中国畜牧兽医 " 羊种布鲁氏菌 基因的克隆 原核表达及其蛋白的生物信息学分析 聂 鑫 赵天靖 曹瑞勇 彭冬梅 李国华 李亚颖 徐开莲 朱华培 庞 峰 王凤阳 杜 丽 海南大学农学院 海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室 海口市动物基因工程重点实验室 海口 摘 要 试验旨在克隆羊种布鲁氏菌 1 基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析 以布鲁氏菌 株基因组为模板 参照 +" 中 株基因组 )- 序列 用 )-- 软件设计 对引物 通过聚合酶链式反应 < 扩增得到大小为 的 1 基因 将其连接入 ) 载体上 构建 ) 重组质粒 将其转化到 %')7 感受态细胞中 经 7 和 ' 双酶切鉴定正确后扩大培养 将 7 和 ' 双酶切获得的 片段连接入 构建重组质粒 转化到 %') 中 双酶切鉴定正确后扩大培养 经 *+ 诱导其表达 用,),-+ 和 "'"0 对蛋白进行鉴定 运用 )-- 等软件对 1 基因编码的氨基酸序列进行分析 结果表明 本研究成功克隆了 1 基因并进行了蛋白表达 在 蛋白二级结构中 螺旋 伸展链 折叠和无规卷曲分别占 和 关键词 羊种布鲁氏菌 1 基因 克隆 原核表达 生物信息学分析中图分类号 文献标识码 - 文章编号 """'"""') " 1" "%'' *A7--<1+)"*+*;1 A 07 7"-+"-+ "1) +''' ' '+''' '11'' 1 ' ' ' ' -' )*'"'1'"0"""''1 """"' 01''""")- ''"'"0"- """'""" +""' '"'"1 ""''0"1<'0")%"" '""0') ''"%')7"" 0''"1"0"'""''"""" ) '"'"17 '"""''"" 1""''%""'%"0' '"" ''"%')"""''""'""1,),-+ "'"0)--'"'""'"01""'" ""'""1""""'0''""),''"'' 010"""''""'"1'""''"'""0 """' 0 "EE E 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 作者简介 聂 鑫 女 河南周口人 硕士生 研究方向 动物功能基因组学 0 通信作者 杜 丽 女 山西阳高人 硕士 教授 研究方向 预防兽医学 010
中 国 畜 牧 兽 医 卷 E"'"%"01 +,"1""01""'''01'' 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种分布于世界各地的人畜共患的传染病 严重危害人类健康和 畜牧业生产 感染公畜表现为睾丸炎和附睾炎 母畜表现为流产 早产或产死胎 人感染布鲁氏菌后多表现为波状热 关节炎 脑膜炎和睾丸炎 且久治 不愈 布鲁氏菌属于革兰氏阴性菌 但其脂多糖的内毒素性质要比其他革兰氏阴性菌弱几百倍 且能够抑制补体和抗菌肽对菌体的攻击 通过抑制细胞因子等免疫介质的合成来抑制宿主的先天免疫 从而 帮助细菌在细胞内生存 导致宿主慢性感染 进一步研究发现其脂多糖中的类脂 - 具有内毒素的 活性 值得关注的是 最近研究发现 与合成脂多糖相关的蛋白可以被用于研制布鲁氏菌新型疫 苗 如通过修饰脂多糖中类脂 - 的结构 可以发展出新型, 免疫佐剂或对抗药物 或者优化革兰 氏阴性菌活疫苗 1 基因是编码类脂 - 二糖 合成酶的基因 该酶控制类脂 - 的早期合成 本试验克隆了 1 基因 构建 重组质粒 诱导其在大肠杆菌中表达 并对表达的蛋白进行生物信息学分析 为今后研究 功能及类脂 - 结构的修饰奠定基础 材料与方法 - 材料 菌株 载体及主要试剂 布鲁氏菌 株基因组由石河子大学张辉博士惠赠 %' )7 感受态细胞 %') 感受态细胞 ) 均为海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室保存 )- 聚合酶 限制性内切酶 )- 连接酶 )- 胶回收试剂盒均购自 < 公司 兔抗 7' 单克隆抗体购自 " 公司 辣根过氧化物酶 7< 标记的羊抗兔 *+ 购自 *%" 公司 引物设计与合成 参照 +" 上公布的布鲁氏菌 