第 28 卷第 6 期 应用化学 Vol.28Is.6 2011 年 6 月 CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY June2011 殝 檵 殝 殝综合评述檵檵檵檵檵檵檵檵檵 殝 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 a,b 刘传银 b 胡继明 ( a 襄樊学院化学工程与食品科学学院襄樊 ; b 生物医学分析化学教育部重点实验室, 武汉大学化学与分子科学学院武汉 430072) 摘 要 近年来, 生物传感器与纳米技术 流动注射和微流控等新技术的结合, 获得了蓬勃而迅速的发展 亲 和型生物传感器是基于生物分子之间的特异的亲和性, 即生物活性物质对底物的亲和与键合而建立起来的 一种新型传感装置 它具有特异性好 灵敏度高 成本低 能在复杂的体系中进行在线连续监测等优点, 进而 在生物医学领域, 对生物医学标记物 核酸 蛋白质 病毒 细菌及毒素的检测 药物作用机理的研究 临床用药 筛选等方面有着广泛的应用 本文从光学 电化学 石英晶体微天平传感 表面等离子体共振等几个方面对近 年来亲和型生物传感器, 特别是用于检测肿瘤标记物的免疫传感器和基于核酸适体的生物传感器在生物医 学领域的测定原理和应用现状进行了评述, 并对其发展趋势进行了展望 关键词 亲和型生物传感器, 免疫传感器, 肿瘤标记物, 核酸适体传感器, 生物医学应用 中图分类号 :O657;TP212.3 文献标识码 :A 文章编号 :1000 0518(2011)06 0611 13 DOI:10.3724/SP.J.1095.2011.00455 生物传感器是由生物活性单元 ( 如酶 抗体 蛋白质 核酸和细胞等 ) 和信号转换器组成并利用生物识别原理来进行检测的一种装置 [1] 它是一种由生物 化学 物理 医学和电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术, 具有选择性好 灵敏度高 分析速度快 成本低 在复杂的体系中进行在线连续监测, 及其易于自动化 微型化与集成化的特点 特别是近年来分子生物学 微电子学 光电子学 微细加工技术及纳米技术等新学科和新技术的进展, 使生物传感器的研究蓬勃发展, 成为新兴的高技术产业的重要组成部分 根据分子识别元件与待测物结合的性质可将生物传感器分为生物催化型 ( 代谢型 ) 和生物亲和型 ( 受体型 ) 生物亲和型传感器是利用分子间特异的亲和性, 即生物活性物质对底物的亲和或键合作用而建立起来的, 如免疫传感器 受体传感器和 DNA 传感器等 根据生物反应产生信息的物理或化学性质, 可采用电化学 光谱 热 压电和表面声波等技术进行检测 [1] 本文按照传感信号方式的不同, 对近年来亲和型生物传感器在生物医学上的进展予以综述 1 免疫传感器 癌症是人类健康的杀手, 是否能较早诊断出癌症的前期征兆是影响癌症患者恢复的关键因素 众所周知, 在肿瘤发展的过程中, 肿瘤组织或细胞会释放出一些特异性的蛋白质进入循环体系, 而这些特异性蛋白在血液中的含量水平标志着肿瘤发展的阶段, 所以在生物医学上常将这些特异性蛋白称为肿瘤标记物 临床医学上常将这些肿瘤标记物的检测作为临床检验和诊断的重要依据 [1] 生物化学 酶联免疫和分子生物学等多种方法已用于肿瘤标记物的检测, 虽然这些方法具有较高的选择性 准确度, 但是存在辐射威胁 耗时和费用较高等缺点 由于免疫传感器结合了免疫反应的特异性分子识别和便利的检测技术而得到研究者的普遍关注, 故开发快速而准确的肿瘤标记物的免疫传感器成为生物医学检测的研究热点 肿瘤标记物一般分为以下几类 : 酶 糖蛋白 粘糖蛋白 激素 免疫分子和癌基因等 临床医学实践 2010 08 05 收稿,2010 11 02 修回湖北省教育厅优秀中青年项目 (Q200760001) 十堰市科技计划及开发项目 (2010nt05) 资助通讯联系人 : 胡继明, 教授 ;Tel/Fax:027 62258931;E mail:jmhu@whu.edu.cn; 研究方向 : 现代仪器分析在生物医学上的应用
612 应用化学第 28 卷 表明, 甲胎蛋白 (AFP) 降血钙素 (CT) 癌胚抗原 (CEA) 人绒毛膜促性腺素 (hcg) 前列腺特异抗原 (PSA) 鳞状上皮细胞抗原 (SCCA) 神经元特异性烯醇酶 (NSE) 和 CA(CarcinomaAntigen) 等均是典型的肿瘤标记物 [1] 如肠癌的肿瘤标记物为 CEA CA19 9 和 CA24 2; 前列腺癌的肿瘤标记物为 F PSA PSA 和 PAP 按照免疫传感器检测信号的不同, 可分为电化学型 光学型和质量敏感型等 1.1 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器可再分为电位型 电容型和电流型 电位型传感器在免疫传感中应用不多 梁 [2] 茹萍等利用戊二醛交联 CA15 3 抗体的电位型免疫传感器用于乳腺癌 CA15 3 的检测, 获得了良好的 [3] 检出限 (5U/mL) 和稳定性 (30d) Fu 等制备了 40nm 的氧化铁纳米柱修饰碳糊电极, 用于固定 CEA 建立了测定 CEA 的电位型免疫传感器 其线性范围为 1 5~80μg/L, 检出限为 0 9μg/L 对临床 [4] 血液样本的检测结果与酶联免疫法相符合 Zhou 等将纳米金吸附在溶于 PVC 的邻苯二胺的氨基上, 制备了一种增塑的 PVC 膜的电位传感器用于 α AFP 的检测 该传感器的响应时间短 (4min) 检出限低 (1 6μg/L) 但电位型免疫传感器的不足之处在于 : 信噪比较低, 线性范围窄, 非特异性抗体 抗原作用及背景信号较高 电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术 在电容型免疫传感器的制作中, 传感界面的构建和生物识别层的固定是影响其性能的重要因素 可采用半导体氧化物膜 自组装单分子膜 电 [5] 聚合膜 溶胶凝胶膜和等离子体聚合膜等来构建电容型免疫传感器 Fernandez Sanchez 等研制了可以用于检测 PSA 的免疫传感器 他们将对 ph 敏感的聚合物附着在电化学传感器的表面, 用于快速而 [6] 灵敏地检测亲和反应过程中的电容及阻抗变化, 实现了对 PSA 的灵敏检测 Quershi 等在纳米晶钻 (NCD) interdigitatedgold(gid) 电极表面固载抗体, 进而通过电容法测定心血管标记物 CRP 结果表明, 电容器的灵敏度表现在两个方面, 一是当抗体与抗原结合后, 极化常数和弛豫时间常数明显增大, 二 [7] 是传感器的灵敏度与抗体浓度及施加频率紧密相关 袁若等报道了一种在玻碳电极表面修饰金纳米粒子, 进而吸附 CEA 抗体, 用铁探针离子的阻抗特性来检测 CEA, 获得了良好的检出限和灵敏度 [8] Rajesh 等在 ITO 修饰电极上利用自组装膜固定 α CRP, 利用电化学阻抗法检测 α CRP 抗体与抗原的亲和作用, 其检出限达到 3 5μg/L 由于电容法和阻抗法可以获取直接 非标记的亲和信号, 所以在临床诊断上具有良好的发展前景 但电容法存在的问题在于响应电容易受到非特异性吸附的影响, 其重现性不如法拉第阻抗法与伏安法 所以如何优化传感界面, 改善响应电容的重现性和稳定性仍是电容型免疫传感器发展中的关键问题 电流型免疫传感器备受研究者的关注 由于大多数待测物不能直接参与电化学反应, 常采用加入电子媒介体和标记酶来催化底物转化为电活性物质来制备传感器 虽然加入电子媒介体会降低检出限, 但其分离和洗涤步骤限制了它在生物医学上的广泛应用 而基于标记酶的直接电子传递的免疫传感器则简化了分离和洗涤步骤, 在生物医学上的应用更有吸引力 鞠幌先研究组曾对肿瘤标记物的电流型传感器进行了深入的研究 [9 12] 如将硫堇和 HRP 标记的 CEA 抗体通过戊二醛交联在电极表面, 制成了一种具有良好稳定性的传感器 该传感器减少了加入电子媒介体的麻烦, 并且不需乳化和洗涤, 线性范围为 0 5~3 0 和 3 0~167μg/L, 检出限为 0 1μg/L, 重现性良好 [10] 他们还研究了基于 HRP 的直接电子传递的免疫 CEA 传感器, 对 CEA 的检出限为 0 3μg/L, 并将实际样品的检测结果与临床检测方法相比照, 获得了满意的结果 [12] 除此之外, 研究人员还结合纳米粒子的电子传导 丝网印刷技术 [13] 微流控装置 毛细管电泳和流动注射等技术对肿瘤标记物的检测进行了研究 Jin 等结合毛细管电 [14] 泳和电化学检测技术, 对肿瘤标记物 CA125 进行了检测 Kojima 等设计了一种包含 36 个 Pt 微电极的阵列, 运用不同的抗体来捕获肿瘤标记抗原, 采用电化学免疫检测技术实现了多标记物的同时检测 [15] Wilson 等采用双电极的免疫传感器同时采用安培法测定了 CEA 和 AFP, 获得了 1μg/L 的低检出限, 并有效抑制了交叉干扰 研究表明, 这些新技术在免疫传感器中的引入, 不仅降低了待测物的检出限, 而且可以有效降低共存物质的干扰, 并可实现多通道同时检测多种肿瘤标记物 [16] 由于纳米材料的独特性质, 使其在实时 灵敏检测标记物方面具有广泛的应用前景 如 Zheng 等 利用抗体功能化的二氧化硅纳米线制备了一种新型传感器, 用于在血浆中的癌症标记物的非标记实时
