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第 21 卷 第 3 期 草地学报 2013 年 5 月 Vo.21 No.3 ACTA AGRESTIA SINICA My 2013 do:10.11733/j.n.1007g0435.2013.03.029 紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究 周冀琼 1, 邓波 1, 马晓彤 2, 张英俊 1, 周可 1 1. 中国农业大学动物科技学院草业科学系, 北京 100193;2. 中国农业科学院土肥所, 北京 100081) 摘要 : 以苜蓿根瘤菌 Snohzobummo)ACCC17631 和 ACCC17676 为供试菌株, 采用单因素碳氮源利用试验和正交设计试验, 确定最佳碳源 氮源及培养基配方. 结果表明 :2 株供试菌株最佳碳源为蔗糖, 最佳氮源分别为大豆粉和酵母粉. 根瘤菌 ACCC17631ACCC17676) 的最佳培养基配方 g L -1 ) 为 : 蔗糖 20, 大豆粉 酵母粉 )2.4, K2HPO40.25,KH2PO40.25,MgSO4 7H2O0.2,NC0.1,pH 为 6.8~7.0. 关键词 : 紫花苜蓿 ; 根瘤菌 ; 培养基 ; 优化中图分类号 :S154.381 文献标识码 :A 文章编号 :1007G04352013)03G0607G05 OpmzonoARhzobum Mdum ZHOUJGqong 1,DENGBo 1,MA XoGong 2,ZHANG YngGjun 1,ZHOU K 1 1.DpmnoGndSn,CogoAnmSn& Thnoogy,ChnAguuUnvy, Bjng100193,Chn;2.SondzInu,ChnAdmyoAguuSn,Bjng100081,Chn) Ab:Tpmum mdndomuopnvnsnohzobum mo ACCC17631 ndaccc17676wonmdbyngobonndnognuzonxpmn ndogondgnxpmn.ruwdhpmumbonwuo,ndh opmumnogn wyxndoybn m.tpmum mdum omuo ACG CC17631 ACCC17676)wg L -1 ):uo20 + oybnmyx)2.4+k2hpo40.25+ KH2PO40.25+MgSO4 7H2O0.2+NC0.1,ndpH6.8~7.0. Kywod:A;Rhzobum;Mdum;Opmzon 紫花苜蓿 Mdgov L.) 作为世界上栽培面积最大的豆科牧草, 素有 牧草之王 的美称, 营养丰富 蛋白质含量高 适口性好, 可解决养殖业中 [1] 蛋白质饲料不足的问题. 研究表明, 播种前对苜蓿进行根瘤菌接种, 可增加苜蓿的出苗率 抗病虫害 [2] 能力, 明显提高牧草产量以及营养价值. 接种根瘤菌剂已成为世界各国豆科作物增产的一项技术措 [3] 施, 在许多国家都有大规模的商品菌剂生产和出 [4] 售, 应用面积不断扩大. 为了适应中国苜蓿根瘤菌肥生产的需求, 本研究通过单因素试验和正交试验优化筛选最适合苜蓿根瘤菌 Snohzobum mg o) 生长的碳源 氮源及培养基配方, 由于不同的根瘤菌对其培养基中的最佳碳氮源的选择存在差异, 故选择 2 株苜蓿根瘤菌 ACCC17631 和 ACCC17676 作 [5] 为供试菌株进行对比, 以期为苜蓿根瘤菌今后的研究与菌肥生产提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 材料菌株及其特性 : 快生型苜蓿根瘤菌 ACCC17631 和 ACCC17676, 由中国农业微生物菌种保藏中心提供.2 株菌均属于苜蓿中华根瘤菌, 菌体小杆状, 在根瘤菌培养基上菌落为圆型 乳白色 半透明, 边缘整齐, 有粘质, 在 B.T.B 反应中产酸, 在石蕊牛奶中均凝结.2 株根瘤菌在 ph4.0~9.0 范围内均能生长. 