基因水稻基因相比亲 本发生的变化, 进而分析这些变化对转基因水稻产 生的影响, 从基因生态学角度为转基因水稻的安全 性评价提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 供试植物 本研究中的植物材料有两种 : 亲本秀水 110 (Oryzasativa L.ssp.japonica) 和转基因水稻 450G3 [9] ( 利用 RNA 干扰技术构建了以 CaMV35S 和 为启动子 抗草甘膦基因 G6 为筛选基因的载体, 抑 制苯达松解毒酶基因 CYP81A6 的表达 ). 秀水 110 由浙江大学原子核农业科学研究所舒庆尧教授 提供, 转基因水稻 450G3 由浙江大学昆虫科学研究 所沈志成教授实验室提供. 1.2 生物测定 水稻种子浸种 24h, 催芽至露白后播于温室中 塑料槽内. 水稻苗在播种 7d 后移栽到塑料盆钵 中, 为筛选出 F1 中由于性状分离产生的非转基因水 稻苗, 选择生长状态相对稳定的 4~5 叶期, 分别进 行药效试验, 共设两对对照组, 其中秀水 110 均为对 照苗 :1) 对两种水稻都喷施苯达松 (2000 mg/l, 北 京燕化永乐农药有限公司, 北京 ), 以检测 450G3 是 否对苯达松敏感 ;2) 在两种水稻叶片上涂抹苯达松, 取水稻苗中任一正常生长叶片, 涂抹苯达松药剂 (2000mg/L), 以筛选出转基因稻苗供后面试验中 使用. 1.3 靶基因检测 用 CTAB 法将用苯达松筛选得到的 4~5 叶期 转基因苗单株 DNA, 并分别对其进行 PCR 验证. [9] 根据 Lin 等的研究,450G3 中存在一段 440bp 的 片段. 利用已知引物 35sR(CTCGAAGCTTACGT TTTTAATGTACTGAAT) 和 450R(AGATCTCC TTCTTGACGAGGTGGAGGTGT), 进行 PCR 验 证, 引物为上海生工生物工程有限公司合成. 1.4 总 RNA 的提取和 cdna 文库的制备 根据 Trizol (Invitrogen,Gaithersburg,MD, USA) 试验操作方法, 将苯达松筛选出的 4~5 叶期 转基因苗分别单株提取总 RNA.cDNA 测序文库 制备按照 RNA 样品文库构建试剂盒 (Ilumina TruSeqRNASamplePreKitv2,Ilumine,USA) 说明进行. 1.5 超高通量转录组测序 用超高通量测序法 (Ilumina Hiseq TM 2000 platform) 对两种水稻转录组进行测序. 测序产生的序列文件, 根据 Q20 过滤原则 ( 每条序列至少有 30% 的碱基的质量值 20 分 ) 过滤掉低质量的序 列. 利用 TopHat1.3.1 将对应的序列映射到水稻 库 (IRGSPbuild5), 根据序列数目来统计每个基因 的表达丰度, 基因表达量的计算使用 RPKM(reads perkbper Milionreads) 法. 依据 RPKM 值, 将 RPKM 值大于 0.5 的基因视作表达基因. 根据 AuG [10] dic 等的方法进行统计学分析, 差异表达基因定
杨阳等 : 水稻 CYP81A6 基因干扰对其他基因表达的影响 449 义为错误发现率 (falsediscoveryrate,fdr) 小于或 等于 0.01, 且倍数差异在 2 倍以上 ( log2ratio > 1) 的基因, 其中 FDR 值指点错误 发现率 (falsediscoveryrate). 在 GO 功能显著性 富集分析 (GO,htp://www.geneontology.org) 和 KEGG 通路显著性富集分析 (KyotoEncyclopedia ofgenesandgenomesdatabase) 中, 将 P <0.01 的 GO 条目和 KO 条目视为显著性富集. 