第 6 期 刘传银等 : 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 613 [17] [18] 监测 Ramanathan 等和 Wilner 等曾报道利用聚合物纳米线和碳纳米管进行相关生物亲和体系内 [19] 标记物的检测 Wu 等将 CEA/ 纳米金通过壳聚糖固定在丝网印刷电极上, 结合流动注射法建立了一种快速而方便的 CEA 电化学免疫传感器,CEA 检测的线性范围为 0 50~25μg/L, 检出限为 [20] 0 22μg/L 该传感器通过流动注射 HRP anti CEA, 故可以控制乳化时间, 并易于自动化 Wang 等 将聚鸟嘌呤功能化的二氧化硅纳米粒子标记坏疽抗体的夹心型传感器用于坏疽因子的电化学测定, 可 [21] 直接用于生物样品中坏疽因子的检测, 检出限为 2 0pmol/L Chen 等在玻碳电极表面气相沉积纳米金 / 硅溶胶, 将 HRP 功能化的 hcg 抗体固定于其上, 建立了一种无试剂的电化学免疫传感器用于 hcg [1] 的灵敏检测, 其检出限为 0 3mIU/mL Wang 等对近年来功能化碳纳米管在肿瘤标记物上的应用进行了综述 表 1 为近年来不同纳米材料构建的传感器对标记物的检测 表 1 采用不同纳米材料构建的免疫传感器对肿瘤标记物的检测 Table1 Determinationoftumormarkerswithimmunosensorsfabricatedbydiferentnano materials Analytes Modifiednano materials Detectionsignal Linearrange Detectionlimit References CEA sphericalau TiO 2 nanoparticles curent 0.2~160.0μg/L 0.06μg/L [22] CEA goldnanoparticles colorimetricanalysis 0.05~50μg/L 48pg/mL [23] CEA nanogoldenwrappedgraphenenanocomposites curent 0.05~350μg/L 0.01μg/L [24] CEA [Ag Ag 2 O]/SiO 2 nanocompositematerial curent 0.5~160μg/L 0.14μg/L [25] CEA Au/Fe 3 O 4 core shels curent 0.005~50μg/L 0.001μg/L [26] AFP goldnanoparticlesandcarbonnanotubes curent 1~55μg/L 0.6μg/L [27] dopedchitosan AFP functionaltitaniumdioxidenanoparticles voltammetry 1.25~200μg/L 0.6μg/L [28] CA15 3 ferocenyl dopedsilicananoparticles voltammetry 2.0~240U/mL 0.64U/mL [29] CA15 3 double layernanogoldanddouble stranddna curent 1.0~240μg/L 0.6μg/L [30] PSA quantumdot fluorscenceimaging - 0.25μg/L [31] PSA CdSe@ZnS voltammetry - 0.02μg/L [32] CEA luminol/antibodylabeledgoldnanoparticles chemiluminescence 5 10-10 ~ - [33] 5 10-8 g/ml CEA MCNT Pt CS curent 0.5~10μg/L, 0.2μg/L [34] 10~120μg/L 1.2 光学免疫传感器 由于光学免疫传感器具有非破坏性操作 快速获取信号及使用可见光辐射等优势, 故在肿瘤标记物的检测中占有重要地位 根据其检测原理, 光学免疫传感器可分为荧光 化学发光和表面等离子体共振等类型 [35] 近年来, 荧光检测在临床诊断和检测中获得了很大的进展 Nakamura 等结合流动注射系统和阳离子交换树脂毛细管柱制备了 hcg 免疫传感器 利用离子交换柱来分离 FITC IgG 和 FITC IgG 抗体, 然 [36] 后利用荧光检测 hcg, 其线性范围为 25~1500mIU/mL Yan 等将免疫亲和反应柱与流动注射体系相连接, 然后通过时间分辨荧光免疫检测法进行 CEA 的测定 ( 如图 1 所示 ) 纳米材料特别是量子点的引入, 使荧光型生物传感器的发展尤为引人瞩目,Zhong [37] 对近年来基于荧光生物传感中纳米材料的应 [38] 用进行了综述 Hong 等对纳米金 溶剂对荧光团的荧光效应进行了比较研究, 发现纳米金试剂的荧光增强效应可以使肿瘤标记物的检出限降低 10 倍, 并且对心血管标记物 CRP 的检出限可低至数 10pmol 化学发光免疫传感器多采用直接化学发光 化学发光基底标记和酶标记等 3 种技术 但大多数化学发光免疫传感器是利用酶增大检测信号, 并与流动注射系统相结合来提高其检测自动化性能 Ju [39] 等对化学发光免疫传感器的自动化进行了较多研究, 并对近年来电化学发光传感器在肿瘤标记物方 [40] 面的应用进行了综述 Jie 等首次以 gold/silica/cdse CdS 杂交纳米结构制备了灵敏的电化学发光生物传感器, 用于测定 CEA, 获得了良好的效果 虽然化学发光免疫传感器的灵敏度高, 选择性好, 但是改善肿瘤标记物的固定化技术和传感器的微型化 集成化仍是化学发光免疫传感器的发展方向 表面等离子体共振 (SPR) 是利用金属膜 / 液面界面光的全反射来分析生物分子相互作用的一项新
614 应用化学第 28 卷 [36] 图 1 三明治 型流动注射时间分辨荧光检测系统 Fig.1 SandwichFIAsystemwithtime resolvedfluorescencedetection P:peristalticpump;V:eight wayvalve;c:immunoafinitycolumn;trf:time resolvedfluorescencedetection 兴技术, 生物传感芯片是 SPR 传感器的核心部分 它对免疫特异识别 蛋白质折叠机理 生物特异相互作用的结合位点及浓度分析上具有独特的优势, 并且可以获得很低的检出限 (10-13 ~10-9 mol/l) 可实时监测生物大分子之间的相互作用及其影响因素的作用环节, 成为疾病诊断和机理研究的有效工具 [41] Chou 等将抗人铁蛋白单克隆抗体固定在 SPR 敏感的金表面, 建立了人铁蛋白的 SPR 免疫传感器, 可 [42] 以测定非特异性肿瘤标记物人铁蛋白 Yu 等基于表面等离子体的衍射建立了 hcg 的免疫传感器 [43] Corso 等将抗体通过自组装膜固定在金表面, 建立了一种实时灵敏监测胰腺癌的肿瘤标记物间皮蛋白的声波免疫传感器, 可以检测纳克级的间皮蛋白 (mesothelin) 近年来, 诸多研究集中在如何克服 SPR 传感器检测小分子灵敏度低的问题, 相信随着 SPR 传感器在肿瘤标记物研究上的深入, 其在生物医学领域的应用将更为广泛 1.3 质量型免疫传感器 石英晶体微天平 (QCM) 型免疫传感器由于其非标记和实时监测的特点使其在肿瘤标记物的检测 [44] 中也有较多应用 Zhang 等制备了一种 2 5 模式的多通道压电 QCM 用于检测血液和尿液中的 [45] hcg, 其检测效率高, 比单通道检测的速度快 8 倍以上 Kim 等在微芯片上制备了检测心血管标记物 CRP 的 QCM 免疫传感器, 对 CRP 的检测线性范围宽, 达到 0 13~25016μg/L, 检出限为 0 13μg/L 1.4 免疫传感器在多分析物同时检测中的应用 在医学临床诊断中, 某一种非特异性肿瘤标记物的值升高并不能确诊癌症, 常需要进行多个肿瘤标记物的同时检测, 才能获得准确的诊断结果 [1] [46] Matsumoto 等报道了一种利用时间分辨荧光免疫传感器同时测定 α AFP 和 CEA, 他们采用 Eu 标记的抗 AFP 抗体及 Sm 标记的亲和素来测定 α AFP 和 CEA, 获得了较低的检出限, 它们的检出限分别为 0 07 和 0 3μg/L, 并在实际样品的测定中获得了良好 [47] 的准确度 Song 等用微分析系统荧光免疫传感器同时测定了 CEA AFP β HCG CA125 CA19 9 和 CA15 3, 均获得了较宽的线性范围, 对于 CEA AFP β HCG 为 0~640μg/L, 对于 CA125 CA19 9 和 [14] CA15 3 为 0~1280μg/L Kojima 等将捕获抗体固定在双层硅氧烷层中, 制备了微蛋白质芯片用于 AFP 和 β 2 微球蛋白的电化学免疫检测, 由于采用了夹心型的结构, 有效降低了酶催化产物的扩散而获 [48] 得较高的灵敏度 Wu 等用醋酸纤维素共固定硫堇和 2 种抗原于丝网印刷芯片的碳电极上, 用于 [49] CA19 9 和 CA125 的电化学免疫测定, 其检出限分别为 0 2 和 0 4U/mL Fu 等采用双通道体系化学发光免疫同时检测 α AFP 和 CEA, 对 α AFP 和 CEA 的检出限分别达到 1 5 和 0 25μg/L Wilson [50 52] 等将微芯片技术与电化学免疫结合, 分别进行了 CEA AFP,4 种不同的蛋白质及 7 种肿瘤标记物的同时检测 他们采用多个 IrOx 传感器来降低酶催化产物的扩散, 进而在电极上获得良好的电化学响