根瘤菌 ACCC17631 在含盐量为 4.0% NC 的 YMA 培养基中生长正常,ACCC17676 耐盐性略差, 在含盐 收稿日期 :2012G12G13; 修回日期 :2013G03G11 基金项目 : 国家牧草产业技术体系 CARSG35); 公益性行业 农业 ) 科研专项 201003061); 十二五 农村领域国家科技支撑计划课题 2012BAD13B07) 资助作者简介 : 周冀琼 1987G), 女, 甘肃武威人, 硕士研究生, 研究方向为草地资源 生态与管理,EGm:qongqonghh221@163.om; 通信作者 Auoopondn,EGm:dngbo67@u.du.n

６０８ 草 地 量 ３ ５ NC的 YMA 培养基中生长正常, 株菌 均适合华北 东北 西北等盐碱土地区接种使用 [６]. : 培养基:YMA 液体培养基 甘露醇 １ ０, g L ) KHPO４ ５,KHPO４ ５,MgSO４ ７HO,酵 １ 母粉 蒸馏水１ ８,NC １, ０ ０ ０mL, ８~７ ０. ph６ 试验方法 菌种活化:在斜面培养基上 ８ 培养 ４８h 后, 接种到 YMA 液体培养基中,８, １５０ m n １ 转 速的摇床中震荡培养 ４８h 制成接种液. 培养基碳源的 筛 选:YMA 培 养 基 中 分 别 用 等 量蔗糖 葡萄糖 甘 露 醇 及 麦 芽 糖 作 为 碳 源,培 养 基 其他部分保持不变.将活化菌液按 １ V/V)接 种 量接入 装 有 ５０ ml 液 体 培 养 基 的 １００ ml 三 角 瓶 中, ８,１５０ m n １ 震 荡 培 养. 培 养 期 间 用 分 光光度计每 ６h 测定菌 液 OD６００nm 吸 光 度 值,连 续 测 学 第 １ 卷 报 图 所示.不同碳源对苜蓿根瘤菌 ACCC１７６３１ 和 ACCC１７６７６ 生 长 具 有 不 同 的 影 响. 根 瘤 菌 ACＧ CC１７６３１ 在 蔗 糖 和 甘 露 醇 为 碳 源 的 培 养 基 中 生 长 较好,且蔗糖略优 于 甘 露 醇,生 长 ６０h 后,其 OD６００ 值最高分别达到 ８８４ 和 ８１９.在 葡 萄 糖 为 碳 源 的培养基中生长缓慢,对数生长时间短,其 OD６００ 值 最高达到 ０３,在 以 麦 芽 糖 为 碳 源 的 培 养 基 中 生 长最差,其 OD６００ 值最高仅达到 ７４５.根瘤菌 ACＧ CC１７６７６ 在蔗 糖 为 碳 源 的 培 养 基 中 生 长 最 好,其 OD６００ 值高达 ９０,在 甘 露 醇 中 生 长 次 之, ６０h 后 OD６００ 值为 ５６３,在以葡萄糖和麦芽糖为碳源的 培 养基中生长较差.由于甘露醇在生产成本上远高于 蔗 糖,所 以 选 择 蔗 糖 作 为 ACCC１７６３１ 和 ACＧ CC１７６７６ 根瘤菌培养基进一步优化的碳源. 定 ６０h,分 别 绘 制 苜 蓿 根 瘤 菌 ACCC１７６３１ 和 ACＧ CC１７６７６ 在 不 同 碳 源 下 的 生 长 曲 线 并 选 出 各 自 的 最佳碳源 [７],每处理均重复 ４ 次. 培养基氮源的筛选:YMA 培养基中分别用等量 酵母粉 蛋白胨 大豆粉作为氮源进行试验,培养基其 他成分 不 变.将 活 化 菌 液 按 １ V/V)接 种 量 接 入 装有 ５０ ml 液体培养基的 １００ ml 三角瓶中, ８, １５０ m n １ 震荡培养.用分光光度计测 定 OD６００nm 值,绘制苜蓿根瘤菌 ACCC１７６３１ 和 ACCC１７６７６ 在不 同氮源下的生长曲线并选出最佳氮源. 正交试验:根据上述单因子试验得出结果,对选 定的碳源 氮 源 磷 源 以 及 MgSO４ ７HO 这 ４ 种 主要成分进行 L９ ３４ )正 交 试 验,培 养 ４８h 后,用 分 图 １ 不同碳源对根瘤菌 ACCC１７６３１ 生长的影响 １ E o d n bon g on hg ow naccc１７６３１ 光光度计测定 OD６００nm 值,分析 ４ 种物质对苜蓿根瘤 菌的影响度及最佳剂量组合 [８Ｇ９]. 