株基因组中 编码框 )- 序列 利用 )-- 软件设计 对引物 上游引物 ++++--+--+-- -+-+++ 端添加 7 酶切位点 下游引物 <+++-+-+-- +++ 端添加 ' 酶切位 点 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 - 方法 < 扩增 1 基因 以 株的基因组 )- 为模板 和 < 为引物 用 < 方法扩增目的片段 < 反应程序 > 预变性 > 变性 ' > 退火 ' > 延伸 个循环 > 延伸 > 终止反应 反应结束后 利用 琼脂糖凝胶对产物进行电泳检测 并用 )- 胶回收试剂盒纯化 < 产物 1 基因的克隆 参照赵天靖等方法 将回收纯化的 < 产物连接线性载体 构建重组质粒 ) 连接体系及反应条件 ) 目的片段 7,0 混匀后 > 过夜连接 将重组质粒转化 %')7 感受态细胞 挑取阳性单克隆菌落 > 过夜摇菌 提取质粒 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 重组质粒的构建与鉴定 分别对测序正确的 ) 及表达载体 用 7 和 ' 双酶切 参照史巧芸 等方法构建 重组质粒 连接体系及反应条件 载体 经双酶切目的片段 )- 连接酶 )- 连接酶缓冲液 混匀后 > 过夜连接 转化 %') 受体菌 挑取单克隆 > 过夜摇菌 提取质粒 利用 7 和 ' 双酶切后 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定 并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 1 基因的原核表达及鉴定 挑取阳性单菌落于 > 摇菌 待其 为 E 加入终浓度为 0 的 *+ 诱导 后 收集沉淀 加入 裂解液,),) 反复吹打使其裂解 > 水浴 冰上静置 后 离心 收集上清 进行,),-+ 电泳检测 确定 *+ 最佳诱导浓度 以最佳浓度诱导 后用上述方法收样 进行,),-+ 电泳检测 确定最佳诱导时间 用最佳诱导浓度和时间诱导表达重组蛋白 超声波破菌后 取上清和沉淀通过,),
期 聂 鑫等 羊种布鲁氏菌 1 基因的克隆 原核表达及其蛋白的生物信息学分析 -+ 进行重组蛋白的可溶性分析 参照徐开莲 等报道进行 "'"0 鉴定 将诱导产物进行,),-+ 后 在 - 且低温的条件下 经 转移到 ) 膜上 将 ) 膜放入去离子水平衡 后 用含 脱脂奶粉的, 封闭 取出后用含 "" 的, 洗涤 次 次 将 ) 膜放入 稀释的兔抗 7' 单克隆抗体中摇床上孵育 再次如上述方法洗涤后 放入 稀释的 7< 标记的羊抗兔 *+ 抗体中孵育 最后 显色拍照 蛋白的生物信息学分析 将 1 基因序列输入 )-- 中翻译成氨基酸序列 再将其氨基酸序列载入到, 网站中的,- 二级结构预测模块中 即 '' '0 "'' 0 得到其二级结构预测图 用 软件中的 1" )00" 平均疏水性轮廓分析模块对氨基酸序列进行分析 得到其疏水性轮廓分析图 结果与分析 - 基因的 扩增与克隆以 株基因组为模板 以 < 为引物进行 < 反应 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳得到 条 的片段 图 测序结果表明 该片段与 +" 中提供的 株基因组 1 基因序列同源性为正确 表明扩增结果 图 基因 扩增结果 -" - 酶切鉴定 00 重组质粒 将重组质粒转化到 %') 中 扩增并提取质粒 对 重组质粒用 7 和 ' 双酶切 得到约 与 的条带 图 说明 1 基因已经成功连入 载体中 即成功构建重组质粒 ))- " 双酶切鉴定结果 重组质粒 )- )- " ))- ")0""1""'"<"0' )- )- " 图 重组质粒 00 酶切图谱 -'""'"* 00
