国际药学研究杂志 2013 年 12 月第 40 卷第 6 期 JIntPharmRes,Vol.40,No.6,December,2013 807 野菊花中黄酮类成分的抗菌活性及指纹图谱 张金杰 1,2, 吕文文 1,2, 翁远超 1,2, 陈宇峰 1 1, 赵庆春 [ 摘要 ] 目的评估野菊花中黄酮类成分的抗菌活性并建立其 HPLC 指纹图谱的测定方法 方法采用微量肉汤稀释法检测野菊花总黄酮及蒙花苷对临床常见致病菌的最低抑菌浓度 (minimuminhibitoryconcentration,mic) 采用如下液相条件进行指纹图谱分析 :DiamonsilC 18 (4 6mm 250mm,3μm), 乙腈 水 (0 05% 磷酸 ) 流动相梯度洗脱, 流速 1 0ml/min, 室温, 检测波长 326nm, 并采用指纹图谱相似度软件对野菊花总黄酮成分进行质量评价 结果野菊花总黄酮对葡萄牙假丝酵母的 MIC 值为 61 6μg/ml, 蒙花苷对其 MIC 值为 18 0μg/ml 在抗菌活性基础上, 建立了 14 批野菊花药材黄酮类指纹图谱共有模式, 标定出野菊花中指纹图谱的 15 个共有峰, 归属了其中 8 个黄酮类化合物 结论野菊花总黄酮及蒙花苷单体对葡萄牙假丝酵母的体外抗菌活性较好 HPLC 指纹图谱方法重现性好, 可用于野菊花黄酮类活性成分的质量控制, 为野菊花质量控制研究提供前期基础 [ 关键词 ] 野菊花 ; 黄酮类 ; 抗菌活性 ; 高效液相色谱指纹图谱 [ 中图分类号 ] R284;R285 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 1674 0440(2013)06 0807 06 AntimicrobialactivityandHPLCfingerprintof flavonoidsinfloschrysanthemiindici ZHANGJin jie 1,2,LVWen wen 1,2,WENGYuan chao 1,2,CHENYu feng 1,ZHAOQing chun 1 (1.DepartmentofPharmacy,GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,Shenyang110840,China; 2.ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China) [Abstract] Objective ToevaluatetheantimicrobialactivityandestablishHPLCfingerprintofflavonoidsinFlosChrysanthemi Indici.Methods Microdilutionmethodwascariedouttodeterminetheminimuminhibitoryconcentration(MIC)valueoftotalfla vonoidsandlinarinagainstelevenkindsofbacteriaandthreefungi.hplcfingerprintwasobtainedondiamonsilc 18 (4 6mm 250 mm,3μm)withgradientelutionconsistingofacetonitrile(a)and0 05% phosphoricacid(b),detectivewavelengthwasat326nm andflowrate1 0ml/minintheroomtemperature.ThedatawereanalyzedbyComputerAidedSimilarityEvaluationsoftware.Results MICvaluesoftotalflavonoidsandlinarinagainstCandidalusitaniaewere61 6μg/mland18 