第 6 期 刘传银等 : 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 615 [53] 应, 并获得了较低的检出限 Qureshi 等利用 GID 电极电容法同时检测抗 CRP α TNF 和 IL6, 其检测范围为 25pg/mL~25ng/mL, 为心血管患者提供了良好的前期诊断 能同时检测多个肿瘤标记物的免疫传感器及微流控芯片系统的应用, 在癌症的预期诊断方面是现今重点发展的方向 2 适体生物传感器 核酸适体是一种能够与蛋白质 小分子 离子 核酸 甚至整个细胞等目标分子结合, 通过指数富集的配位系统进化技术 (SELEX) 经体外筛选的人工合成寡聚核苷酸或肽分子 适配体还具有分子量小 易体外合成和修饰 化学稳定性好等优点, 常被称为 化学抗体, 故一经出现便成为化学工作者用于分子识别和靶标物检测研究的得力工具, 为生物分析方法和传感器的设计开辟了新的思路 [54] 核酸适体可形成一些稳定的三维空间结构, 如发夹 假结 凸环和 G 四链体等结构 分子识别时, 在目标分析物诱导下单链核酸适体会折叠成特殊的二级结构 常见的适体与靶体之间的作用有单位点结合和双位点结合 ( 夹心型 )2 种 研究表明, 适配体的结构稍有差异, 则靶分子与其结合就受到阻碍 [54] 显然, 适体的这些特点对于发展高灵敏 高选择性和快速高通量的靶标分子分析检测十分重要, 并日渐成为分析化学领域的研究和应用热点 研究人员已经成功地创建了大量基于核酸适体的分析新方法, 包括电化学法 荧光 比色法 压电和 SPR 等 [55 57] 2.1 电化学适体传感器 电化学适体传感器集合了核酸适体和电化学传感器的优势, 成为近年来的一个研究热点 在阻抗型电化学适体传感器中, 适体的固定化程序至关重要 通常有混合自组装膜和在自组装膜上共价固定 [58] 等几种方法 Wang 等首次报道了识别诱导表面电荷转换的 FIS 适体传感器 结果表明, 如果体系 ph 低于目标蛋白 pi, 则蛋白质的识别将扭转表面电荷状态, 促进电子转移, 因而会降低电荷转移阻抗 [59] Liao 等将适体固定在硅电极表面, 用于检测神经炎细胞因子 PDGF, 建立了一种无试剂的阻抗生物传 [60] 感器, 其检出限达到 40nmol/L Kwon 等以抗血管内皮生长因子 (VEGF) 适体与羧基聚吡咯纳米管构建了场效应晶体管用以测定 VEGF, 其检出限为 400fmol/L, 可用于实时检测 VEGF 图 2 为亲和型电 [54] 图 2 亲和型电化学适体传感器原理 Fig.2 Mechanismofafinityaptamer basedelectrochemicalsensors [54] FIS:faradaicimpedance;NIS:non faradaicimpedance;cpsa:chronopotentionmetricstrippinganalysis;fet:field efecttransistor
616 应用化学第 28 卷 化学适体传感器的工作原理的示意图 当核酸适体与特定的蛋白质结合时, 有典型的构型变换, 而抗体则没有这样的性质, 利用这个性质可以设计构型变换型适体传感器 通常, 将适体信标的一端修饰官能团用于电极表面的固定化, 另一端修饰电活性标记物来产生电信号 电信号的大小是由活性标记物与电极表面之间的距离决定的 Xiao [61] 等将亚甲蓝标记的抗凝血酶适体固定在电极表面, 制备了一种基于电化学开关效应测定凝血酶的生物传感器 ( 如图 3A 所示 ), 但该种传感器在靶分子与适体结合后信号减小 为了克服这个问题,Radi [62 63] 等设计了另一种开关装置用于凝血酶的测定 ( 图 3B) 由于四链体的形成, 二茂铁与电极之间的距离大大减小而显示出电化学信号 在图 3A 和图 3B 中, 由于适体的刚性较差, 所以存在较大的背景信 [64] 号, 降低了信噪比和检出限 Zuo 等将二茂铁功能化的抗 ATP 适体固定在电极表面, 在 ATP 存在下, 互补序列解离而与 ATP 结合成三维的刚性结构, 进而二茂铁与电极表面发生电子传递, 显示出开关的 [65] 作用,ATP 的检测范围较宽 (10nmol/L~1mmol/L) 并具有高的灵敏度 ( 图 3C) Fan 等将 3 端连有羧基二茂铁的发卡式结构 DNA 探针通过 5 巯基固定在金电极上, 根据标记物杂交前后与电极表面距离的变化进行电化学检测, 对目标 DNA 的检出限达到 1 0 10-11 mol/l 他们将该方法应用于 PCR 扩 [66] 增产物的研究, 该方法具有 PCR 扩增产物无需后续纯化 快速检测的优点 Chu 等提出了基于免疫 RCA 的适体电化学传感器用于 PDGF BB 的超灵敏检测 在电极表面形成抗体 PDGF BB 适体 引物复合体这样的三明治结构后, 引入一种与引物结合的 C 型挂锁探针 该方法结合了滚环扩增和酶催化 [67] 两步放大, 实现了 PDGF 的超灵敏检测, 下限可达 10fmol/L Huang 等采用类似原理将 PDGF BB 采用抗体和适体 引物捕获到电极表面, 通过嵌入 MB 产生电化学响应, 其检测限为 18pg/mL 这种基于靶分子的结合而引起构型变换的电化学传感器, 提供了一种无试剂 再生和灵敏的方法用于复杂样品中目标分析物的检测 [61 64] 图 3 电化学适体传感器的开关装置示意图 Fig.3 Schemesfor singal of and signal on electrochemicalaptasensors [61 64] A.Afterbindingtothrombin,theaptamerprobeself asemblesintoag quadruplexstructureandshieldsmbfrom electron transfer communicationwiththeelectrode,leadingtoanegativesignal;b.formationofacomplexofthrombinandtheaptamersmakesthe G quadruplexconfigurationrigidandresultsintheorientationoftheferoceneunitsintheproximityoftheelectrode,leadingtoeasy electrontransferbetweentheelectro activeferoceneunitsandtheelectrodeandproducingapositivesignal;c.thepresenceofatp untiestherigiddnaduplexandliberatesthecomplementarysequence,whilemakingtheaptamersequenceformarigid3dstructure. Thisbringstheferocenetagtotheproximityoftheelectrodesurfaceandturnsonelectrontransfer,producingpositivesignals 一些平面分子如亚甲蓝 Ru(NH 3 ) 3+ 6 功能化二茂铁等也可以插入双链 DNA 中并经 DNA 碱基对 [68] π 堆积实现电子转移而被氧化, 进而利用特异性序列与蛋白质的作用进行电化学检测 Jin 等利用 5 SH 的发卡式结构探针固定于金电极表面, 用亚甲基兰为杂交指示剂检测 P53 基因, 并对不同位置的单碱基错配序列进行了研究 该方法无需对发卡式 DNA 探针进行标记, 实验证明发卡式 DNA 探针有很高的杂交特异性, 可以识别单碱基错配序列, 并且错配碱基位于环中央时对杂交效率影响最大 [69] Zhang 等在金电极阵列上分别自组装巯基发卡式 DNA 探针, 采用亚甲蓝为杂交指示剂, 方波伏安法 [70] 检测了人体免疫缺陷蛋白 HIV 1 和 HIV 2, 对二者的检出限均达到了 0 1nmol/L Mir 等对凝血酶的不同适体生物传感器的制备方式对测定结果的影响进行了详细的比较研究 适体在与靶标分子特异性结合后, 其三级结构将发生改变, 随之发生变化的有适体的电荷密度 吸
