1.Rh 血型系统简介 2.MLPA 检测平台概述 3. 材料和方法 4. 结果 5. 讨论

MLPA 技术在 2 例罕见部分 D 表型等位基因检测中的应用 广州血液中心 骆 宏

1.Rh 血型系统简介 2.MLPA 检测平台概述 3. 材料和方法 4. 结果 5. 讨论

Rh 血型系统简介 Rh 血型系统是所有血型系统中最为复杂的血型统, 包括 RH1~RH53, 其中 7 个已弃用, 总共 46 个抗原 最为重要的是 RH1(D) 抗原 RH2-5 抗原依次为 :c e C E 抗原编码基因 : 位于 1 号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因编码, RHD 基因编码 D 抗原 ;RHCE 基因编码 Cc 和 Ee 抗原

Rh 血型系统简介 RH 基因座位结构及 RHD 缺失原理示意图 RHD 基因与 RHCE 基因在 RH 座位上方向相反, 但与 SMP1 基因方向相同 ( 图中空心箭头 ) ; RHD 阴性单倍体 RHD 基因缺失发生在上下游盒子的接合区之间 RHD/CE 基因的相似度高达 93.8%

Rh 血型系统简介 关于 RhD 表型 1.RhD 阳性中国汉族 : 约 99.7% 白人 : 约 85% 2.RhD 阴性中国汉族 : 约 0.3% 白人 : 约 15% 3. 弱 D(Weak D) 4. 部分 D(Partial D) 5.Del 型 D Variant(D 变异型 )

MLPA 检测平台概述 MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification, MLPA) 技术最早由荷兰学者 Dr.Schouten JP 于 2002 年提出是一种可以对目标序列同时进行定性和定量分析的高通量新技术 该技术已广泛的应用于基因检测及基因诊断等多个领域, 如染色体数目异常 遗传性疾病基因缺失重复 ( 如 DMD) 基因甲基化检测等, 在血型基因的研究方面目前处于起步阶段 在欧洲, 目前开发的 RH-MLPA 技术不但可以用于正常 RHD/CE 基因的检测分析, 也可以用于变异型 RHD/CE 的相关分析

MLPA 检测平台概述

MLPA 检测平台概述 该技术设计了 38 种针对 RHD 基因位点的探针 ( 含 17 种野生型 21 种常见突变型 ), 可以分别与野生型或突变型的 7 个外显子 ( 外显子 3-7,9,10) 和部分内含子互补结合,10 种针对 RHCE 基因的探针 ( 含 5 种野生型 5 种常见突变型 ) 探针信号峰的有无代表相应等位基因的存在或者缺失, 因此, 野生型 / 突变型探针组合可以检测 RHD/CE 基因的野生型别 / 突变型别, 通过比较待检标本与内对照的峰值高低, 就可以得出其两条染色体上的等位基因数量 ; 突变型探针组合则可以检测到两条染色体上的等位基因是否存在有探针对应的突变位点 RH-MLPA 一次单管反应可以检测多达 79 种的 RHD 突变等位基因 17 种 RHCE 突变等位基因

MLPA 检测平台概述 MLPA 技术具有特异性强 灵敏度高 可重复性好 硬件要求不高 可以实现高通量检测 可进行定量分析等优势 在进行基因特异位点检测的同时, 通过与已知基因拷贝数对照标本的比较, 得到有关基因拷贝数的定量分析结果

材料和方法 研究对象 1 号标本 : 某孕妇, 汉族,31 岁,G4P0A3, 现孕 32 周, 无输血史 因在当地医院孕检时发现其 RhD 血型异常, 遂来我中心做进一步鉴定 2 号标本 : 某男, 汉族,28 岁, 因在当地医院行术前备血时发现其 RhD 血型有异常, 为进一步定型, 遂送至我中心进一步鉴定

材料和方法 血清学实验 RhD 血型鉴定 抗筛 直抗 Rh 其他抗原分型 标本 DNA 提取 RHD 和 RHCE 基因检测 PCR-SSP 法 MLPA 检测受检者 RHD/CE 基因突变及拷贝数

结果 血清学实验 标本编号 IgM 抗 -D IgG 抗 -D 直抗 Rh 分型 1 2+ 4+ - Ccee 2 2+ 4+ - Ccee

结果 PCR-SSP 结果 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M Internal control Positive Internal control Positive Fig.1 RH CDE gene determined by PCR-SSP A: Exons of RH D gene, no positive bands in line 3 and line 4, indicating the deletion of exons 3-5. B: RH CE gene, no positive band in line 3, indicating the deletion of E gene, positive bands in line 1, 2 and 4 mean the C, c and e gene. M: marker.

结果 MLPA 检测结果 Fig. 2 Peak fig of RH CDE gene of internal control and subject sample Red peaks represent the internal control, blue peaks represent the subject samples. Fig1 and 3 are the positive control test result, fig2 and 4 are subject sample test results. The black arrows mean homozygous deletion of exon3-5 of RHD gene, the purple arrow means the variant peak value of CE05(e)-676G,indicating the copy numbers of e(rhce) gene is 3.