0μg/ml,respectively.Furthermore, fifteencharacteristicpeakswereindicatedinfingerprintchromatography,andeightpeakswereidentifiedasflavonoids.conclusion TotalflavonoidsandthelinarininFlosChrysanthemiIndiciexhibitedbeterantimicrobialactivityagainstC.lusitaiae.Theestablished HPLCfingerprintmethodisaccurateandreproducible,andcanbeusedforthebasicresearchandqualitycontrolofactiveflavonoidsin FlosChrysanthemiIndici. [Keywords] FlosChrysanthemiIndici;flavonoids;antimicrobialactivity;HPLCfingerprint 野菊花为菊科植物野菊 (FlosChrysanthemiIn dici) 干燥头状花序 味苦 辛, 性微寒, 归肝心经 具有疏风清热, 消肿解毒之功效 野菊花全国各地都有分布, 主产于江苏 湖北 山东 安徽等地 [1] 主要含有挥发油 萜类 黄酮类等成分 [2], 黄酮类包括蒙花苷 木犀草素 7 O β D 葡萄糖苷 芹菜素 7 O β D 葡萄糖苷 香叶木素 7 O β D 葡萄糖苷 木犀草素等 [3 4] 野菊花中黄酮类化合物抗炎镇痛活 性作用明显, 多种黄酮协同作为野菊花主要药效组分 [5] 野菊花抑菌活性报道多集中于其挥发油成分 [6 7], 而其黄酮类成分抑菌活性未见报道 本研究对野菊花中黄酮类成分进行抑菌实验考察, 为进一步寻找具有抑菌活性的黄酮类化合物以及研究野菊花抑菌活性成分和抑菌机制提供基础 中药色谱指纹图谱是对中药物质基础的一种整体表达, 能较好地体现中药成分的复杂性和相关性, 作者简介 : 张金杰, 男, 硕士研究生, 研究方向 : 天然药物化学,E mail:zhangjinjie86@163.com 作者单位 :1.110840 沈阳, 沈阳军区总医院 ( 张金杰, 吕文文, 翁远超, 陈宇峰, 赵庆春 )2.110016 沈阳, 沈阳药科大学 ( 张金杰, 吕文文, 翁远超 ) 通讯作者 : 赵庆春, 男, 博士生导师, 研究方向 : 中药及天然产物物质作用基础研究 基于靶点的抗肿瘤天然产物研究,Tel:024 28856205,E mail: Zhaoqqingchun1967@163.com
808 国际药学研究杂志 2013 年 12 月第 40 卷第 6 期 JIntPharmRes,Vol.40,No.6,December,2013 更好地反映并控制中药的内在质量 [8], 而定性 定量分析一类具有特定生物活性的药效成分可作为中药质量控制的有效途径 [9] 因此研究中药中活性组分并采用指纹图谱来控制质量对于稳定中药质量具有重要的意义 目前关于野菊花指纹图谱研究的报道虽然较多 [10 11], 但对于具有抗病原微生物 抗炎和镇痛活性的黄酮类化合物指纹图谱研究较少 本文采用 HPLC 法首次建立了野菊花中主要黄酮类成分的指纹图谱, 并对 14 批野菊花药材中黄酮类成分进行了相似性分析, 为规范野菊花活性成分的质量控制提供前期实验依据 1 材料与方法 1 1 仪器 Waters600controler Waters2996PhotodiodeAr raydetector Waters717plusAutosampler, 美国 Wa ters 公司 ;SHIMADZUAUW120D 十万分之一分析天平, 日本 Shimadzu 公司 ;HH D4 数显恒温水浴锅, 丹瑞公司 ;300 型中药材粉碎机, 中国屹立公司 ;JT 150 洁净工作台, 利港净化设备有限公司 ;DNP 9082 电热恒温培养箱, 