第 6 章 蛋白质的功能与进化
主要内容 一 蛋白质功能的多样性二 血红蛋白的结构三 血红蛋白的功能 : 转运氧四 血红蛋白分子病五 免疫球蛋白六 氨基酸序列与生物学功能
一 蛋白质功能的多样性 催化 ( 酶 ) 调节 ( 激素 ) 转运 ( 血红蛋白 膜转运蛋白 ) 贮存 ( 卵清蛋白 ) 运动 ( 肌动蛋白 肌球蛋白 ) 结构成分 ( 角蛋白 胶原蛋白 ) 支架作用 ( 支架蛋白 : 在细胞应答激素和生长因子的复杂途径中起作用 ) 防御和进攻 ( 免疫球蛋白 蛇毒的溶血蛋白 )
荧光素酶
血红蛋白 ( 氧转运蛋白 )
角蛋白
二 血红蛋白的结构 氧结合蛋白质 肌红蛋白 (Myoglobin, Mb) 血红蛋白 (Hemoglobin, Hb)
肌红蛋白 血红蛋白 存在肌肉血液 ( 红细胞 ) 形状扁平的棱形近似球形 功能 肌红蛋白与血红蛋白结构和功能的比较 三维结构 血红素辅基结合位点 对氧的亲和力 与氧结合, 贮存和分配氧 单体蛋白质 : 三级结构一条多肽链 (153 个氨基酸残基 ) 8 个 α- 螺旋单链组成 1 个, 一条多肽链的疏水空隙内 更大 ( 饱和程度高 ) 氧合曲线双曲线 S 型曲线 与氧结合, 结合并转运氧 寡聚蛋白质 : 四级结构四条多肽链 : 两条 α 链 (141 个残基 ); 两条 β 链 (146 个残基 ) 每条链为 8 个 α- 螺旋组成 4 个, 每条多肽链的疏水空隙内 大
Kendrew J.C. (1917-) 英国生物物理和分子生物学家, 在 1957 年和 1960 年用 X 衍射分析了肌红蛋白的三维结构 Perutz M.F.(1914-) 澳大利亚裔英国分子生物学家, 在 1938 年和 1960 年用 X 衍射分析了血红蛋白的分子结构 1962 年因他们对球蛋白研究的突出贡献而获得诺贝尔化学奖
1. 血红素 血红素 (heme): 肌红蛋白和血红蛋白的每个亚基都有一个辅基 脱辅基蛋白质 (apoprotein): 去辅基的蛋白质 全蛋白质 (holoprotein)= 脱辅基蛋白质 + 辅基 血红素 : 原卟啉 Ⅸ 与还原型铁 Fe 2+ 或 Fe(Ⅱ) 的络合物, 亚铁原卟啉
原卟啉 Ⅸ:4 个吡咯环经甲叉桥连接而成, 还有 4 个甲基 2 个乙烯基 2 个丙酸基
Ⅸ
2. 肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白 (Myoglobin) 哺乳动物肌肉中贮存和分送氧的蛋白质 如鲸 海豹和海豚的肌肉中 单体蛋白质 : 仅由一条肽链和一个血红素辅基构成 珠蛋白 (globin): 脱辅基蛋白质 Mr = 17 000,153 个氨基酸残基 多肽主链由 8 个 α 螺旋区段组成, 单结构域 ; 亲水基团多在外层, 疏水基团多在分子内部 ; 血红素辅基位于疏水洞穴中 ; 血红素辅基能结合氧
His :93(F8);64(E7)
结合方式 :O 2 Fe (Ⅱ) 原卟啉 Ⅸ
O 2 与肌红蛋白的结合 远端组氨酸 : 空间位阻, 倾斜 60 近端组氨酸
疏水环境的意义 通常 O 2 与 Fe(Ⅱ) 接触会使 Fe(Ⅱ) 氧化为 Fe(Ⅲ), 血红素也是一样 但在肌红蛋白内部, 由于疏水的环境, Fe(Ⅱ) 不易被氧化 微环境的作用 : 固定血红素基 ; 保护血红素铁免遭氧化 ; 为 O 2 提供一个合适的结合部位
CO 与 O 2 竞争血红素的结合部位 游离的血红素结合 CO 比结合 O 2 强 25 000 倍 肌红蛋白中的血红素对 CO 的亲和力仅为对 O 2 的 250 倍 空间位阻 CO 中毒的机理 Danger : 0.06%~0.08% Dead: 0.1%
C
肌红蛋白中 O 2 与血红素的结合
3. 血红蛋白的四级结构 血红蛋白 (Hemoglobin) 血液的红细胞中结合并转运氧 杂四聚体 (α 2 β 2 ): 由 2 个 α 亚基和 2 个 β 亚基构成 近似球形 141 残基和 146 残基 每个亚基由一条多肽链和一个血红素辅基组成 含有 4 个血红素, 能结合 4 个 O 2 分子