验证 试 验:用 已 筛 选 得 到 的 最 佳 培 养 基 与 试 验 中 OD６００nm 值最高的培养基进行比较,验证正交试验 的结果. 结果与分析 １ 培养基中的不同碳源对苜蓿根瘤菌生长的 影响 碳 源 是 根 瘤 菌 培 养 基 中 必 不 可 少 的 组 成 成 分, 是构成根瘤菌细胞和代谢产物中碳架来源的重要营 养物质,因此对根瘤 菌 培 养 基 中 碳 源 进 行 筛 选 对 根 瘤菌生长有 至 关 重 要 的 作 用 [１０]. 蔗 糖 葡 萄 糖 甘 露醇以及麦 芽 糖 ４ 种 常 见 碳 源 对 苜 蓿 根 瘤 菌 ACＧ CC１７６３１ 和 ACCC１７６７６ 生长的 影 响 结 果 如 图 １ 和 图 不同碳源对根瘤菌 ACCC１７６７６ 生长的影响 o d n bon on g E hg ow naccc１７６７６ 培养基中的不同氮源对苜蓿根瘤菌生长的 影响 氮源对比试验结果如图 ３ 和图 ４ 所示.根瘤菌 ACCC１７６３１ 在大豆粉 为 氮 源 的 培 养 基 中 的 生 长 速 度远 快 于 在 其 他 氮 源 中 的 生 长 速 度, ６０h 后,ACＧ CC１７６３１ 在大豆粉中的 OD６００ 值达到 １９,在蛋白

第３期 ６０９ 周冀琼等:紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究 胨中 却 仅 为 １６４. 由 图 ４ 可 知,根 瘤 菌 ACCCＧ １７６７６ 在以 酵 母 粉 为 氮 源 的 培 养 基 中 生 长 效 果 最 ３ 培养基优化试验分析 在筛选培养基碳源 氮源的基础上,对培养基的 好, OD６００ 最高达 到 ０７９,大 豆 粉 次 之,其 OD６００ 最 高达到 ９０５５,蛋白胨的利 用 效 果 最 差.故 选 择 大 主 要 成 分:蔗 糖 大 豆 粉 酵 母 粉 ) KHPO４/ KHPO４ 和 MgSO４ ７HO 做 正 交 设 计 试 验,进 一 步优化确定最佳组合剂量.正交设计方案及结构如 豆粉作为根瘤菌 ACCC１７６３１ 培 养 基 进 一 步 优 化 的 氮源,而选 酵 母 粉 作 为 根 瘤 菌 ACCC１７６７６ 培 养 基 中的最优氮源. 表 １ 所示.结果表明: ACCC１７６３１ 在 ３ 号配方的培 养基中生长速度最快,其次为 ６ 号培养 基表 ;由 表 所 示 方 差 分 析 结 果 表 明:大 豆 粉 KHPO４/ KHPO４ 和 MgSO４ ７HO 对 根 瘤 菌 ACCC１７６３１ 的活菌数影响极显著 ０;蔗糖对其影响不显 著 ０５ ). 表 ３ 所 示 极 差 分 析 结 果 表 明:ACＧ CC１７６３１ 在优化培养基中培养时, ４ 种营养成分对其 生长速 度 影 响 顺 序 是:酵 母 粉 B) MgSO４ ７HO D) KHPO４/KHPO４ C) 葡萄糖 A),最佳表现 组 合 为 A３B３C１D３,即 蔗 糖 ０ g,大 豆 粉 ４ g, KHPO４ ５g, KHPO４ ５g, MgSO４ ７HO g;accc１７６７６ 在 ８ 号 配 方 的 培 养 基 中 生 长 速 度 最 图 ３ 不同氮源对根瘤菌 ACCC１７６３１ 生长的影响 快,其次是 ６ 号培养基表.表 ４ 所示方差分析结 o d n n ogn on g ３ E 果表 明:蔗 糖 大 豆 粉 KHPO４/KHPO４ 以 及 Mg Ｇ SO４ ７HO 对 根 瘤 菌 ACCC１７６７６ 的 活 菌 数 影 响 均 hg ow naccc１７６３１ 极显著 ０.