上海精宏实验设备有限公司 ; YXQ LS 50A 立式压力蒸汽灭菌器, 上海博迅实业有限公司 ;DL 96 细菌鉴定系统, 珠海迪尔生物工程有限公司 1 2 试剂与材料色谱甲醇, 天津四友公司 ; 色谱乙腈, 美国 Fish erscientific 公司 ; 分析纯醋酸 磷酸, 国药集团 ; 重蒸水, 实验自制 ; 细菌干粉培养基, 杭州天和微生物试剂有限公司 ; 野菊花药材购买于山东 安徽 浙江 河南 湖北等各地药店, 经沈阳药科大学植物教研室孙启时教授鉴定为野菊花正品 ( 表 1) 凭证标本存放于沈阳军区总医院药剂科制剂研发室 木犀草素 7 O β 葡萄糖苷 芹菜素 7 O β 葡萄糖苷 刺槐素 7 O β 葡萄糖苷 蒙花苷 香叶木素 7 O β D 葡萄糖苷 木犀草素 小麦黄素 山奈酚, 实验室自制 ( 经波谱数据鉴定,HPLC 测定, 归一化法计算, 各对照品含量 95 3% ~98 1%) 1 3 野菊花总黄酮及蒙花苷体外抑菌实验 1 3 1 实验菌株实验所用菌株由本院检验科从临床样本中分离得到, 对同一患者同一部位的重复分离菌株, 选择首次分离菌株 由检验科药敏实验鉴定分别为细菌类鲍氏不动杆菌 铜绿假单胞菌 肺炎克雷伯菌 鸟肠球菌 屎肠球菌 溶血葡萄球菌 阴沟肠杆菌 葡萄牙假丝酵母 嗜麦芽寡养单胞菌 大肠埃希菌 白色假丝酵母 金黄色葡萄球菌 腐生葡 萄球菌腐生亚种 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和真菌类热带假丝酵母 表 1 野菊花药材样品来源 Tab.1 SamplesofFlosChrysanthemiIndici 编号 产地 S1 山东 S2 湖北 1 S3 安徽 1 S4 浙江 S5 安徽 2 S6 河南 S7 湖北随州 S8 安徽 3 S9 湖北黄冈 S10 湖北大冶 1 S11 湖北大冶 2 S12 湖北大冶 3 S13 湖北罗田 S14 湖北麻城 1 3 2 野菊花总黄酮溶液的富集制备按照文献报道方法制备野菊花样品溶液, 并采用聚酰胺柱色谱法富集总黄酮 [12] 得到的野菊花样品溶液浓度为 2 0mg/ml, 富集 干燥得到 98 6mg 总黄酮固体, 用经灭菌的含有 30% 甲醇的肉汤溶液配制 3 944 mg/ml 的总黄酮样品溶液, 离心取上清液,HPLC 测定蒙花苷含量 1 3 3 蒙花苷样品溶液制备精密称定 3 6mg 蒙花苷于 25ml 容量瓶中, 加入 30% 甲醇水溶液定容, 制成蒙花苷含量 144μg/ml 的蒙花苷样品溶液 1 3 4 最低抑菌浓度的测定参照 CLSI2009 [13], 采用微量肉汤稀释法 [14], 测定野菊花总黄酮及蒙化苷对临床常见致病菌的最低抑菌浓度 (MIC) 在 96 孔板中, 用肉汤将总黄酮和蒙花苷溶液依次倍比稀释, 至终浓度分别为 1972 0 986 0 493 0 246 5 123 3 61 6 30 8 和 15 4 μg/ml,72 0 36 0 18 0 9 0 4 5 2 3 1 1 和 0 5μg/ml 此时每孔体积为 100μl, 将用菌悬液法制备的浓度相当于 0 5 麦氏比浊标准的菌悬液, 用营养肉汤 1 1000 稀释, 向每孔加入菌悬液 100μl, 使最终细菌接种量为 5 10 5 CFU/ml,36 过夜培养 24h, 无细菌生长的最低药物浓度为 MIC 值 1 4 野菊花总黄酮 HPLC 指纹图谱分析 1 4 1 对照品溶液的制备精确称取木犀草素 7