第 6 期 刘传银等 : 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 617 附性质和空间位阻等一系列因素 采用纳米材料不仅可以将上述这些变化因素转化为可检测的光学 [71] 电化学信号, 而且还可以提高分析检测的灵敏度 Numunuam 等首次以 CdS 量子点标记二级适体, 建 [72] 立了夹心型电位法测定蛋白质的电位传感器, 凝血酶的检出限为 0 14nmol/L Hansen 等利用 CdS 量子点修饰适体建立了 7 种不同蛋白质的同时电化学检测, 其检出限为 0 5pmol/L, 而且具有良好的选 [73] 择性 该方法为超痕量的生物标记物的检测及肿瘤的早期诊断提供了可能 Polsky 等利用 Pt 纳米粒子功能化的适配体进行了凝血酶的电化学检测 由于纳米粒子对过氧化氢的催化还原, 放大了电信号 [74] 而使凝血酶的检测限降低到纳摩尔的水平 He 等将含有聚腺嘌呤序列的抗凝血酶适配体对纳米金予以功能化, 然后基于凝血酶与抗体的特异性作用固定在电极表面, 然后腺嘌呤核糖酶降解释放而直接在热解石墨电极上检测 由于纳米粒子可以载带较多的适配体, 所以检测灵敏度可以降低至 0 1μg/L [75] Li 等在金电极上预先修饰 2 种分别含有腺苷酸和凝血酶的适体, 捕获探针预先用纳米金及硫化物纳米粒子固定的 DNA 链杂交, 构成了一种夹心型的传感器用于腺苷酸和凝血酶的阳极溶出伏安测定, 其检出限分别为 6 6 10-12 和 1 0 10-12 [76] [77] mol/l Velasco Garcia 等和 Hianik 等对适体电化学生物传感器的研究进展进行了评述, 并对其发展前景进行了展望 总的来说, 虽然报道的多种构建电化学适体传感器的方法获得了较为满意的分析性能, 但对电化学适体传感器的分析性能和各项参数的研究和评价还不充分, 在实际体系中的应用也还需要拓展 2.2 光学适体传感器 随着能与蛋白质等生物大分子特异结合的适体的筛选和发现, 基于纳米材料的比色技术日渐成为生物大分子识别和检测的有力工具 由于适体 纳米粒子的比色检测灵敏度高 操作简单, 因而对蛋白 [78] 质分析和癌症的诊断具有重要意义 图 4 为比色法测定蛋白质的基本原理 Mao 等利用分子信标的 [79] 特异性识别特性和金纳米粒子的光学特性, 建立了快速 灵敏而价廉的检测 DNA 的方法 Liu 等报道了一种纳米粒子 适体的生物传感器可直接用于血液中癌细胞拉莫斯细胞的比色法检测, 为循环系统 [79 81] 图 4 比色法测定适体生物传感器的示意图 Fig.4 Schemesofcolorimetricsensingmechanismwithaptamer basedbiosensors [79 81] A.Uponbindingtoitstarget,theaptamerformed3DstructuresandledtotheaggregationofAuNPs;B.inthepresenceoftargetmole cules,purplecoloreddna modifiedaunpaggregatesweredispersedintored coloredindividualaunps;c.uponbindingthetarget, AuNPsfunctionalizedwithshort,complementary sdnaandaptamerswereunstableagainstsalt inducedaggregate,leadingtoared to purplecolorchange
618 应用化学第 28 卷 [80] 的癌细胞提供了一种快捷灵敏的检测方法, 对癌症的诊断和治疗具有较大的作用 Lee 等利用 SPR 适体生物传感器检测视黄醇结合蛋白 4(RBP4) 用于二型糖尿病的诊断 该种方法避免了传统免疫学检 [81] 测的测定干扰, 可直接用于血液中 RBP4 的检测 Huang 等采用适体 纳米金实现了对乳腺癌标志物 [82] PDGF AA PDGF AB PDGF BB 的检测, 其检出限均能达到纳摩尔水平 Medley 等以适体修饰的金纳米粒子实现了急性淋巴细胞白血病 CCRF CEM 细胞的检测, 并使用伯基特淋巴瘤 Ramos 细胞做对比检测, 探针对靶标细胞有特异识别, 其检出限为 90 个癌细胞 该纳米比色探针的选择性和灵敏度令人满意 与传统方法相比, 比色法用于蛋白质分子检测有明显优势, 如所需药品及材料均较廉价, 避免了生物分析中的复杂修饰和分离, 不仅保证了适体与靶分子的高度亲和性, 还极大地简化了分析检测步骤, 能很好的满足对现场快速检测的需求 相信这种方法将以其高灵敏 低成本和较简便等优势在生物分析和医学检测等领域得到广泛应用 与比色法相比, 荧光法由于灵敏度高 特征参数多 动态范围宽和适体与纳米粒子作用方式灵活多样等优点, 而更具发展潜力 最常见的光学分子信标就是发卡式分子信标, 即适体序列的两端分别标记一个荧光团和淬灭团, 当靶分子与特异序列结合后, 原本相近的荧光团和淬灭团分开, 进而显示出荧光信号 另一种是在一个已知 DNA 序列上分别配合带有荧光团和淬灭团的 DNA 序列, 当靶分子与适体进行特异结合后, 淬灭团序列离开, 而显示出荧光, 并用于检测靶分子 [83] [84] Huang 等将与 DNA 具有亲和性的 DMDAP 加入到 PDGF 适体修饰的纳米金溶胶中发生荧光淬灭, 靶分子 PDGF 的加入使 DMDAP 释放到溶液中, 进而荧光恢复, 实现了对 PDGF 的荧光检测, 其检出限可达 8pmol/L 量子点与适体的结合则大大提高了其在细胞研究中的功能, 为癌细胞的影像诊断技术及细胞内的药物转运提供 [85] 了可能 Bagalkot 等发展了由阿霉素 适体和 CdSe/ZnS 量子点组成的双荧光共振能量转移体系, 并将其成功应用于体外前列腺癌细胞的影像 治疗和药物运输 由于荧光检测法固有的高度灵敏性和多种纳米材料技术的使用, 荧光生物传感在生物医学领域的研究将有更大的发展和应用空间 [86] Zhang 等将钌联吡啶衍生物作为标记物, 连接到发卡式 DNA 上制成电化学发光探针, 将其自组装到金电极上构成新型电化学发光传感器, 根据杂交前后电化学发光信号强度的不同进行目标序列的检测 实验结果表明, 该发卡式 DNA 电化学发光传感器有较高的杂交特异性, 能够识别单碱基和多碱基错配序列, 检出限为 9 10-11 mol/l 该传感器具有较高的检测灵敏度, 且无需对目标分子进行标记, [87] 有望应用于疾病检测等医学领域 Huang 等将含有 15 个碱基的巯基适体固定在金电极表面, 用以结合凝血酶 ; 另以 29 个碱基的生物素修饰的适体与凝血酶杂交形成夹心型结构 用亲和素修饰的量子点对生物素 亲和素的作用进行检测, 制备了一种新颖的化学发光适体传感器 该传感器对凝血酶的检测 [88] 线性范围为 0~20mUg/mL Polet 等首次将光纤 SPR 传感器与 DNA 适体相结合制备了一种可重复使用 经济而非标记的适体传感器用于研究 DNA 杂交及 DNA 蛋白质之间的相互作用 该传感器不仅可对 DNA 和蛋白质进行定量, 而且还可以用于研究它们结合的动力学常数 2.3 质量型适体传感器 质量型适体生物传感器是非标记的生物测定技术, 包括微波传感器 石英晶体微天平 表面声波装置和微机械悬梁式传感器 微重石英晶体微天平常用于检测靶分子与适体之间的相互作用 Tombeli [89] [90] 等和 Hianik 等将生物素化的适体固定在金 / 石英晶体表面用于测定凝血酶和 HIV 1Tat 蛋白, 其检出限分别为 1nmol/L 和 0 25μg/L 机械悬梁式生物传感器具有较高的分辨率和稳定性 Savran [91] 等将 2 个相临近的悬梁臂上分别功能化相应的适体, 一个用 sdna 阻塞, 一个用以测定 TaqDNA 聚合酶 结果表明, 聚合酶与适体的结合产生了 3~23nm 的悬臂弯曲, 且弯曲的程度与聚合酶的浓度直 [92] 接相关 Hwang 等用纳米机械悬梁式传感器研究了 RNA 适体与 hepatitiscvirus 解螺旋酶的相互作 [93] 用, 对 HCV 解螺旋酶的检出限达到 100pg/mL Yang 等将含有 20 个碱基的 sdna 通过巯基固定在金表面制备了悬梁式 DNA 传感器, 用于研究 DNA 的杂交 结果表明, 该传感器能区分靶分子并为高通 [94] 量实时监测 DNA 提供了可能 Yao 等以 QCM 适体传感器测定人血浆中的 IgE, 其线性范围为 2 5~ 200mUg/L 该传感器具有较高的特异性 低检出限 样品量少的优点, 适于特异性蛋白质的检测 质量型适体生物传感器与传统检测方法相比, 不需要任何标记, 仪器简单 操作方便 响应灵敏 选择性好和
第 6 期 刘传银等 : 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 619 便于自动化, 将在生物医学领域的检测上发挥越来越重要的作用 3 展望 生物亲和型传感器是以生物分子之间的特异性相互作用建立起来的一种新型传感器, 在生物医学研究和临床应用上具有极大的应用前景 虽然现在亲和型生物传感器在实际临床诊断方面还存在抗干扰能力弱 多目标检测物同时检测能力差等缺点, 但近年来光电化学 分子生物学 材料科学及电子学等多学科的融合与交叉, 为亲和型生物传感器在生物医学上的研究与应用提供了无穷的发展空间 今后亲和型生物传感器的研究应用将主要集中在以下几个方面 : 不断开发新的杂交指示剂, 或与多种检测方法联用来制备形式多样的亲和型生物传感器 ; 设计更简单的制备方法来构建亲和型生物传感器, 使其使用寿命更长, 检测灵敏度更高 ; 充分利用纳米材料的特异性能, 结合微流控技术等实现传感器的微型化 芯片化, 使其自动化程度更高, 检测效率更好 总之, 相信随着材料科学 生物化学 分子生物学和新型操控技术的进一步融合, 亲和型生物传感器在生物医学的研究和临床诊断方面的应用将会有更大的进展 参考文献 [1]WangJ,LinYH.FunctionalizedCarbonNanotubesandNanofibersforBiosensingApplications[J].TrendsAnalChem, 2008,27(7):619 626 [2]LIANGRuping,QIUJianding,ZOUXiaoyong,etal.BreastCancerAntigenImmunosensorBasedontheFunctionalSol gel Film[J].ChemJChineseUniv,2004,25:425 429(inchinese). 