而表 ３ 所示极差分析结果表明: ACCC１７６７６ 在优化培养基中培养时, ４ 种营养成分对 其生长速度影响的顺序是: MgSO４ ７HO D) 酵母 粉 B) 葡萄糖 A) KHPO４/KHPO４ C),最佳表 现组 合 为 A３B３C１D３,即 蔗 糖 ０g,酵 母 粉 ４ g, KHPO４ ５g,KHPO４ ５g,MgSO４ ７HO g. ４ 优化培养基的验证试验 对正交试验得出的优化培养基与它们的常规培 图 ４ 不同氮源对根瘤菌 ACCC１７６７６ 生长的影响 o d n n ogn on g ４ E 养基及 株供试菌株在正交试验中生长速度最快的 hg ow naccc１７６７６ 表 １ 正交设计与试验结果 Tb １ O gon d mn u gnndxp 试验号 Cod １ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 蔗糖 /g 因素 o １７６３１:大豆粉 Soyb nm Su o A) １７６７６:酵母粉 Y x B) ０) ０) ０) KHPO４ KHPO４ C) MgSO４ ７HO ５ D) ５ ) ４ ４ ５ ５ ５ ５ ４ ) ) 试验结果 R u OD６００) １７６３１ １７６７６ ８０１ ０７８ ０６９ ８１７ ６３７ ７７９ ６３５ ９３６ ８０５ ８７３ ８４９ ７１ ５０７ １４６ ８４４ ５６ ９５４ ４７

610 草地学报第 21 卷 表 2 根瘤菌 ACCC17631 正交试验方差分析表 Tb2 AnyovnonACCC17631byogonx 变异系数 Vonon SS D MS 0.05 0.01 显著性 Sgnn 蔗糖 Suo 0.01256 2 0.00628 3.22 4.26 8.02 大豆粉 Soybnm 0.17334 2 0.08667 44.40 K2HPO4/KH2PO4 0.04175 2 0.02087 10.69 MgSO4 7H2O 0.07054 2 0.03527 18.07 试验误差 Expmno 0.01757 9 0.00195 注 No): P<0.01 表 3 L93 4 ) 培养基优化试验结果的极差分析表 Tb3 Ruongnybyogonx A B C D 17631 17676 17631 17676 17631 17676 17631 17676 k1 1.835 1.539 1.795 1.382 1.870 1.625 1.761 1.232 k2 1.783 1.499 1.715 1.607 1.755 1.567 1.793 1.709 k3 1.842 1.663 1.951 1.711 1.836 1.508 1.907 1.759 R 0.059 0.164 0.236 0.329 0.115 0.117 0.146 0.527 最优水平 Opmzdv A3 A3 B3 B3 C1 C1 D3 D3 因素主次顺序 Odoo 17631:B>D>C>A 17676:D>B>A>C 表 4 根瘤菌 ACCC17676 正交试验方差分析表 Tb4 AnyovnonACCC17631byogonx 变异系数 Vonon SS D MS 0.05 0.01 显著性 Sgnn 蔗糖 Suo 0.08715 2 0.04357 94.09 4.26 8.02 酵母粉 Yx 0.33731 2 0.16866 364.18 K2HPO4/KH2PO4 0.04130 2 0.02065 44.59 MgSO4 7H2O 1.01830 2 0.50915 1099.41 试验误差 Expmno 0.00417 9 0.00046 注 No): P<0.01 3,8,6 号培养基进行验证, 结果如图 5 和图 6 所示. 根瘤菌 ACCC17631 培养 60h 后在优化培养基和 3 号培养基中的生长速度相近,OD600 值分别为 2.126 和 2.092, 在 6 号培养基中的 OD600 值为 1.99, 均高 于常规培养基 YMA 中的 1.438; 同样根瘤菌 ACG CC17676 培养 60h 后测定的优化培养基和正交试 验 8 号培养基的 OD600 值分别为 2.123 和 2 002, 而 对照 YMA 只有 1.694, 根瘤菌 ACCC17631 和 ACG CC17676 的生长曲线 图 5 和图 6) 更进一步说明筛 选出来的优化培养基优于常规 YMA 培养基. 3 讨论与结论 图 5 不同培养基中根瘤菌 ACCC17631 的生长曲线 目前, 国内外关于根瘤菌培养基优化的研究主 要集中于大豆 Gynmx) 花生 AhhyG pog) 等经济作物, 对豆科牧草, 特别是紫花苜蓿的研究鲜见报道 [11]. 苜蓿根瘤菌的常 规培养基是 YMA 培养基, 但由于 YMA 培养基是 g.5 GowhuvonACCC17631 ndnuumd 半合成培养基, 用于大规模发酵生产时, 成本较 [12] 高. 本研究在 YMA 培养基的基础上针对碳源 氮源以及培养基的其他主要成分做出了优化. 碳