国际药学研究杂志 2013 年 12 月第 40 卷第 6 期 JIntPharmRes,Vol.40,No.6,December,2013 809 O β 葡萄糖苷 芹菜素 7 O β 葡萄糖苷 刺槐素 7 O β 葡萄糖苷 蒙花苷 香叶木素 7 O β D 葡萄糖苷 木犀草素 小麦黄素 山奈酚等对照品适量于 25 ml 容量瓶中, 分别加入甲醇稀释定容, 制成 7 36 3 53 7 20 16 32 1 32 3 04 1 36 和 1 28μg/ml 的对照品溶液 1 4 2 供试品溶液的制备将干燥的野菊花粉碎, 过 60 目筛, 精密称取粉末 0 3g 于具塞锥形瓶中, 精密加入 70% 甲醇溶液 50ml 称重, 浸泡过夜, 加热回流 3h, 放冷, 称重 70% 甲醇补足重量, 摇匀离心, 精密吸取上清液 25ml, 浓缩至无醇味, 加蒸馏水定容至 25ml 容量瓶中, 精密量取 20ml 溶液, 浓度为每 1ml 含 6mg 药材, 按 2BV/h 吸附速度过 1g 聚酰胺树脂 (100~200 目 ), 静置吸附 0 5h 后,10% 乙醇 20ml 除杂,70% 乙醇 20ml 洗脱, 控制洗脱体积流量为 1BV/h, 收集 70% 乙醇洗脱液, 过 0 45 μm 微孔滤膜即可 1 4 3 色谱条件色谱柱 :Diamonsil(4 6mm 250mm,3μm); 流动相 : 乙腈 (A) 0 05% 磷酸水 (B), 梯度洗脱程序见表 2; 流速 1 0ml/min, 柱温室温, 检测波长 326nm, 进样量 20μl 表 2 梯度洗脱条件 Tab.2 Gradientelutionconditions 时间 (min) 乙腈 (%) 0 05% 磷酸水 (%) 0 17 83 15 22 78 40 55 45 45 90 10 55 17 83 1 4 4 测定方法按照 1 4 2 项下制备 14 批药材样品溶液, 然后分别精密吸取不同产地供试品溶液及对照品溶液各 20μl, 注入高效液相色谱仪测定 2 结果 2 1 野菊花总黄酮及蒙花苷的抑菌活性 MIC 测定结果可见, 野菊花总黄酮对溶血葡萄球菌 葡萄牙假丝酵母 嗜麦芽寡养单胞菌 金黄色葡萄球菌 腐生葡萄球菌 热带念珠菌具有抑菌效果, 其中对葡萄牙假丝酵母 嗜麦芽寡养单胞菌 金 黄色葡萄球菌 腐生葡萄球菌腐生亚种抑制作用明显,MIC 值分别为 61 6 246 5 123 3 和 493 0μg/ ml 蒙花苷单体化合物仅对葡萄牙假丝酵母有较强的抑制作用,MIC 值为 18 0μg/ml 表 3 野菊花总黄酮及蒙花苷抑菌效果 Tab.3 Antimicrobialactivityoftotalflavonoidsandlina rinisolatedfrom FlosChrysanthemiindici 最低抑菌浓度 (μg/ml) 菌株 野菊花总黄酮 蒙花苷 鲍氏不动杆菌 不敏感 不敏感 铜绿假单胞菌 不敏感 不敏感 肺炎克雷伯菌 不敏感 不敏感 鸟肠球菌 986 不敏感 屎肠球菌 1972 不敏感 溶血葡萄球菌 1972 不敏感 阴沟肠杆菌 不敏感 不敏感 嗜麦芽寡养单胞菌 246 不敏感 大肠埃希菌 不敏感 不敏感 金黄色葡萄球菌腐生亚种 123 不敏感 腐生葡萄球菌 493 不敏感 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 不敏感 不敏感 热带念珠菌 1972 不敏感 葡萄牙念珠菌 61 6 18 0 白色念珠菌 不敏感 不敏感 2 2 HPLC 指纹图谱建立 2 2 1 共有峰的确定以蒙花苷色谱峰 (9 号峰 ) 为参照, 确定其相对保留时间为 1, 计算其他色谱峰的相对保留时间, 标定出 15 个共有峰, 结果见表 4 生成对照图谱, 见图 1 经与对照品相比较, 归属了 8 个黄酮类化合物, 确定 2 5 6 9 10 11 13 14 号共有峰分别为木犀草素 7 O β 葡萄糖苷 芹菜素 7 O β 葡萄糖苷 刺槐素 7 O β 葡萄糖苷 蒙花苷 香叶木素 7 O β D 葡萄糖苷 木犀草素 小麦黄素 山奈酚 混合对照品色谱图见图 2 14 批不同产地野菊花药材指纹图谱见图 3 2 2 2 共有峰相对峰面积以蒙花苷色谱峰面积作为 1, 计算其他各共有峰的相对峰面积 结果显示 ( 表 5), 不同样品共有峰相对峰面积差异较大, 表明不同地区的野菊花药材黄酮类化合物之间存在较大差别
