第30卷 第1期 201年1月 北京农业职业学院学报 Journal of Beijing Agricultural Vocation College Vol.30 No.1 Jan. 201 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化 王 建 于佳弘 罗红霞 汪长钢 张 俊 北京农业职业学院 北京 1022 摘 要 乳酸菌能够有效调节机体的状态 对生物体维持健康方面有重要的作用 在自行分离的乳酸菌中选取 3 株高产酸 生长快且抑菌效果较好的优良菌株组成复合乳酸菌 筛选并优化复合乳酸菌的最佳培养基 在单因素试验 基础上 选取 L9 3 四因素 3 水平的正交试验设计 分析碳源 氮源 缓冲盐 3 个因素对复合乳酸菌菌体数量的影响 最终确定复合乳酸菌的最佳培养基为在 MRS 培养基的基础上添加乳糖 35g/L 乳清粉 - 大豆肽粉 1:1 0g/L 乙酸钠 7g/L 硫酸镁 0.5g/L 硫酸锰 0.25g/L 采用此培养基培养的复合乳酸菌数达到 5.1 109cfu/ml 比常规培养基培养的乳 酸菌数提高了 3.7 倍 关键词 复合乳酸菌 培养基 优化 中图分类号 TS252.5 文献标识码 B 文章编号 117-7252 201 01-002-05 前言 杆菌 FTL2311 和 FTL10BR 进行了抗菌作用和清 乳酸菌是人类和动物的肠道中占举足轻重 除自由基的实验 结果表明该乳杆菌抗菌作用 地位的优势菌群之一 能够有效地调节机体状 和清除自由基的效果显著 王爱丽等发现肠黏 态 对维持生物体健康发挥比较重要的作用 乳 膜上皮细胞能够与某些专性厌氧乳酸菌相粘附 酸菌能够通过代谢细菌素或制造酸性环境来抑 形成结构相对固定的菌膜组织和生物保护屏障, 制肠道中有害菌群 平衡机体肠道的健康状态 对抵御病原菌等对机体的侵袭有举足轻重的作 降低机体的胆固醇和血脂水平 增强机体免疫 用, 降低感染病症的机率 力 进而增强身体的抗病 抗癌能力 并延缓 具有优良性状的乳酸菌可以在食品业中作 衰老 Chuang 等研究了热灭菌乳酸菌对免疫功 为发酵剂使用 也可在饲料制备中作为酸化剂 能的作用 调查了这些灭活乳酸菌刺激小鼠树 使用 还可以制作成调节肠道的各种益生制剂 突状细胞 DCST 细胞的反应 结果证明乳酸菌在 为动物和人类的健康贡献力量 将两种或多种 调节免疫反应中能发挥重要的作用 Gilliland 和 乳酸菌菌株进行混合复配共同发酵 其发酵能 Buck 等通过研究表明胆固醇能很好地被乳酸菌 力 益生效果要强于单株乳酸菌 复合菌的培 降解 并且胆盐的种类和浓度对乳酸菌降低胆 养在发酵食品生产 环境和能源有效利用等相 固醇效果也存在着影响 Srikanjana 对分离的乳 关领域已有相应的一些经验累积和应用 基金项目 北京市教委 2015 年度科技计划以及社科计划资助项目 KM2015128007 收稿日期 2015-11-0 作者简介 王建 1975- 女 北京人 北京农业职业学院食品与生物工程系副教授 硕士 研究方向 食品 微生物 食品质量监控 2
王建等 : 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化 本实验从青贮饲料中在自行分离纯化 17 株单株乳酸菌, 从其中筛选出 3 株产酸性能强 生长速度快, 且抑菌效果较好的优良乳酸菌菌株组成复合乳酸菌, 并对其最佳培养基成分进行筛选和优化 1 材料与方法 1.1.1 菌种 (1) 植物乳杆菌 : 自行分离 (2) 乳酸片球菌 : 自行分离 (3) 干酪乳杆菌 : 自行分离 1.1.2 主要试剂 (1) 脱脂乳粉 : 市售, 用于菌株活化 (2) 鲜牛乳 : 市售, 用于发酵试验 (3) MRS 培养基 : 用于乳酸菌培养 1.1.3 主要仪器设备 : (1)SW-CJ-2F 超净工作台 : 苏州安泰空气技术有限公司 (2)150A 生化培养箱 : 江苏省金坛市医疗仪器厂 (3)BL310 电子天平 : 塞多利斯 ()828 型 ph 测试仪 :ORION 1.2.1 菌体生长测定 (1) 乳酸菌菌落计数取 100 μl 菌液加入到 900 μl 