%1) 中国畜牧兽医 F1 V0N\ 诱导表达的结果分析 E 0JR 重 组 质 粒 > 0% 01 G 转 化 i " A* * b 条 件 下分 别 用 浓 度 为 i% i% % 的 ;>C 诱 导 P i% % % FF DAD ;EC 结果显示随着;>C 浓度的增加重组蛋白 表达量 )* 卷 重组蛋白 已 经 有 足 够 量 的 表 达' 之 后 用%FF % ) 1P DAD ;EC 结 果 显 示 ;>C 分别 诱 导 0 重组蛋白表达量也呈现递增的结果"图)在P 重 组蛋白的表达量已满足试验需求'说 明 ;>C 浓 度 为 %FF %诱导时间 P 为适宜诱导条件' % 呈现递增的结果"图 *在;>C 浓度为%FF 01空 载 体 诱 导 产 物 01 G 未 诱 导 产 物 % 7 0% " A*阴性对照 0 * )"1重 组 质 粒 > > > %;>C 诱导 P 的表达产物J蛋白质分子质量标准 01 G 经 ' % ' % ' % % %FF % WO 7, ]7 0% " A* 0 "> 01 *V "> 01 G ) 1 G - " %, ]> 01 G "\I' % ' % ' % %-"%FF ;>C] P J ; - J 图 不同浓度 7-RI 诱导表达的 >G> -AIJ 分析 >G> -AIJ11 0 N0 < 1 7-RI 01空 载 体 诱 导 产 物 01 G 未 诱 导 产 物 % 7 0% " A*阴性对照 0 * )"重 组 质 粒 > > > % 时分别诱导 0 01 G 在 ;>C 浓度为 %FF ) 1P 的表达产物J蛋白质分子质量标准 % WO 7, ]7 0% " A* 0 "> 01 *V "> 01 G ) G - " %;>CJ ) -"1P\I%FF ; - J, ]> 01 G "] 0 图 % 不同时间诱导表达的 >G> -AIJ 分析 %>G> -AIJ11 0 N0 < M 利 用 超 声 波 破 菌取 上 清 和 沉 淀 进 行 DAD 结果发现 重 组 蛋 白 主 要 以 包 涵 体 的 形 式 存 ;EC 的蛋白与预期结果一致"图 ' 在"图 ' ;<Aa 膜上 进 行 f -\ -O':J 显 色 后 在)1 处有一条特异性抗体结合带"图说明目 重 组 质 粒 > 0% 01 G 转 化 7 " %;>C 诱导 P' A* * b 条件下用 %FF DAD ;EC 分析 结 果 显 示得 到 一 个 约 )1 左 右 将 DAD ;EC 分 离 后 的 蛋 白 条 带 电 转 印 到 的蛋白表达正确'
期 聂 鑫等羊种布鲁氏菌 IP< 基因的克隆原核表达及其蛋白的生物信息学分析 %1 01 G 未 诱 导 产 物 01 G 诱 导 产 物 J蛋白质分子质量标准 % 0 *表 达 产 物 超 声 波 处 理 后 上 > > 清 )表达产物超声波处理后沉淀 J; - J %V "> 01 G 0 "> 01 G * D - ], F ) ;, - ], F 图 重组蛋白的可溶性分析 > < 11 M 1 0 01空载体未诱导产物 01空载体诱导产物 01 G 未 诱 % 7 0% " A*阴性对照 0 * ) > > > 导产物 01 G 诱导产物J蛋白质分子质量标准 > % WO 7, ]7 0% " A* 0 V "> 01 * "> 01 ) V "> 01 G "> 01 GJ ; - J 图 重组蛋白表达的 >G> -AIJ 分析 A1 N0 P M 1 0 >G> -AIJ % 7 0% " A*阴性对照 0 01空载体未诱导产物 * 01空载体诱导产物 ) 01 G 未 诱 > > > 导产物 诱导产物 蛋白分子质量标准 > 0 1 G J % WO 7, ]7 0% " A* 0 V "> 01 * "> 01 ) V "> 01 G "> 01 GJ ; - J 图 ' 重组蛋白 Y L鉴定 'Y L M 1 0
%1 中国畜牧兽医 E %V0N\ 蛋白的生物信息学分析 0' )' %G 蛋 白 二 级 结 构 分 析 采 用 AWE JEW 软件分析 G 核苷酸序列推测其氨基酸序 )* 卷 块对 G 蛋 白 进 行 二 级 结 构 预 测' 结 果 显 示 G 蛋白的二级结构含 0' )%_ ' 螺旋 1 i%_ 折叠 %)' )_ 伸展链 0)' _ 无规卷曲"图 1' 列'用 W;D 网 站 中 的 DR;JE 二 级 结 构 预 测 模 P 螺旋 伸展链 折叠,无规卷曲 ' P' P G G -"" -" -, `-"F, 图 FV0N\ 蛋白二级结构预测 F- 1 < < V0N\0 0' )' 0G 蛋白疏水性分 析 利 用 " 软 件对氨基酸序列进行 ZI m A 平均 疏水 