年 月 国际药学研究杂志 第 卷 第 期 ＪＩ Ｐｈ ｍｒ Ｖ Ｎ Ｄ ｍｂ 表 批野菊花黄酮类化合物指纹图谱共有峰相对保留时间 Ｔ ｂ Ｒ ｍ ｍｍ ｐ ｋ ｄ ｐ ｂ ｈ Ｆ Ｃｈ ｈ ｍｉ 共有峰相对保留时间 批次 平均值 Ｒ Ｄ 图 批野菊花黄酮类化合物指纹图谱图谱共有模式 Ｆ Ｃ ｍｍ ｐ ＨＰＬＣ ｄ ｐ Ｆ Ｃｈ ｈ ｍｉ 图 野菊花对照品色谱图 注 木犀草素 葡萄糖苷芹菜素 葡萄糖苷 刺槐素 葡萄糖苷蒙花苷 香叶木素 Ｄ 葡萄糖苷 木犀草素 小麦黄素 山奈酚 Ｆ ＨＰＬＣ ｍｐ ｍ Ｆ Ｃｈ ｈ ｍｉ ｐ ｄ ｐ ｐ ｄ ｐ ｄ ｄ ｍ ｐ ｄ Ｐ ｋ Ｐ ｋ ｋ ｍｐ
年 月 国际药学研究杂志 第 卷 第 期 ＪＩ Ｐｈ ｍｒ Ｖ Ｎ Ｄ ｍｂ 图 批不同来源野菊花黄酮类化合物指纹图谱 Ｆ ＨＰＬＣＦ ｐ ｂ ｈ Ｆ Ｃｈ ｈ ｍｉ ｍ ｄ 表 批野菊花黄酮类化合物指纹图谱共有峰相对峰面积 Ｔ ｂ Ｒ ｐ ｋ ｍｍ ｐ ｋ ｄ ｐ ｂ ｈ Ｆ Ｃｈ ｈ ｍｉ 共有峰相对峰面积 批次 相似度评价 药材指纹图谱建立共有模式 拟出对照指纹图谱 将 表 批野菊花药材相似度分析 采用 中药色谱指纹图谱相 似度评价系统 Ａ版对 批不同产地的野菊花 Ｔ ｂ Ｔｈ ｍ ｂ ｈ Ｆ Ｃｈ ｈ ｍ Ｉ 每张指纹图谱与其进行比较 得到各谱与对照指纹图 编号 相似度 编号 相似度 谱的相似度 结果见表 实验结果提示 批药材 与对照图谱的相似度达到 符合要求 方法学考察 连续进样 次 记录色谱图 各共有峰的相对保留 时间 Ｒ Ｄ值为 相对峰面积 ＲＤ 值为 结果表明 仪器精密度良 精密度考察 好 取同一份供试品溶液
812 国际药学研究杂志 2013 年 12 月第 40 卷第 6 期 JIntPharmRes,Vol.40,No.6,December,2013 2 3 2 稳定性考察取同一份供试品溶液 (S6), 分别在 0 2 4 8 16 和 24h 测定, 记录色谱图 各共有峰的相对保留时间 RSD 值为 0 054% ~ 1 193%, 相对峰面积 RSD 值为 0 440% ~2 955% 结果表明,24h 内测定, 样品稳定性良好 2 3 3 重复性考察 取野菊花药材 (S6)6 份, 按 1 4 2 项下方法制备供试品溶液, 分别进行测定 各共有峰的相对保留时间 RSD 值为 0 033% ~ 0 590%, 相对峰面积 RSD 值为 0 468% ~2 957% 结果表明, 本方法重复性良好 3 讨论 目前, 中草药因其多成分 多靶点 低副作用等特点, 可防止抗生素等单靶点药物长期 反复作用而产生的耐药性, 在治疗感染性疾病方面越来越受到 [15] 重视 有文献报道从植物中分离得到黄酮类化合物具有直接抑菌 联合抗生素协同作用抑菌 抑制细菌的致病性等生物活性 如芹菜素 木犀草素 木犀草素 7 O β D 葡萄糖苷具有很好的抑菌效果 本课题组前期药效试验表明野菊花黄酮类化合物抗炎镇痛活性较好, 尤其以黄酮苷类活性较佳, 进一步的抑菌实验发现, 野菊花总黄酮及蒙花苷单体化合物对葡萄牙假丝酵母的 MIC 值分别为 61 6 和 18 0 μg/ml 一般 MIC<100μg/ml 的黄酮类单体化合物具有一定的抑菌效果,MIC<10μg/ml 的化合物效果最佳 [16] 由此可见, 野菊花总黄酮及蒙花苷对葡萄牙假丝酵母有较强的抑制效果 野菊花总黄酮尤其蒙花苷的抗炎镇痛及抑菌活性值得进一步研究 而野菊花分布较为广泛, 不同产地野菊花黄酮类化合物种类和含量各有差异, 为了保证野菊花用药有效性 安全性, 在单独考察蒙花苷含量同时还要综合考虑其他主要活性化合物的种类和含量 结合野菊花活性考察结果, 本研究以黄酮类化合物作为活性成分指标, 同时作为野菊花用药分类主要依据 通过生成野菊花黄酮类化合物指纹图谱, 对野菊花活性成分进行质量控制 同时, 还采用 HPLC 法分析了 14 批不同产地的野菊花药材, 建立了其指纹图谱, 方法重现性好, 可用于野菊花黄酮类活性成分的质量控制, 为野菊花质量控制研究 提供前期基础 参考文献 [1] 江苏新医学院. 