1.6 靶基因的荧光定量 PCR 检测 按照反转录酶试剂盒 [TaKaRaPrimeScript I 1stStrandcDNA Synthesis Kit, 宝生物工程 ( 大 连 ) 有限公司, 大连 ] 说明进行, 将提取的 RNA 合成 [11] cdna. 对于转基因水稻 450G3, 参考 Zhang 等 报道的 CYP81A6 基因, 设计特异引物 450F(TGCA TCTCCAGGACGAACTCATGT) 和 450R(AGCG CAGTCACTCTCTTCCAAATC), 内参基因为 Actin(F:TGGTCGTACCACAGGTATTGTGT88 T;R:AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT); 引 物由上海生工生物工程有限公司合成.PCR 扩增 条件如下 :95 下预变性 2 min,95 下 15s,60 下 15s,68 下 20s,40 个循环. 2 结果与分析 2.1 转基因植株的生物学测定和靶基因检测 水稻亲本秀水 110 中存在对苯达松的解毒酶, 对苯达松不敏感, 而转基因水稻 450G3 对苯达松敏 感. 在生物测定中, 对 450G3 和秀水 110 都喷施苯达松,450G3 死亡, 而秀水 110 正常生长 ( 图 1GA); 为筛选掉转基因水稻 450G3 的 F1 中由于性状分离而产生的对苯达松不敏感植株, 对 450G3 的每株水稻取任一叶片涂抹苯达松, 叶片在 5d 内枯萎的为转基因植株, 而正常生长的为非转基因植株 ( 图 1GB). PCR 验证结果表明, 在转基因水稻 450G3 中能扩增出一段 440bp 的片段, 在秀水 110 中没有扩增到该片段 ( 图 1GC). 2.2 测序数据统计分析用超高通量测序法分别对两种水稻转录组进行测序, 根据测序产生的序列文件, 所提供的两个样本秀水 110 和 450G3 分别获得 33878012 和 26715880 条序列, 产生 3.38 亿和 2.67 亿个碱基. 经 Q20 过滤掉低质量的序列后的统计分析显示, 两个样本分别获得 2.84 亿和 2.21 亿个碱基 ( 表 1). 2.3 基因表达分析 2.3.1 基因表达数据统计利用 TopHat1.3.1 将每个样品中对应的序列映射到水稻基因数据库, 根据序列数目来统计每个基因的表达丰度. 两个材料映射到水稻基因数据库的基因总数均为 34792 个, 在亲本秀水 110 中, 基因表达数目为 22532 个, 占水稻总基因数量的 64 76%; 转基因水稻 450G3 中, 基因表达数目为 22067 个, 占水稻总基因数量的 63.43%. 两者比较发现, 秀水 110 和 450G3 中共同表达的基因有 A- 转基因水稻对苯达松的敏感性测定 ;B- 转基因植株筛选 ;C-PCR 验证转基因水稻 ;CK- 秀水 110;1- 转基因水稻 450G3;M-2000bp 分子量标记. A,Sensitivitytestoftransgenicriceplantstobentazon;B,Screeningoftransgenicplants;C,PCRanalysisoftransgenicplants;CK,Xiushui 110(theparentof450G3);1,Transgenicrice450G3;M,2000bp Marker. 图 1 转基因水稻的生物学测定和靶基因检测 Fig.1.Bioasayandtargetgenedetectionoftransgenicplants.