第 3 期 周冀琼等 : 紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究 611 根瘤菌种子包衣, 根瘤菌仍存在存活时间短 菌种活性不易保存的问题, 如何保持菌肥或包衣中长期高效的活菌数还有待于进一步的研究. 参考文献 [1] 韦革宏, 朱毓华, 万晓红, 等. 紫花苜蓿根瘤菌种子处理剂的研究 [J]. 草地学报,2005,134):287G290 [2] SphnJH G,RkH M.InnpoduonndomuG on[j].dcoprh,2000,652/3):249g258 [3] DkR,RghyRJ,KnndyIR.LgumdnG onhnoogy:avw[j].soboogyndbohmy, 图 6 不同培养基中根瘤菌 ACCC17676 的生长曲线 g.6 GowhuvonACCC17676 ndnuumd 源 氮源的利用试验表明, 蔗糖和甘露醇是 2 株供试 菌株比较理想的碳源, 但是蔗糖价格相对较低, 故选 蔗糖作为碳源更加经济高效. 而大豆粉和酵母粉分 别是根瘤菌 ACCC17631 和 ACCC17676 最佳的氮 源选择. 正交试验以及优化培养基的验证试验得出 根瘤菌 ACCC17631ACCC17676) 的最佳培养基配 方 g L -1 ): 蔗糖 20,K2HPO4 0.25,KH2PO4 0 25,MgSO4 7H2O 0.2, 大豆粉 酵母粉 )2.4, NC0.1,pH6.8~7.0. 另外, 通过 2 株供试菌株 的对比试验证明, 苜蓿根瘤菌对培养基中碳氮源的 选择虽存在差异, 但差异并不显著, 仅在苜蓿根瘤菌 对培养基中氮源的选择上存在差异, 说明优化出的 培养基比常规根瘤菌培养基更加普遍适用于快生型 苜蓿根瘤菌的培养. 选择优化高活菌数的培养基是生产优质苜蓿根 瘤菌肥的第一步, 目前, 无论是进行根瘤菌拌种或是 2004,368):1275G1288 [4] BmbS,NdkdmP A.EoRhzobumnnG on,mnd moybdnumonnognxononodud Puvug L.[J].AnJno Moboogy Rh,2010,49):682G696 [5] 陈海荣, 郭照辉, 刘前刚, 等. 紫云英根瘤菌培养基的选择与优化 [J]. 湖南农业科学,20111):13G15 [6] 马晓彤. 苜蓿根瘤菌与苜蓿品种共生匹配优良组合筛选的研究 [D]. 北京 : 中国农业科学院,2009:47G48 [7] 吴红慧, 周俊初. 根瘤菌培养基的优化和剂型的比较研究 [J]. 微生物学通报,2004,312):14G19 [8] 管宇, 黄必恒, 吴志松, 等. 关于正交试验设计的重复试验问题 [J]. 浙江林学院学报,2003,204):413G418 [9] 尚军红, 康丽华, 罗玉萍, 等. 相思根瘤菌和解磷菌培养基优化及解磷能力研究 [J]. 林业科学研究,2005,182):177G182 [10] 迟玉成, 樊堂群, 禹山林, 等. 慢生型花生根瘤菌培养基优化研究 [J]. 花生学报,2007,364):25G28 [11] 肖亦农, 徐琼. 大豆根瘤菌 HH103 菌株培养基的筛选与优化 [J]. 微生物学杂志,2011,316):92G95 [12] 刘保平, 周俊初. 根瘤菌菌剂研究 [J]. 湖北农业科学,2006,45 1):57G61 责任编辑刘云霞 )