梁汝萍, 邱建丁, 邹小勇, 等. 基于功能化溶胶 凝胶膜的乳腺癌抗原免疫传感器 [J]. 高等学校化学学报,2004,25: 425 429. [3]FuXH,WangJY,LiN,etal.Label freeelectrochemicalimmunoasayofcarcinoembryonicantigeninhumanserum UsingMagneticNanorodsasSensingProbes[J].MicrochimActa,2009,165:437 442. [4]ZhouL,YuanR,ChaiYQ.On OfPVCMembraneBasedPotentiometricImmunosensorforLabel FreeDetectionofAlpha Fetoprotein[J].Electroanalysis,2007,19:1131 1138. [5]Fernandez SanchezC,McNeilCJ,RawsonK,etal.DisposableNoncompetitiveImmunosensorforFreeandTotalProstate SpecificAntigenBasedonCapacitanceMeasurement[J].AnalChem,2004,76:5649 5656. [6]QuershiA,GurbuzY,KangW P,etal.ANovelInterdigitatedCapacitorBasedBiosensorforDetectionofCardiovascular RiskMarker[J].BiosensBioelectron,2009,25(4):877 882. [7]ZhuQ,ChaiYQ,YuanR,etal.DevelopmentofaBiosensorfortheDetectionofCarcinoembryonicAntigenUsingFaradic ImpedanceSpectroscopy[J].ChemLet,2005,34:1682 1683. [8]Rajesh,SharmaV,TanwarVK,etal.ElectrochemicalImpedanceImmunosensorfortheDetectionofC ReactiveProteinin AqueousSolution[J].SensorLet,2010,8:362 369. [9]DaiZ,ChenJ,YanF,etal.ElectrochemicalSensorforImmunoasayofCarcinoembryonicAntigenBasedonThionine MonolayerModifiedGoldElectrode[J].CancerDetectPrev,2005,29:233 240. [10]DaiZ,YanF,YuH,etal.NovelAmperometricImmunosensorforRapidSeparation freeimmunoasayofcarcinoembryonic Antigen[J].JImmunolMethods,2004,287:13 20. [11]DaiZ,YanF,ChenJ,etal.ReagentlesAmperometricImmunosensorsBasedonDirectElectrochemistryofHorseradish PeroxidaseforDeterminationofCarcinomaAntigen 125[J].AnalChem,2003,75:5429 5434. [12]TanF,YanF,JuH X.ElectrochemistryNanometricPaterningofMOFParticles:AnisotropicMetalElectrodepositionin Cu/MOF[J].ElectrochemCommun,2006,8:1830 1834. [13]HeZ,GaoN,JinW.DeterminationofTumorMarkerCA125byCapilaryElectrophoreticEnzymeImmunoasaywith ElectrochemicalDetection[J].AnalChimActa,2003,497:75 81. [14] KojimaK,HiratsukaA,SuzukiH,etal.ElectrochemicalProteinChipwithArayedImmunosensorswithAntibodies ImmobilizedinaPlasma PolymerizedFilm[J].AnalChem,2003,75:1116 1122. [15]WilsonMS.ElectrochemicalImmunosensorsfortheSimultaneousDetectionofTwoTumorMarkers[J].AnalChem,2005, 77:1496 1502.
620 应用化学第 28 卷 [16]ZhengG,PatolskyF,CuiY,etal.MultiplexedElectricalDetectionofCancerMarkerswithNanowireSensorArays[J]. NatBiotechnol,2005,23:1294 1301. [17]RamanathanK,BangarM A,YunM,etal.BioafinitySensingUsingBiologicalyFunctionalizedConducting Polymer Nanowire[J].JAmChemSoc,2005,127:496 497. [18]KatzE,WilnerI.Biomolecule FunctionalizedCarbonNanotubes:ApplicationsinNanobioelectronics[J].Chem Phys Chem,2004,5:1084 1104. [19] Wu J,TangJH,DaiZ,etal. A DisposableElectrochemicalImmunosensorforFlow Injection Immunoasayof CarcinoembryonicAntigen[J].BiosensBioelectron,2006,22(1):102 108. [20]WangJ,LiuGD,EngelhardM H,etal.SensitiveImmunoasayofaBiomarkerTumorNecrosisFactor αbasedonpoly (guanine) FunctionalizedSilicaNanoparticleLabel[J].AnalChem,2006,78(19):6974 6979. [21]ChenJ,TangJH,YanF,etal.AGoldNanoparticles/sol gelcompositearchitectureforencapsulationofimmunoconjugate forreagentleselectrochemicalimmunoasay[j].biomaterials,2006,27(10):2313 2321. [22]ZhangYY,YuanR,ChaiYQ,etal.SensitiveLabel freeimmunoasayofcarcinoembryonicantigenbasedonautio 2 HybridnanocompositeFilm[J].JColoidInterfaceSci,2010,348(1):108 113. [23]LiuM Y,JiaCP,JinQH,etal.NovelColorimetricEnzymeImmunoasayfortheDetectionofCarcinoembryonicAntigen [J].Talanta,2010,81:1625 1629. [24] ZhongZY,WuW,WangD,etal.Nanogold enwrappedgraphenenanocompositesastracelabelsforsensitivity EnhancementofElectrochemicalImmunosensorsinClinicalImmunoasays:CarcinoembryonicAntigenasaModel[J]. BiosensBioelectron,2010,25:2379 2383. [25]YuanY L,YuanR,ChaiY Q,etal.A NovelLabel freeelectrochemicalimmunosensorforcarcinoembryonicantigen DetectionBasedonthe[Ag Ag 2 O]/SiO 2 NanocompositeMaterialasaRedoxProbe[J].JElectroanalChem,2010,643: 15 19. [26]LiJP,GaoH L,ChenZQ,etal.AnElectrochemicalImmunosensorforCarcinoembryonicAntigenEnhancedbySelf asemblednanogoldcoatingsonmagneticparticles[j].analchimacta,2010,665:98 104. [27]LinJH,HeCY,ZhangLJ,etal.SensitiveAmperometricImmunosensorforα