450 中国水稻科学 (ChinJRiceSci) 第 27 卷第 5 期 (2013 年 9 月 ) 表 1 高通量测序数据统计 Table1.Summaryofsequencingasemblyafteriluminasequencing. 数据类别样品名称 Datatype Samplename 总序列数 Totalreads 双端总序列数 序列长度 总碱基数 Totalreadpairs Readlength Totalbase (Pairedend) /bp pairs/bp 原始数据 Rawdata 秀水 110Xiushui110 33878012 16939006 100 3387801200 450G3 26715880 13357940 100 2671588000 过滤后数据 Filtereddata 秀水 110Xiushui110 28356342 14178171 100 2835634200 450G3 22088422 11044211 100 2208842000 21182 个, 仅在秀水 110 中表达的基因有 1350 个, 仅在 450G3 中表达的基因有 885 个 ( 图 2GA). 2.3.2 差异表达基因在总的 3529 个差异表达基因中,1018 个基因上调表达,2511 个基因下调表达. 仅在 450G3 表达的基因有 363 个, 仅在秀水 110 中表达的基因有 633 个 ( 图 2GB). 在 450G3 表达上调最显著的 10 个基因中, 仅有 2 个基因的功能已知 : 羟脯氨酸糖蛋白 GAS31 和肽酶基因 ; 在表达下调最显著的 10 个基因中,3 个基因的功能已知 :RIR1b 蛋白 OSIGBa0140C02.4 蛋白和非蛋白编码基因. 与水稻基因数据库功能已知的抗性基因对比发现 : 转基因水稻 450G3 中有 64 个基因功能已知, 包括 2 个抗虫相关基因,17 个抗病相关基因和 45 个抗逆相关基因. 表 2 列出了抗虫相关基因以及差异表达倍数前 10 位的抗病和抗逆相关基因. 2.4 GO 显著性富集分析 GO 功能显著性富集分析能给出相比基因组背景差异表达基因中显著富集的 GO 功能条目, 从而给出差异表达基因与哪些生物学功能显著相关. 对 450G3 中 3529 个差异表达的基因进行 GO 分析, 结 果发现在细胞 (cel) 细胞部件 (celpart) 结合能力 (binding) 催化 (catalytic) 细胞过程 (celular process) 和代谢过程 (metabolicprocess) 方面映射的差异表达基因最多 ( 图 3). 两种水稻所有基因向 GeneOntology 数据库的 各个条目映射后, 得到 1516 个 GO 条目. 与亲本 秀水 110 相比, 转基因水稻 450G3 中差异表达基因 显著富集的 GO 条目有 38 个, 占总数的 2.51%, 其 中 22 个 (57.90%)GO 条目归属分子功能大类,14 个 (36.84%)GO 条目归属生物过程大类, 仅有 2 个 (5.26%)GO 条目归属细胞成分大类.GO 功能显 著性富集结果显示, 在结合能力 (hemebinding) 电 子载体活性 (electroncarrieractivity) 转录调控 (regulationoftranscription) 代谢过程 (metabolic process) 氧化还原酶活性 (oxidoreductaseactivity) 这 5 个 GO 条目上富集的差异表达基因数目较多. 显著性富集前 10 位的 GO 条目见表 3. 2.5 通路显著性富集分析 两种水稻所有基因向 KEGG 数据库的各个条 目映射后, 得到 284 个 KO 条目. 将差异表达的 图 2 秀水 110 和 450G3 中的总表达基因 (A) 和差异表达基因 (B) 分布 Fig.2.Distributionoftotalexpresedgenes(A)anddiferentialexpresedgenes(B)inXiushui110and450G3.