性 轮廓分析横轴代表目的基因氨基酸的位数纵轴代 高'结果显示 G 蛋白大部分疏水性区域分布在 c%' 0"M%' 之 间 "图 表 明 G 蛋 白 具 有 较 高疏水性' 表亲水分值 的 大 小曲 线 的 分 值 越 低其 亲 水 性 越 图 )V0N\ 蛋白疏水性分析 )W 0P V0N\0 11 展出新型布鲁氏菌疫苗'而 IP< 基因编码的类脂 E 二糖合成酶参与类脂 E 生物 合成 过程 的 第 步 讨 论 目前由 马 耳 他 布 鲁 氏 菌 引 起 的 绵 羊 和 山 羊 的 反应 )*即酶 G 催化 VA; 0 *二酰基氨基葡萄 布鲁氏菌 病 是 最 重 要 的 临 床 疾 病 之 一 )%**' 普 遍 认 糖与 "e 合 成 反 应形 成 一 个 由 0 个 氨 基 葡 萄 为对于疫情严重的国家感染马耳他布鲁氏菌的绵 糖和 ) 个脂肪酸链构成的兼性分子 ADJ;)%*' 羊不能仅通过检测和捕杀而根除因此控制疾病的 扩散需要 合 理 的 疫 苗 接 种 计 划 ) %)* '布鲁氏菌的脂 多糖中类脂 E 使 革 兰 氏 阴 性 菌 具 有 毒 性 作 用' 研 究发现通 过 修 饰 脂 多 糖 中 类 脂 E 的 结 构可 以 发 本试 验 成 功 克 隆 了 布 鲁 氏 菌 IP< 基 因构 建 了 > 01 G 原 核表达 载体诱 导后 经过 DAD ;EC 和 f -\ -O 分析结 果 表 明 成 功 表 达 了 G 蛋白'本试验的创新和改进之处有以下几
期 聂 鑫等 羊种布鲁氏菌 1 基因的克隆 原核表达及其蛋白的生物信息学分析 方面 在扩大培养 %') 时 本试验 较徐开莲等选取 值的范围缩小到 E E 以便使各试验组的菌体量尽可能保持一致 减小结果误差 在优化诱导浓度时发现 虽然在 *+ 浓度为 0 时蛋白表达量较 0 有一定的提高 但就试验研究来说 浓度为 0 时的表达量已可满足试验需要 在分析不同诱导时间时 诱导 后的表达量也已满足试验的需要 若需大量表达 可将诱导时间延长至 在进行 超声波破碎时 本试验较汪明群等调整超声波破碎程序中间歇时间延长至 ' 以防止破菌时温度过高 导致蛋白质变性 近一步对 蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析发现 1 基因编码的蛋白质由 个氨基酸组成 其二级结构中含有大量的 螺旋和少量的 折叠 其中 螺旋是遗传信息传递 表达和肽链形成更高结构层次的分子基础 而 折叠是存在于蛋白质肽链末端的 螺旋因运动自由度较大和外力作用而形成的一种蛋白质二 级结构 通过 软件分析推测 蛋白具有较高的疏水性 以维系其蛋白的高级结构 本试验结果为布鲁氏菌类脂 - 结构和功能的深入研究奠定了基础 参考文献 齐景文 布鲁氏菌病概述 : 中国兽医杂志 "0 :"0''-%"%":)* 张 敏 刘宗平 于圣青 布鲁氏菌脂多糖及其突变株的研究进展 : 中国动物传染病学报 袁 莎 陈鹏博 陈创夫 布鲁氏菌, 对小鼠巨噬细胞中 < 炎症小体转录水平的影响 : 中国畜牧兽医 +0'"<"'"0 "0,1" 0'""0-""''" 0"%"': ' ',,' :+'" "0%"0%""''"0"0"'' "" "%"'" %01 : ' ' ) '' "') 70"< 1 :"00 -"''%'0: "'',, <" < 70"0""'""' 0''1"'': <""%"' <7' 0% -"0"0 01'"'1"''"""0": "'' 赵天靖 贾晓晓 焦寒伟 等 布鲁氏菌外膜蛋白 基因的克隆 原核表达及蛋白生物信息学分析 : 中国畜牧兽医 史巧芸 荣 辉 郭莳雨 等 羊布鲁菌外膜蛋白 1* 基因的克隆及其原核表达 : 动物医学进展 徐开莲 朱华培 赵天靖 等 羊种布鲁氏菌 1 基因的克隆及原核表达 : 中国畜牧兽医 赵忠鹏 王希良 布鲁菌毒力因子研究进展 : 微生物学免疫学进展 :""'F0':"0- "0' 001'""" ''%"'"""" %0'"00"''"'0'"' %0%'<"%%: "'' 0-70')""0"'1 --"""1:* '1' 汪明群 丛建波 程 莉 等,<)+, 融合蛋白的原核表达 纯化及复性 : 生物技术通讯 石华建 生物螺旋结构的奥妙与应用 : 生物学通报 责任编辑 秦 彤