灭菌生理盐水, 依次做 10 倍稀释, 选取 3 个适宜的连续稀释倍数进行平板计数, 每个稀释度做 3 个平行 (2) 菌体生长曲线将复合乳酸菌接种 MRS 培养基, 培养 2 h±2 h, 每 2 h 取 1 次样, 测定吸光度值, 以培养时间 t 为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制复合乳酸菌的生长曲线 1.2.2 单因素实验 (1) 碳源的种类及添加量对菌株生长的影响固定除葡萄糖外 MRS 中其他组分的量, 分别添加 20 g/l 的蔗糖 乳糖 果糖 木糖 海藻糖 麦芽糖和葡萄糖, 接种培养后计数, 确定最佳碳源 另在 MRS 培养基中分别添加 10 20 30 0 和 50 g/l 最佳碳源, 接种培养后计数, 确定最佳碳源的浓度 (2) 氮源的种类及添加量对菌株生长的影响将 MRS 中的氮源替换为 25 g 的大豆肽粉, 25 g 乳清蛋白,25 g 鱼粉,50 g 玉米浆干粉, 12.5 g 大豆肽粉 +12.5 g 乳清蛋白粉,25 g 玉米浆干粉 +12.5 g 大豆肽粉, 灭菌接入种子,37 培养 1 h 后进行平板活菌计数, 确定最佳氮源 在培养基中分别添加 10 20 30 0 和 50 g/l 最佳氮源, 接种培养后计数, 确定最佳氮源的浓度 (3) 缓冲盐种类及添加量对菌株生长的影响根据已选出的最佳碳源 氮源及其浓度, 添加缓冲盐分别为磷酸二氢钾 2 g/l 乙酸钠 5 g/l 柠檬酸铵 2 g/l 磷酸二氢钾 2 g/l + 乙酸钠 5 g/l + 柠檬酸铵 2 g/l 和空白对照, 接种培养后计数, 确定最适缓冲盐 在培养基中分别添加 5 8 12 1 和 20 g/l 最适缓冲盐, 接种培养后计数, 确定最佳缓冲盐的浓度 1.2.3 正交试验优化培养基根据单因素实验结果, 以活菌数为 Y 值, 设计 L9(3 ) 正交表进行正交试验, 试验因素和水平如表 1 所示 表 1 正交实验设计因素和水平 因素 水平 1 2 3 乳糖用量 /g/l A 25 30 35 乳清粉 - 大豆肽粉用量 /g/l B 35 0 5 乙酸钠添加量 /g/l C 7 8 9 注 : 乳糖用量 乳清粉 - 大豆肽粉用量和乙酸钠添加量的实际值分别用 A B 和 C 表示 27
北京农业职业学院学报 2 结果与分析 201 年 第1期 (2) 碳源的添加量 乳糖浓度对复合乳酸菌生长的影响见图 3 ２ １ 复合乳酸菌菌体生长曲线 复合乳酸菌生长曲线见图 1 OD00 ph 7 10 OD00 5.5.5 5 ph.5 8 3.5 2 0 3 0 2 8 10 12 1 1 18 20 22 2 2 时间/h 图 1 复合乳酸菌生长曲线 如图 1 所示 复合乳酸菌在接种后 0 h 内 图 3 乳糖浓度对复合乳酸菌生长的影响 从图 3 可以看出 随着培养基中乳糖含量 的提高 复合乳酸菌的菌体数量也出现增长 细胞数量增长比较缓慢 处于生长延滞期 10 当乳糖含量为 30 g/l 时菌体数量达到最高 但 h 迅速生长 进入到对数生长时期 10 18 h 生 乳糖含量继续增加时 菌体数量反而出现降低 长速率几乎不变 处于稳定期 18 h 以后进入到 因此确定培养基乳糖含量为 30 g/l 为宜 衰亡期 菌体数量开始减少 在复合乳酸菌培养 过程中 培养基 ph 值变化是逐渐降低而后处于 2.2.3 氮源的种类及添加量对复合乳酸菌生 长的影响 平稳 这可能是乳酸菌在生长过程中不断产生乳 (1) 氮源的种类 酸等有机酸 而当生长环境中的有机酸浓度累积 不同氮源对复合乳酸菌生长的影响见图 到一定水平时 菌体生长就会受到制约 ２ ２ 单因素实验 2.2.1 碳源的种类及添加量的影响 (1) 碳源的种类 不同碳源对复合乳酸菌生长的影响见图 2 图 不同氮源对复合乳酸菌生长的影响 注 1 酵母膏 + 牛肉膏 + 蛋白胨 2 玉米浆干粉 3 大豆肽粉 鱼粉 5 乳清蛋白粉 大豆肽粉 + 乳清蛋 白粉 7 玉米浆干粉 + 大豆肽粉 由于乳酸菌缺乏相应的蛋白酶 分解蛋白的 能力有限 只能相应利用一些富含氨基酸 肽 类的有机氮源 将复合乳酸菌接种于添加不同 图 2 不同碳源对复合乳酸菌生长的影响 氮源的培养基中 并控制各组总粗蛋白量相同 如图 2 所示 与基础碳源为葡萄糖时的菌 白粉为氮源的培养基中 菌体数量最高 第 3 如图 所示 第 组即添加大豆肽粉 + 乳清蛋 体数量相比 当培养基中添加乳糖为碳源时 组即添加大豆肽粉次之 菌体数量最高 其次是海藻糖 而其余组的菌体 (2) 氮源的添加量 数量均低于葡萄糖组 因而确定乳糖为复合乳 不同氮源浓度对复合乳酸菌生长的影响见 酸菌的最佳碳源 28 图 5