FetoproteinBasedonCarbonNanotube/ goldnanoparticledopedchitosanfilm[j].analbiochem,2009,384:130 135. [28]LiangW B,YuanR,ChaiYQ,etal.ANovelLabel freevoltammetricimmunosensorforthedetectionofα Fetoprotein UsingFunctionalTitaniumDioxideNanoparticles[J].ElectrochimActa,2008,53:2302 2308. [29]HongC L,YuanR,ChaiY Q,etal.Ferocenyl dopedsilicananoparticlesasanimmobilizedafinitysupportfor ElectrochemicalImmunoasayofCancerAntigen15 3[J].AnalChimActa,2009,633:244 249. [30]YangY D,ZhongZ Y,Liu H M,etal.Double LayerNanogold and Double Strand DNA Modified Electrodefor ElectrochemicalImmunoasayofCancerAntigen15 3[J].Electroanalysis,2008,20:2621 2628. [31]KermanK,EndoT,TsukamotoM,etal.QuantumDot basedimmunosensorforthedetectionofprostate specificantigen UsingFluorescenceMicroscopy[J].Talanta,2007,71:1494 1499. [32]LinYY,WangJ,LiuGD,etal.ANanoparticleLabel/immunochromatographicElectrochemicalBiosensorforRapidand SensitiveDetectionofProstate specificantigen[j].biosensbioelectron,2008,23:1659 1665. [33]YangXY,GuoYS,WangAG.Luminol/antibodyLabeledGoldNanoparticlesforChemiluminescenceImmunoasayof CarcinoembryonicAntigen[J].AnalChimActa,2010,666:91 96. [34]MinLG,YuanR,ChaiYQ,etal.AnImmunosensorforCarcinoembryonicAntigenBasedonGoldNanoparticlesand Multi walcarbonnanotube Pt chitosancomposite[j].actachimsin,2008,66:1676 1680(inChinese). 闵丽根, 袁若, 柴雅琴, 等. 基于纳米金与碳纳米管 纳米铂 壳聚糖纳米复合物固定癌胚抗原免疫传感器的研究 [J]. 化学学报,2008,66:1676 1680. [35]NakamuraN,Lim TK,JeongJM,etal.FlowImmunoasayforDetectionofHumanChorionicGonadotrophinUsinga CationExchangeEesinPackedCapilaryColumn[J].AnalChimActa,2001,439:125 130. [36]YanF,ZhouJN,LinJH,etal.FlowInjectionImmunoasayforCarcinoembryonicAntigenCombinedwithTime resolved FluorometricDetection[J].JImmunolMethods,2005,305:120 127. [37]ZhongW W.NanomaterialsinFluorescence basedbiosensing[j].analbioanalchem,2009,394:47 59. [38] HongB,KangK A.Biocompatible,Nanogold particlefluorescenceenhancerforfluorophoremediated, Optical
第 6 期 刘传银等 : 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 621 Immunosensor[J].BiosensBioelectron,2006,21(7):1333 1338. [39]LinJH,JuH X.ElectrochemicalandChemiluminescentImmunosensorsforTumorMarkers[J].BiosensBioelectron, 2005,20(8):1461 1470. [40]JieGF,LiuP,ZhangSS.HighlyEnhancedElectrochemiluminescenceofNovelGold/silica/CdSe CdSNanostructuresfor UltrasensitiveImmunoasayofProteinTumorMarker[J].ChemCommun,2010,46(8):1323 1325. [41]ChouSF,HsuW L,HwangJM,etal.DevelopmentofanImmunosensorforHumanFeritin,aNonspecificTumorMarker, BasedonSurfacePlasmonResonance[J].BiosensBioelectron,2004,19:999 1005. [42]YuF,KnolW.ImmunosensorwithSelf ReferencingBasedonSurfacePlasmonDifraction[J].AnalChem,2004,76: 1971 1975. [43]CorsoCD,StubbsDD,LeeSH,etal.Real timedetectionofmesothelininpancreaticcancercellinesupernatantusing anacousticwaveimmunosensor[j].cancerdetectprev,2006,30(2):180 187. [44]ZhangB,MaoQ G,ZhangX,etal.A NovelPiezoelectricQuartzMicro arayimmunosensorbasedonself asembled MonolayerforDeterminationofHumanChorionicGonadotropin[J].BiosensBioelectron,2004,19:711 720. [45]KimN,KimDK,ChoYJ.DevelopmentofIndirect competitivequartzcrystalmicrobalanceimmunosensorforc Reactive Protein[J].SensActuatB Chem,2009,143(1):444 448. [46]MatsumotoK,YuanJL,WangGL,etal.SimultaneousDeterminationofα FetoproteinandCarcinoembryonicAntigenin HumanSerumbyTime ResolvedFluoroimmunoasay[J].AnalBiochem,1999,276:81 87. [47]SongSP,LiB,HuJ,etal.SimultaneousMultianalysisforTumorMarkersbyAntibodyFragmentsMicroaraySystem[J]. AnalChimActa,2004,510:147 152. [48]WuH,ZhangZ,FuZF,etal.A DisposableTwo throughputelectrochemicalimmunosensorchipforsimultaneous MultianalyteDeterminationofTumorMarkers[J].BiosensBioelectron,2007,23:114 120. [49]FuZF,YanF,LiuH,etal.Channel resolvedmultianalyteimmunosensingsystem forflow throughchemiluminescent Detectionofα FetoproteinandCarcinoembryonicAntigen[J].BiosensBioelectron,2008,23(7):1063 1069. [50]WilsonMS.ElectrochemicalImmunosensorsfortheSimultaneousDetectionofTwoTumorMarkers[J].AnalChem,2005, 77:1496 1502. [51]WilsonM S,NieW.ElectrochemicalMultianalyteImmunoasaysUsinganAray