杨阳等 : 水稻 CYP81A6 基因干扰对其他基因表达的影响 451 表 2 450G3 中差异表达前 10 位的功能已知抗性基因 Table2.Thetoptenfunctionaldefinedresistancegenesdiferentialyexpresedin450G3. 基因功能分类 基因 差异表达倍数 基因功能注释 Genetype GeneID Foldchange 抗虫基因 InsectGresistantgene Os06t0604200-3.34 磷脂酶 D(OsPLDα4) Geneannotation Os08t0139700-1.33 水稻 (E)GβG 丁香烯合酶 (OsTPS3) 抗病基因 DiseaseGresistantgene Os06t0569500 1.05 贝壳杉烯氧化酶基因 (OsKOS1) Os09t0518200 1.64 水杨酸葡萄糖基转移酶基因 (OsSGT1) Os04t0401000-2.10 稻瘟病抗性基因 (pig21) Os02t0654700-2.12 水稻乙烯反应元件结合蛋白基因 (OsBIERF3) Os07t0592600-2.25 吲哚乙酸氨基化合成酶基因 (OsGH3G8) O450G3t0508600-2.43 水稻白叶枯病感病基因 (OsG11N3) Os02t0771400-2.66 蛋白酪氨酸磷酸酶 (OsPFAGDSP2) Os04t0578000-2.87 1G 氨基环丙烷 G1G 羧酸合酶基因 (OsACS2) Os03t0225900-2.90 丙二烯氧合酶基因 (OsAOS2) Os02t0181300-3.09 WRKY 转录因子 (OsWRKY71) 抗逆基因 StressGresistantgene Os08t0174500 1.20 开花抑制因子 ; 籽粒产量 株高和抽穗期多效性控制基因 ; 正值为上调 ; 负值为下调. PositiveforupGregulatedandnegativefordownGregulated. CCAAT 盒结合蛋白 HAP3 亚基 (DTH8) Os02t0610500 1.70 水稻开花抑制因子 (OsCOL4) Os03t0161900 1.97 热激转录因子基因 (OsHsfA2d) Os01t0930400 2.19 钾转运蛋白 (OsHAK5) Os01t0919100 9.28 柠檬酸盐转运体 (OsFRDL4) O450G3t0126900-3.25 NAC 转录因子基因 (OsNAC10) Os01t0952800-3.53 水稻 bhlh 转录因子 (OsIRO2) Os05t0542500-4.33 晚期胚胎富集蛋白基因 (OsLEA3) Os04t0572400-4.95 AP2/EREBP 转录因子基因 (OsDREB1E) Os04t0659300-9.24 水稻受体激酶基因 (OsRMC) 表 3 富集前 10 位 GO 条目上的差异基因数目 Table3.NumbersofdiferentialexpresedgenesintoptenenrichedGOterm. GO 条目 GOterm 差异表达基因数 Diferential expressed genenumber 总基因数 Algene number 案例基因数 Casegenenumber 上调 UpG regulated 下调 DownG regulated P 值 PGvalue GO 注释 GOannotation GO:0020037 102 545 25 77 3.45 10-11 结合能力 Hemebinding GO:0009055 119 703 28 91 2.23 10-9 电子载体活性 Electroncarrieractivity GO:0004497 68 356 19 49 2.48 10-8 单加氧酶活性 Monooxygenaseactivity GO:0045449 116 707 18 98 3.01 10-8 转录调控 Regulationoftranscription GO:0005506 76 451 20 56 2.33 10-6 铁离子结合 Ironionbinding GO:0008152 195 1412 41 154 3.10 10-6 代谢过程 Metabolicprocess GO:0016211 7 9-7 3.60 10-6 氨连接酶活性 Ammonialigaseactivity GO:0016841 7 9-7 3.60 10-6 转氨酶活性 AmmoniaGlyaseactivity GO:0006559 7 10-7 1.09 10-5 LG 苯丙氨酸降解过程 LGphenylalaninecatabolicprocess GO:0009765 9 17 8 1 1.43 10-5 光合作用, 光捕获 Photosynthesis,lightharvesting - 表示无差异表达基因. -,Nodiferentialexpressedgenes.