王建等 : 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化 图 5 不同氮源浓度对复合乳酸菌生长的影响如图 5 所示, 在培养基中添加不同量的大豆肽粉 + 乳清蛋白粉, 其培养后的菌体数量也不同, 当大豆肽粉 + 乳清蛋白粉控制在 20 g/l 时, 菌体数量最多 2.2. 缓冲盐种类及添加量对复合乳酸菌生长的影响 (1) 缓冲盐种类不同种类缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响见图 图 不同种类缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响注 :1 不添加缓冲盐 ;2 乙酸钠 ;3 磷酸二氢钾 ; 柠檬酸铵 ; 5 磷酸二氢钾 + 乙酸钠 + 柠檬酸铵 缓冲盐能调整培养基的酸度控制在一定的范围内, 缓解乳酸菌菌体的正常生长会被自身产酸所抑制的现象, 从而促进菌体的生长 如图 所示, 在培养基中添加不同种类的缓冲盐, 其中第 2 组添加乙酸钠作为缓冲盐, 其菌体数量较其它组的要高, 差异明显, 因此选择乙酸钠作为复合乳酸菌培养基中的缓冲盐比较适宜 (2) 缓冲盐添加量不同浓度缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响见图 7 图 7 不同浓度缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响由图 7 看出, 当培养基中乙酸钠的添加量为 8 12 和 1 g/l 时, 菌体数量均较大, 且 3 组数据相差不大, 但从经济方面考虑, 选取 8 g/l 作为乙酸钠的最适合添加量 根据表 1 因素和水平进行正交试验设计, 得到 9 组试验, 试验结果均为平均值, 如表 2 表 2 培养基的最佳组合正交实验设计及结果 试验号 A B C D( 空列 ) 活菌数 (lg(cfu/ml)) 1 1 1 1 1 9.38 2 1 2 2 2 9. 3 1 3 3 3 9.21 2 1 2 3 9.7 5 2 2 3 1 9.53 2 3 1 2 9.70 7 3 1 3 2 9.1 8 3 2 1 3 9.73 9 3 3 2 1 9.2 k1 9.350 9.87 9.03 9.3 k2 9.33 9.573 9.517 9.523 k3 9.520 9.33 9.383 9.537 R 0.283 0.130 0.220 0.09 29
北京农业职业学院学报 201 年第 1 期 由表 2 可知, 各因素对活菌数的影响顺序为 A( 乳糖添加量 )> C( 乙酸钠添加量 )> B( 乳清粉 - 大豆肽粉添加量 ); 最优组合为 A3B2C1, 即乳糖 35 g/l, 乳清粉 - 大豆肽粉 (1:1)0 g/l, 乙酸钠 7 g/l 优化后活菌数可达 5.1 10 9 cfu/ml, 是基础培养条件下培养后活细胞数量的 3.7 倍 3 讨论优化培养基的目的, 主要是提高乳酸菌数, 从而获得大量活的乳酸菌 但复合乳酸菌在其培养的过程中会受到诸多因素的影响 目前, 对乳酸菌的培养条件和培养基的优化研究较多, 但不同的菌株, 其研究结果也不尽相同 Chiara S 对乳酸菌培养条件 培养基成分和发酵工艺参数进行了优化, 大幅度提高了菌体数量 他认为乳酸菌发酵剂和各种益生菌制剂的制备都要有适宜的培养基, 促使菌体大量繁殖, 才能使乳酸菌在后期干燥处理以及存储时获得较高的活菌存留率 田菊梅等先通过单因素实验研究了培养温度 起始 ph 值及接种量对低温乳酸菌的影响, 再试验响应面法进一步分析和优化培养条件, 