BasedSensor[J].AnalChem,2006,78: 2507 2513. [52]WilsonM S,NieW.MultiplexMeasurementofSevenTumorMarkersUsinganElectrochemicalProteinChip[J].Anal Chem,2006,78:6476 6483. [53]QureshiA,NiaziJH,KalempudiS,etal.Label freecapacitivebiosensorforsensitivedetectionofmultiplebiomarkers UsingGoldInterdigitatedCapacitorArays[J].BiosensBioelectron,2010,25(10):2318 2323. [54]HamulaCLA,GuthrieJW,ZhangHQ,etal.SelectionandAnalyticalApplicationsofAptamers[J].TRAC TrendsAnal Chem,2006,25(7):681 691. [55]WilnerM Zayats.ElectronicAptamer BasedSensors[J].AngewChemIntEdEngl,2007,46:6408 6418. [56]MairalT,CengizOzalpV,LozanoSanchezP,etal.Aptamers:MolecularToolsforAnalyticalApplications[J].Anal BioanalChem,2008,390:989 1007. [57]TombeliS,MinunniM,MasciniM.AnalyticalApplicationsofAptamers[J].BiosensBioelectron,2005,20:2424 2434. [58]RodriguezM C,KaweeA,WangJ.AptamerBiosensorforLabel freeimpedancespectroscopydetectionofproteinsbased onrecognition inducedswitchingofthesurfacecharge[j].chemcommun,2005,34:4267 4269. [59]LiaoW,CuiXT.ReagentlesAptamerBasedImpedanceBiosensorforMonitoringaNeuro inflammatorycytokinepdgf [J].BiosenBioelectron,2007,23:218 224. [60]KwonOS,ParkSJ,JangJ.A High performancevegfaptamerfunctionalizedpolypyrolenanotubebiosensor[j]. Biomaterials,2010,31:4740 4747. [61]XiaoY,LubinAA,HeegerAJ,etal.Label FreeElectronicDetectionofThrombininBloodSerumbyUsinganAptamer BasedSensor[J].AngewChemIntEdEngl,2005,44:5456 5459. [62]RadiAE,AceroSanchezJL,BaldrichE,etal.Reagentles,Reusable,UltrasensitiveElectrochemicalMolecularBeacon Aptasensor[J].JAmChemSoc,2006,128:117 124. [63]RadiA E,O_SulivanCK.AptamerConformationalSwitchasSensitiveElectrochemicalBiosensorforPotasium Ion
622 应用化学第 28 卷 Recognition[J].ChemCommun,2006,32:3432 3434. [64]ZuoX,SongS,ZhangJ,etal.ATarget ResponsiveElectrochemicalAptamerSwitch(TREAS)forReagentlesDetectionof NanomolarATP[J].JAmChemSoc,2007,129:1042 1043. [65]FanCH,PlaxcoKW,HeegerAJ.ElectrochemicalInterogationofConformationalChangesasaReagentlesMethodfor thesequence specificdetectionofdna[j].procnatlacadsci,2003,100:9134 9137. [66]ZhouL,OuLJ,ChuX,etal.Aptamer BasedRolingCircleAmplification:APlatform forelectrochemicaldetectionof Protein[J].AnalChem,2007,79:7492 7500. [67]HuangY,NieXM,GanSL,etal.ElectrochemicalImmunosensorofPlatelet derivedgrowthfactorwithaptamer primed PolymeraseAmplification[J].AnalBiochem,2008,382:16 22. [68]JinY,YaoX,LiuQ,etal.HairpinDNAProbeBasedElectrochemicalBiosensorUsingMethyleneBlueasHybridization Indicator[J].BiosensBioelectron,2007,22:1126 1130. [69]ZhangDD,PengYG,QiHL,etal.Label freeelectrochemicaldnabiosensorarayforsimultaneousdetectionofthe HIV 1 and HIV 2 OligonucleotidesIncorporatingDiferentHairpin DNA Probesand RedoxIndicator[J].Biosens Bioelectron,2010,25(5):1088 1094. [70]MirM,VreekeM,KatakisL.DiferentStrategiestoDevelopanElectrochemicalThrombinAptasensor[J].Electrochem Commun,2006,8(3):505 511. [71]NumnuamA,Chumbimuni ToresKY,XiangY,etal.Aptamer BasedPotentiometricMeasurementsofProteinsUsingIon SelectiveMicroelectrodes[J].AnalChem,2008,80(3):707 712. [72] HansenJA,WangJ,KawdeA N,etal.Quantum Dot/Aptamer BasedUltrasensitiveMulti AnalyteElectrochemical Biosensor[J].JAmChemSoc,2006,128(7):2228 2229. [73]PolskyR,GilR,KaganovskyL,etal.NucleicAcid FunctionalizedPtNanoparticles:CatalyticLabelsfortheAmplified ElectrochemicalDetectionofBiomolecules[J].AnalChem,2006,78:2268 2271. [74]HeP,ShenL,CaoY,etal.UltrasensitiveElectrochemicalDetectionofProteinsbyAmplificationofAptamer Nanoparticle BioBarCodes[J].AnalChem,2007,79:8024 8029. [75]LiXM,XiaJP,LiW,etal.MultianalyteElectrochemicalBiosensorBasedonAptamer andnanoparticle IntegratedBio BarcodeAmplification[J].Chem AnAsianJ,2010,5(2):294 300. [76]Velasco GarciaM N,MisailidisS.NewTrendsinAptamer basedelectrochemicalbiosensors[j].genethermolbiol, 2009,13(1):1 10. [77]HianikT,WangJ.ElectrochemicalAptasensors RecentAchievementsandPerspectives[J].Electroanalysis,2009,21 (11):1223 1235. [78]MaoX,XuH,ZengQ X,etal.MolecularBeacon functionalizedgoldnanoparticlesasprobesindry reagentstrip BiosensorforDNAAnalysis[J].ChemCommun,2009,21:3065 