452 中国水稻科学 (ChinJRiceSci) 第 27 卷第 5 期 (2013 年 9 月 ) 图 3 差异表达基因的 GO 分类 Fig.3.Histogrampresentationofgeneontologyclasificationofdiferentialespresedgenes. 3529 个基因向 KEGG 数据库的各个条目映射后, 进行通路显著性富集分析 : 差异表达基因显著富集在 13 个 KO 条目上 ( 表 4), 占总数目的 4.58%. 其中, 光合作用 (KO00195,photosynthesis) 通路富集最为显著. 此外, 在氮代谢 (KO 00910,nitrogen metabolism) 苯丙素合成 (KO00940,phenylproG panoidbiosynthesis) 苯丙氨酸代谢 (KO 00360, phenylalaninemetabolism) 转录因子 (KO03000, transcriptionfactors) 植物激素信号转导 (KO 04075,planthormonesignaltransduction) 氨基糖和核苷酸糖代谢 (KO00520,aminosugarandnuG cleotidesugar metabolism) 植物病原互作 (KO 04626,plantGpathogeninteraction) 以及淀粉和蔗 糖代谢 (KO 00500,starchandsucrose metabog lism) 通路上富集的差异表达基因数目较多. 在氮代谢和植物病原互作这两个通路中富集的差异表达基因均为下调, 而在光合天线蛋白通路中富集的差异表达基因均为上调.450G3 中显著富集的 KO 条目见表 4. 2.6 功能基因的 RTGPCR 验证对靶基因 CYP81A6 P450 基因 CYP78A9 [12] 和 CYP86A1 [13] 以及 450G3 中上下调最显著的两个基因 STBXGAS31( 上调倍数为 15.37) 和 RIR1b ( 下调倍数为 17.85), 进行荧光定量 PCR 验证. 结果表明, 与亲本秀水 110 相比,P450 家族基因 CYP78A9 和基因 GAS31 在转基因水稻 450G3
杨阳等 : 水稻 CYP81A6 基因干扰对其他基因表达的影响 453 表 4 富集 KO 条目上的差异基因数目 Table4.NumbersofdiferentialexpresedgenesinenrichedKOterm. 差异表达基因数总基因数 KO 条目 Diferential Algene KOterm expressed number genenumber Case 基因数 Casegenenumber 上调 Up regulated 下调 Down regulated P 值 KO 注释 PGvalue KOannotation KO00195 14 41 12 2 1.43 10-6 光合作用 Photosynthesis KO00910 12 32-12 2.65 10-6 氮代谢 Nitrogenmetabolism KO00196 8 15 8-5.63 10-6 光合作用细胞中的天线蛋白 PhotosynthesisGantennaproteins KO00940 15 53 1 14 8.56 10-6 苯丙素生物合成 Phenylpropanoidbiosynthesis KO00360 13 48 2 11 5.77 10-5 苯丙氨酸代谢 Phenylalaninemetabolism KO03000 21 108 1 20 8.10 10-5 转录因子 Transcriptionfactors KO04075 22 129 5 17 4.05 10-4 植物激素信号转导 Planthormonesignaltransduction KO00520 17 89 4 13 4.85 10-4 氨基糖和核苷酸糖代谢 Aminosugarandnucleotidesugarmetabolism KO04626 13 68-13 2.20 10-3 植物病原互作 PlantGpathogeninteraction KO00904 5 15 3 2 4.69 10-3 双萜类生物合成 Diterpenoidbiosynthesis KO00500 15 95 2 13 7.08 10-3 淀粉和蔗糖代谢 Starchandsucrosemetabolism KO02000 5 17 1 4 8.48 10-3 转运子 Transporters KO04540 5 17 1 4 8.48 10-3 缝隙连接 Gapjunction - : 无差异表达基因. -,Nodiferentialexpressedgenes. 