结果 MLPA 检测结果 Fig. 2 Peak fig of RH CDE gene of internal control and subject sample Red peaks represent the internal control, blue peaks represent the subject samples. Fig1 and 3 are the positive control test result, fig2 and 4 are subject sample test results. The black arrows mean homozygous deletion of exon3-5 of RHD gene, the purple arrow means the variant peak value of CE05(e)-676G,indicating the copy numbers of e(rhce) gene is 3.

结果 MLPA 检测结果 Table 1 Comparison between Patients and positive control for the peak value of RH CDE gene. 0.75< Peak Value >1.30 Probes Exons of RH CDE Patient 1 Patient 2 Positive control D02 D02 0.715 0.677 D03-380T D03 0.000 0.000 D03 D03 0.000 0.000 D04 D04 0.000 0.000 D04 D04 0.000 0.000 D05-667T D05 0.000 0.000 D05 D05 0.000 0.000 D05 D05 0.000 0.000 D06 D06 0.510 0.537 D07 D07 0.615 0.629 D07 D07 0.549 0.581 D07 D07 0.565 0.559 D09 D09 0.532 0.561 D10 D10 0.582 0.547 CE05(E) E05 0.000 0.000 CE05(e) e05 3.486 2.974 CE02(c) c02 1.130 1.036 MD,BigC C01 0.924 0.984

结果 MLPA 检测结果 标本编号基因变异情况 RHD 杂合性基因型 RhD 定型 1 E3-5 deletion D/d CDe/cde D Cat.VI type4 2 E3-5 deletion D/d CDe/cde D Cat.VI type4

讨论 1. 关于部分 D RH 血型系统中的部分 D 表型, 其血清学特点往往表现为与某些单克隆抗 -D 有凝集反应出现, 而与某些单克隆抗 -D 则不出现凝集反应, 血清中可存在同种抗 -D 中国人群中发现的部分 D 表型有 D VI type3, D V type2,d V type1,d V type 4, 以 D VI type3 型为主 本研究中的 2 例 D Cat. VI type 4 比较罕见, 在中国人群中属首次发现 部分 D 表型形成的分子机制主要是 RHD/CE 基因编码区部分外显子的杂交融合或者点突变导致其膜外蛋白的部分抗原表位缺失, 从而形成了部分 D

讨论 2. 检测方法分析 部分 D 表型的检测, 除了血清学方法之外, 分子生物学方法是常用的手段, 包括 PCR-SSP PCR-RFLP RHD 基因全长测序分析等 这些方法学中,PCR-SSP 由于不能检测 RHD 基因的拷贝数, 无法分离其单倍型进行检测, 所以, 对于一些杂合的 RHD 基因型则存在判读不全的可能 如 :Del/DVI,D/DVI,weak D/D VI, 可能会分别判读为 Del D weak D; 基因全长测序还需要结合 RhD 杂合型分析才能检测出 RHD 基因的杂合状态, 而且这些方法步骤相对繁琐, 难以实现高通量检测 因此, 有必要探索新的检测方法在这一领域的应用

3. 关于 MLPA 敏感度 (10-20ng) 特异度 ( 高度特异的探针 ) 扩增效率高 ( 通用引物 ) 高通量检测

讨论 本研究中 1 号和 2 号受检标本的 MLPA 结果显示 : (1) 受检者 D03-380T D03-455A D04-602C D05-667T 完全缺失, 表明其外显子 3-5 完全缺失, 证实其为 D Cat VI type 4 型 (2) 同时,MLPA 结果显示其 RHD 基因拷贝数只有 1 个拷贝数, 即只有 1 条染色体含有 RHD 基因 (3)RHCE 基因的拷贝数峰值则有较大差异, 其 C c 基因均为 1 个拷贝数,E 基因为 0 个拷贝数,e 基因则为 3 个拷贝数, 这些结果表明 e 基因多出的 1 个拷贝数杂交融合了 RHD 基因, 即 CE 基因与 RHD 基因进行了融合, 受检者 RHD 基因型为 D 1-2 --(CE) 3-5 --D 6-10 /d PCR-SSP 检测结果表明 2 例受检者均有 RHD 基因外显子 3-5 缺失, 同时检出 C c e 基因, 与 MLPA 结果一致 血清学检测结果表明其为 RhD 变异型, 表型为 CcDee

讨论 总之,MLPA 检测通量大, 重复性好, 效率高且操作简便, 成本低廉, 在 RHD 变异型的检测应用中, 可以提供较为丰富的信息量 在 RHD 阴性或部分 D 的孕妇而言, 知晓男 女双方的 RHD 基因型对于预测胎儿的 RHD 基因型别有着重要的意义,MLPA 通过检测出 RH CDE 基因的拷贝数, 不但可以判别其 RHD 基因型, 还可以判别出其 RH CDE 基因的外显子融合情况 但 MLPA 也有其不足之处, 它仅能检测出实验所用探针所指示的变异位点, 而不能检测未知位点的缺失 重复或突变 因此, 通过增加 MLPA 检测平台 结合测序分析技术等, 将对 RHD 变异型的分子机制研究提供新的证据支持