肌红蛋白与血红蛋白三级结构的比较
肌红蛋白与血红蛋白三级结构的比较 每个亚基的三级结构都与肌红蛋白相似, 但一级结构相差较大
153 141 146
Identity between Hba and Hbb: < 50% Number of identity AAs among Mb, Hba and Hbb: 27
血红蛋白的四级结构 2 个结构特点 亚基的缔合出现一个中央空穴 它是另一配体 2,3- 二磷酸甘油酸 (BPG) 的结合部位 出现亚基之间的相互作用区域
血红蛋白的 4 个亚基沿着 2 个 α 亚基之间与 2 个 β 亚基之间呈双重对称轴排布, 两个 α 亚基之间与两个 β 亚基之间均有空隙, 形成中心空穴
血红蛋白亚基间的相互作用 血红蛋白半分子 (α β 二聚体的侧面观 ) 装配接触 ( 蓝色 ):α 1 和 β 1 (α 2 和 β 2 ) 的接触 涉及螺旋 B G H 和非螺旋段 GH 拐弯的 30 多个残基, 接触面大, 对亚基的装配很重要 当血红蛋白从去氧变为氧合形式时它们不变 滑动接触 ( 黄色 ):α 2 和 β 1 (α 1 和 β 2 ) 的接触 涉及螺旋 C G H 和非螺旋段 FG 拐弯的 19 个残基, 当血红蛋白因氧合作用而发生构象变化时, 这些接触也发生改变
三 血红蛋白的功能 : 转运氧 氧从大气到线粒体的途径 肺动脉中静脉血的红细胞从肺气泡中吸收 O 2 ; 吸收了 O 2 的红细胞随动脉血流到组织 ( 如肌肉 ) 的毛细血管 ; O 2 从红细胞扩散到组织的细胞中 ; 进入细胞的 O 2 扩散到线粒体中在肌肉细胞中有肌红蛋白协助 O 2 的扩散
1. 肌红蛋白是氧的贮库 氧分数饱和度 (Y), 氧合肌红蛋白分子数和去氧肌红蛋白以及氧合肌红蛋白分子数的比值 当 Y 为 1 时, 所有的肌红蛋白被氧饱和 0.27 kpa P 50 分压 肌红蛋白被半数饱和时的氧 肌肉毛细血管中氧浓度为 3 kpa, 细胞内表面处约为 1.33 kpa, 线粒体中为 0-1.33 kpa 肌红蛋白 P 50 为 0.27 kpa, 因此大多数情况下, 肌红蛋白是高度氧合的 如果由于肌肉收缩而使线粒体中氧含量下降, 它可以立即供氧 高氧合的肌红蛋白有利于氧从细胞内表面向线粒体转运 细胞内表面 1.33 kpa(y 为 80%), 线粒体 0.13 kpa(y 为 25%) 或更低
2. 血红蛋白氧合的协同性和别构效应
别构效应 (Allosteric effect): 一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力 别构蛋白质 (Allosteric protein): : 具有别构效应的蛋白质 结合部位 : 活性部位 ( 正常配体 ) 调节部位 ( 调节物 ) 或别构部位 ( 效应物 )
别构效应 同促效应 : 当调节物和正常配体是同一种分子时的别构效应 ; 发生相互作用的部位是同种的 异促效应 : 当调节物是正常配体以外的分子时的别构效应 ; 发生相互作用的部位不是同种的, 即正常配体的结合行为受到另一种配体 ( 调节物 ) 与另一种部位 ( 别构部位 ) 结合的影响
血红蛋白有正常配体结合部位和调节物结合部位, 因此它们既有同促效应又有异促效应 O 2 是血红蛋白的正常配体, 又是同促调节物 BPG 是异促调节物
协同性 : 一个配体的结合影响同种配体与其余同种空位的结合能力 正协同性 : 这种影响使亲和力加强, 即第一个配体引起第二个 第三个等配体更容易结合 S 形曲线 负协同性 : 这种影响使亲和力减弱 不呈现 S 形曲线
氧结合曲线 : 肌红蛋白 : 等轴双曲线血红蛋白 :S 形 血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线
P 50 =0.27 kpa P 50 =3.5 kpa 静脉 动脉 2.7 kpa 13.3 kpa