其结果为接种量 3.00 % 起始 ph.0 培养温度 2.32, 活菌数达 10.25±0.02 lg(cfu/ml) 胡渊等以 MRS 肉汤培养基为基础培养基, 优化干酪乳杆菌的最佳培养基成分, 得到最佳碳源为以 3.77 % 的葡萄糖和乳糖质量比为 1:1 的混合糖为碳源,1.9% 酵母提取粉为氮源,3.9 % 黄豆浆为促生长因子, 优化后培养 2 h, 活菌数达 2.81 10 12 cfu/ml, 提高了 8.21 倍 隋欣等研究复合乳酸菌基础培养基及增殖因子, 结果表明经蛋白水解酶处理后的脱脂乳中, 添加适宜的培养成分 : 蛋白胨 0.8% 酵母粉 0.8% 吐温 0.1% 乳糖 0.5%, 可促进混合乳酸菌的富集培养, 达到增殖的目的 本试验在以上研究的基础上, 针对从青贮饲料中分离出的优良乳酸菌株组成的复合乳酸菌, 对其最佳培养基成分进行了优化, 即乳糖 35 g/l, 乳清粉 - 大豆肽粉 (1:1)0 g/l, 乙酸 钠 7 g/l, 获得活菌数可达 5.1 10 9 cfu/ml 该优化结果使得复合乳酸菌的菌体数量有了明显的提高, 活菌数是未经优化的基础培养基培养后的 3.7 倍, 为后期研究复合乳酸菌的富集培养和工业发酵打下基础 参考文献 [1] Chuang L,Wu KG, Pai C,et al.heat-killed cells of lactobacilli skew the immune response toward T helper 1 polarization in mouse splenocytes and dendrite cells [J]. J Agric Food Chem,2007,(55):11080-1108. [2] GILLILAND S E, NELSON C R, MAXWELL C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1985, (9):377-381. [3]BUCK L M, GILLILAND S E.Comparisons of freshly isolated strains of Lactobacillus acidophilus of human intestinal origin for ability to assimilate cholesterol during growth [J].J Dairy Sci, 199, (77):29257-29331. [] Srikanjana K, Siriporn O.Antibacterial and antioxidant activities of acid and bile resistant strains of lactobacillus fermentum isolated from miang[j].braz J Microbiol, 2009,(0):757-7 [5] 王爱丽, 武庆斌, 孙庆林. 肠道菌群与肠道黏膜免疫系统的相互作用机制 [J]. 中国微生态学杂志,2009, 1():382-385. [] 徐颖宣, 徐尔尼, 冯乃宪, 等. 微生物混菌发酵应用研究进展 [J]. 中国酿造,2008, (9):1-. [7]Chiara S, Vincenzo A, Vivien V, et al.cell density cultivation of probiotics and lactic acid production [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 82(2):213-222. [8] 田菊梅, 梁琪, 张炎, 等. 低温乳酸菌混菌培养条件的优化 [J]. 食品工业科技,2013, 3(1):180-183. [9] 胡渊, 刘成国, 黄茜, 等. 干酪乳杆菌增殖培养基的优化研究 [J]. 食品与机械,201, 30(2):20-. [10] 隋欣, 姜铁民, 王建, 等. 乳酸菌混合培养菌株基础培养基及增殖因子的筛选 [J]. 食品研究与开发, 2005, 2(): 9-52. ( 责任编辑宋晓华 ) 30