3067. [79]LiuGD,MaoX,PhilipsJA,etal.Aptamer NanoparticleStripBiosensorforSensitiveDetectionofCancerCels[J].Anal Chem,2009,81(24):10013 10018. [80]LeeSJ,YounBS,ParkJW,etal. sdnaaptamer BasedSurfacePlasmonResonanceBiosensorfortheDetectionofRetinol BindingProtein4fortheEarlyDiagnosisofType2Diabetes[J].AnalChem,2008,80(8):2867 2873. [81]HuangCC,HuangYF,CaoZ,etal.Aptamer ModifiedGoldNanoparticlesforColorimetricDeterminationofPlatelet DerivedGrowthFactorsandTheirReceptors[J].AnalChem,2005,77:5735 5741. [82]MedleyCD,SmithJE,TangZW,etal.GoldNanoparticle BasedColorimetricAsayfortheDirectDetectionofCancerous Cels[J].AnalChem,2008,80:1067 1072. [83]WANGGuoqing,CHENZhaopeng,CHENLingxin.Aptamer Nanoparticle BasedOpticalProbes[J].ProgChem,2010,22: 489 499(inchinese). 王国庆, 陈兆鹏, 陈令新. 基于适体和纳米粒子的光学探针 [J]. 化学进展,2010,22:489 499. [84]HuangCC,ChiuSH,HuangYF,etal.Aptamer FunctionalizedGoldNanoparticlesforTurn OnLightSwitchDetectionof Platelet DerivedGrowthFactor[J].AnalChem,2007,79:4798 4804. [85]BagalkotV,ZhangLF,Levy Nisenbaum E,etal.Quantum Dot AptamerConjugatesforSynchronousCancerImaging, Therapy,andSensingofDrugDeliveryBasedonBi FluorescenceResonanceEnergyTransfer[J].NanoLet,2007,7: 3065 3070.
第 6 期 刘传银等 : 亲和型生物传感器在生物医学上的应用进展 623 [86]ZhangJ,QiHL,LiY,etal.ElectrogeneratedChemiluminescenceDNABiosensorBasedonHairpinDNAProbeLabeled withrutheniumcomplex[j].analchem,2008,80:2888 2894. [87]HuangHP,ZhuJJ.DNAAptamer basedqdselectrochemiluminescencebiosensorforthedetectionofthrombin[j]. BiosensBioelectron,2009,25(4):927 930. [88]PoletJ,DelportF,JansenKPF,etal.FiberOpticSPRBiosensingofDNAHybridizationandDNAProteinInteractions [J].BiosensBioelectron,2009,25(4):864 869. [89]TombeliS,MinunniM,LuziE,etal.Aptamer basedbiosensorsforthedetectionofhiv 1TatProtein[J].Bioelectro chemistry,2005,67:135 141. [90]HianikT,OstatnaV,ZajacovaZ,etal.DetectionofAptamerProteinInteractionsUsingQCMandElectrochemicalIndicator Methods[J].BioorgMedChemLet,2005,15:291 295. [91]SavranCA,KnudsenSM,ElingtonAD,etal.MicromechanicalDetectionofProteinsUsingAptamer BasedReceptor Molecules[J].AnalChem,2004,76:3194 3198. [92]HwangKS,LeeSM,EomK,etal.NanomechanicalMicrocantileverOperatedinVibrationModeswithUseofRNAAptamer asreceptormoleculesforlabel freedetectionofhcvhelicase[j].biosensbioelectron,2007,23:459 465. [93]YangSM,ChangC,YinTI,etal.DNAHybridizationMeasurementbySelf sensingpiezoresistivemicrocantileversin CMOSBiosensor[J].SensActuatB Chem,2008,130(2):674 681. [94]YaoCY,QiY Z,ZhaoY H,etal.Aptamer basedpiezoelectricquartzcrystalmicrobalancebiosensorarayforthe QuantificationofIgE[J].BiosensBioelectron,2009,24(8):2499 2503. RecentAdvanceofAfinitiveBiosensorsin BiomedicalApplications LIUChuanyin a,b,hujiming b ( a ColegeofChemicalEngineringandFoodScience,XiangfanUniversity,Xiangyang; b KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforBiologyandMedicine(MinistryofEducation), ColegeofChemistryandMolecularSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072) Abstract Biosensorshavereceivedvigorousdevelopmentandseriousconcerninrecentyearsowingtothe combinationswithnanotechniques,flow injectionandmicro fluidicsdevices.afinitivebiosensorisakindof high techsensingdevicebasedonthespecificafinitybetweenbiologicalmolecules,andtheafinityof bioactivesubstanceandsubstrate.withtheadvantagesofhighspecificity,goodsensitivity,highspeed,low cost,on linemeasuringandmonitoringincomplicatedsystem,afinitivebiosensorsarewidelyusedin biomedicalfields,suchasthedetectionofbiomedicalmarkers,nucleicacids,proteins,viruses,bacteriaand toxins,theresearchofmedicineactionsmechanism,clinicaldrugscreening,andetc.inthispaper,the recentadvanceofafinitivebiosensorsinbiomedicalapplicationsarereviewed.wealsofocusonagrowing numberofapplicationsandprogresinimmunosensorsandaptamer basedbiosensorsfortumorbiomarker, nucleicacidsand proteins. Itcoversthebasicprinciplesand biomedicaland clinicalapplicationsof immunosensorsandaptamer basedbiosensors,andindicatesthefutureprospectsinthisfield. Keywords afinity biosensor,immunosensor,tumor biomarker,aptamer based biosensor,biomedical application