图 4 基因表达量的荧光定量 PCR 的一致性验证 Fig.4.qRTGPCRvalidationofexpressionofsomegenes. 中均显著上调表达, 而基因 CYP81A6 P450 家族基因 CYP86A1 和基因 RIR1b 在 450G3 中表达均显著下调, 该结果与测序结果一致 ( 图 4). 3 讨论本研究利用超高通量测序技术对转基因水稻和亲本所有 mrna 进行深度测序, 并用生物信息学手段进行注释和功能基因比较, 可明确利用 RNAi 技术抑制基因 CYP81A6 的表达对亲本水稻自身基因的表达产生影响. 其中包含对部分水稻抗性相关基因的影响, 而对抗病和抗逆境的影响尤为明显. 抗虫相关基因 OsPLDα4 在虫害诱导水稻的直 接及间接防卫过程中起重要作用 [14] ;OsTPS3 基因 可以催化合成挥发性倍半萜烯, 在水稻植株间接防 御中有重要作用 [15]. 本研究中, 基因 OsPLDα4 和 OsTPS3 在 450G3 中的表达明显下调, 说明基因 CYP81A6 的抑制表达有可能对水稻的抗虫防御过 程产生不利的影响. 在抗病相关上下调表达最显著的 10 个基因中, 6 个基因与水稻的病原菌抗性相关,4 个基因涉及水 稻的抗病应答及防卫反应. 与病原菌抗性相关的基 因中,OsKOS1 [16] 体外与水稻矮缩病毒 P2 蛋白作 用会导致水稻矮缩病的形成, 该基因在 450G3 中上 调表达将有可能降低水稻植株对矮缩病的抗性. 此 外, 其他 5 个与病原菌抗性相关基因在 450G3 中均 下调表达. 其中,OsACS2 [17] 和 pig21 [18] 基因与水 稻稻瘟病抗性相关 ;OsAOS2 [19G20] 的过量表达会提 高植株对真菌感染的寄主抗性, 这 3 个基因的下调 表达可能会导致 450G3 植株对稻瘟病等真菌性病害 的抗性减弱. 基因 OsG11N3 [21] 在促进白叶枯病发 病过程中发挥特异作用,OsPFAGDSP2 [22] 在水稻中 负调控转基因植株对病原菌的响应, 这两个基因在 450G3 内均为负调控植株对病原菌的抗性, 其下调 表达将有可能提高 450G3 对白叶枯病以及其他病原 菌的抗性. 与水稻抗病应答及防卫反应相关的基因
454 中国水稻科学 (ChinJRiceSci) 第 27 卷第 5 期 (2013 年 9 月 ) 中,OsSGT1 [23] 是水稻化学诱导抗病性的关键因子, 该基因在 450G3 中的上调表达预示着植株在化学诱 导方面的抗病性将有可能会有所提高. 基因 OsG BIERF3 [24] OsWRKY71 [25] 和 OsGH3G8 [26G27] 均在 450G3 植株的抗病应答以及防卫反应中起重要作 用, 这些基因的下调表达将有可能对 450G3 的抗病 反应产生不利的影响. 在抗逆相关上下调表达最显著的 10 个基因中, 4 个基因与水稻盐胁迫防御相关,3 个基因与耐旱性 相关, 另有 2 个开花抑制因子和 1 个热胁迫防御因 子. 与盐胁迫相关的基因中,OsFRDL4 [28] 是水稻 对高铝耐受的一个组分,OsHAK5 [29] 能够用来提高 植物细胞对盐的耐受性, 这两个基因在 450G3 中的 上调表达将有可能提高植株的耐盐性. 基因 OsG IRO2 [30] 是水稻在缺铁条件下铁吸收基因的关键调 节因子,OsRMC [31G32] 在植物的盐胁迫反应中也起到 非常重要的作用. 这两个基因在 450G3 中均显著下 调表达. 目前已有研究报道, 在缺铁条件下,OsG IRO2 RNAi 植株的生长受到抑制 叶片发黄 ; 而基 因 OsRMC 在 RNAi 植株内的下调表达, 会导致转 基因株系的种子萌发对盐胁迫不敏感, 植株生长受 抑. 耐旱性相关基因中,OsNAC10 [33] 在水稻根部 的特异表达会增大根系, 提高水稻抗干旱能力和产 量 ;OsDREB1E [34] 的过量表达可以略微提高水稻 耐旱性 ;OsLEA3 [35] 与水稻的耐旱性有关, 带有合 适启动子的 OsLEA3G1 的过表达植株耐旱性显著 增强, 这 3 个基因的下调表达将可能对 450G3 植株 的耐旱性产生不利的影响. 