中药大辞典 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社,1986:2144. [2] 蔡华芳. 野菊花的化学成分及药用研究进展 [J]. 中国医疗前沿,2007,2(18):118 120. [3] 张聪, 秦民坚, 王玉. 野菊花化学成分 [J]. 药学与临床研究,2009,17(1):39 41. [4] 汤毅, 姚美华, 高美村. 野菊花黄酮类成分研究 [J]. 中药材,2009,32(10):1532 1534. [5] 郑璐璐, 张贵军, 王晶娟, 等. 野菊花药效组分抗炎的生物效应研究 [J]. 天津中医药,2011,28(3):251 253. [6] SasiAB,Harzalah SkhiriF,ChraiefI,etal.Chemicalcompo sitionandantimicrobialactivitiesoftheesentialoilof(tuni sian)chrysanthemumtrifurcatum(desf.)bat.andtrab.flow erheads[j].comptes rendus,2008,11(3):324 330. [7] JungEK.Chemicalcompositionandantimicrobialactivityofthe esentialoilofchrysanthemumindicumagainstoralbacteria[j]. JBacteriolVirol,2009,39(2):61 69. [8] 周建良, 齐练文, 李萍. 色谱指纹图谱在中药质量控制中的应用 [J]. 色谱,2008,26(2):153 159. [9] ChangYX,YanDM,ChenLL,etal.Potencyfingerprintofherbal productsdansheninjectionfortheirqualityevaluation[j].chem PharmBul,2009,57(6):586 590. [10] 刘婷娜, 朱恩圆, 鱺桂新, 等. 野菊花高效液相色谱指纹图谱及质量评价方法的建立 [J]. 时珍国医国药,2009,20 (4):823 825. [11] 谭晓杰, 贾英, 齐丹丹, 等. 野菊花 RP HPLC 色谱指纹图谱的建立及其质量研究 [J]. 药物分析杂志,2007,27(1): 29 32. [12] 张金杰, 陈宇峰, 苏明智, 等. 聚酰胺柱色谱分离纯化野菊花中黄酮苷研究 [J]. 中国药师,2012,5:616 620. [13] ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.PerformanceStand ardsforantimicrobialsusceptibilitytesting:nineteenthinforma tionalsupplementm100 S19[S].Wayne,PA,USA:CLSI; 2009. [14] FukumotoA,KimYP,HanakiH,etal.Cyslabdan,anewpo tentiatorofimipenemactivityagainstmethicilin resistantstaphy lococusaureus,producedbystreptomycessp.k04 0144[J].J Antibiot,2008,61(1):7 10. [15] CushnieTP,LambAJ.Antimicrobialactivityofflavonoids[J]. IntJAntimicrobAg,2005,26(5):343 356. [16] RíosJL,RecioMC.Medicinalplantsandantimicrobialactivity [J].JEthnopharmacol,2005,100(1 2):80 84. ( 收稿日期 :2013 09 22 修回日期 :2013 10 22)