基因 OsCOL4 [36] 和基 因 DTH8 [37] 均是水稻中的开花抑制因子, 基因 OsHsfA2d [38] 是水稻热胁迫防御响应中的中心调 节子. 这 3 个基因在 450G3 中的上调表达将有可能 对 450G3 植株的花期以及热胁迫防御产生直接的影 响. GO 功能显著性富集分析显示转基因水稻 450G 3 中差异表达基因显著富集的生物功能有 38 种, 其 中 36 种主要归属分子功能大类和生物过程大类. 这说明 RNAi 技术干扰基因 CYP81A6 的表达会对 450G3 的分子功能和生物过程产生主要影响. 与 RNAi 靶基因 CYP81A6 映射的 GO 条目有 4 个 : 单 加氧酶活性 (GO:0004497) 铁离子结合能力 (GO: 0005506) 亚铁血红素结合能力 (GO:0020037) 和 电子载体活性 (GO:0009055). 这 4 个 GO 条目均 位于 450G3 中显著富集的 GO 条目前 5 位, 表明 CYP81A6 对基因的抑制表达会对其家族其他同功能基因产生重要影响. 通路显著性富集分析显示,450G3 中有 13 个通路显著富集差异表达基因, 这预示着在转基因水稻 450G3 植株内这些生物合成途径将有可能会受到显著影响. 其中, 光合作用 (KO00195) 通路受到的影响最为显著. 靶基因 CYP81A6 在水稻体内与 5 条通路相关 : 二苯乙烯类化合物 姜酚的生物合成 (KO00945) 双酚降解 (KO00363) 多环芳香烃的降解 (KO 00624) Famino 苯甲酸的降解 (KO 00627) 以及柠檬烯和 αg 蒎烯的降解 (KO00903). 对所有与这 5 条通路相对应的基因进行分析发现, 仅有 4 个基因与这些通路对应, 包括 1 个邻羟基肉桂酸转移酶基因,1 个 P450 家族基因和两个醛脱氢酶基因. 对比发现仅 P450 基因是 5 条通路共有的基因, 预示该基因与靶基因 CYP81A6 可能有某种程度的联系. 在富集最显著的 5 条通路中,2 条通路与光合作用相关 (KO00195,KO00196),2 条通路与苯丙素合成代谢相关 (KO00940,KO00360), 另 1 条通路与氮代谢 (KO00910) 相关. 目前已有研究表明, 苯丙氨酸代谢通路中的苯丙氨酸裂解酶与植物的防御系统相关, 这预示着基因 CYP81A6 的抑制表达将有可能导致 450G3 植株的抗病性发生 [39] 改变. 本研究结果表明, 基因 CYP81A6 的抑制可对亲本水稻原有的基因表达产生一定的影响, 这些影响有正效应, 也有负效应, 可为转基因水稻的安全性评价提供科学依据. 参考文献 : [1] LoseyJE,RayorLS,CarterM E,etal.Transgenicpolen harmsmonarchlarvae.nature,1999,399(6733):214g214. [2] Novak W K,HaslbergerA G.SubstantialequivalenceofantiG nutrientsandinherentplanttoxinsingeneticalymodifiednog velfoods.food & Chem Toxicol,2000(38):473G483. [3] PanG,ZhangX Y,LiuK D,etal.MapGbasedcloningofa novelricecytochromep450genecyp81a6thatconfersresistg ancetotwodiferentclassesofherbicides.plant MolBiol, 2006,61:933G943. [4] LeeDS,NiocheP,HambergM,etal.Structuralinsightsinto theevolutionarypathsofoxylipinbiosyntheticenzymes.nag ture,2008,455:363g368. [5] MiyoshiK, Ahn B O, KawakatsuT, etal. PLASTOG CHRON1,atimekeeperofleafinitiationinrice,encodescytoG chromep450.pnas,2004,101:875g880.
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