肌红蛋白 -- 双曲线 : 单体蛋白质, 只含有一个配基 (O 2 ) 的结合部位, 即活性部位, 分子内部不存在活性部位之间的相互作用 有利于释放更多的氧 血红蛋白 --S 形曲线 : 寡聚蛋白质, 亚基之间 ( 或氧结合部位之间 ) 存在着相 互作用 开始时, 与氧结合的能力很小 一旦与氧结合, 三级结构 发生了变化 其余亚基结合能力加强 有利于结合更多的氧
在高 po 2 下 ( 肺部 ), 血红蛋白几乎被饱和了 ; 在低 po 2 下 ( 肌肉 ), 血红蛋白对氧亲和性低, 将氧释放出来起到转运氧的作用, 释放出的氧被肌红蛋白结合 肌红蛋白和血红蛋白对氧亲合性的差异形成了一个有效的将氧从肺部运到肌肉的氧转运系统
3. 血红蛋白的两种构象状态 : R 态和 T 态 别构效应是通过别构分子中的构象变化实现的 X 射线晶体结构分析法揭示 : (Tense state) 紧张态 (T 态 ) 松弛态 (R 态 ) 去氧血红蛋白氧合血红蛋白 (Relaxed state)
滑动接触 ( 黄色 ):α 2 和 β 1 (α 1 和 β 2 ) 的接触 当血红蛋白因氧合作用而发生构象变化时, 这些接触也发生改变
血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换
氧合作用显著改变 Hb 的四级结构, 血红素铁的微小 移动导致血红蛋白构象的转换 ( 从 T 态 R 态 )
去氧血红蛋白中各亚基间的盐桥
4. BPG H + 和 CO 2 调节血红蛋白 对氧的亲和力 1 2,3- 二磷酸甘油酸 (BPG): 血红蛋白的负异促效应物或别构抑制剂 BPG 降低血红蛋白对氧的亲和力 2, 3 - Bisphosphoglycerate (BPG)
每个 Hb 四聚体只有一个 BPG 结合部位, 位于由亚基缔合形成的中央空穴内 BPG
与 β 链形成盐桥, 有助于稳定脱氧态血红蛋白构象
4 kpa 在无 DPG 时, 大约 4 kpa 时, 血红蛋白几乎被饱和了, 不能将氧卸载给肌红蛋白 ; 在有 DPG 时, 使血红蛋白对氧亲和性降低, 释放氧
2 波尔效应 (Bohr effect) 定义 :CO 2 浓度的增加及相应的 ph 降低, 使血红蛋白对氧的亲和力下降的现象 肌肉等组织 (ph7.2) 肺 (ph7.6)
S 形曲线的氧结合,Bohr 效应以及 BPG 效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效率 由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能, 因此使机体的氧水平不致有很大的起伏 血红蛋白使机体内的 ph 也维持在一个比较稳定的水平 血红蛋白的别构效应充分反应了它的生物学适应性, 结构与功能的高度统一性
四 血红蛋白分子病 分子病 : 由于基因突变导致蛋白质一级结构突变, 使蛋白质功能下降或丧失, 而产生的疾病被称为分子病 分子病是可以遗传的 血红蛋白分子病 : α 或 β 链发生了变化, 如镰刀状细胞贫血病 缺少 α 或 β 链, 如 α- 和 β- 地中海贫血病
Pauling L.C.(1901-1994) 美国化学家及和平主义者 1940 年阐明了生物大分子中分子间力的特点 1949 年他通过对镰刀状细胞贫血病的研究首先提出分子病的概念 1951 年提出了蛋白质结构的 α 螺旋模型 1952 年提出了蛋白质结构的 β 折叠模型 1954 年因他对化学键的研究并将其用于解释生物大分子的结构而获得诺贝尔化学奖 1962 年度诺贝尔奖和平奖, 致力于禁止核试验的活动
1. 镰刀状细胞贫血病 (Sickle-cell anemia)
镰刀状细胞贫血病 (Sickle-cell anemia) 镰刀状细胞贫血病患者 正常人 Red cell count 2.6 10 6 /ml 4.6~6.2 10 6 /ml Hemoglobin content 8g/100ml 14~18g/100ml HbA( Adult hemoglobin) HbS(Sickle-cell hemoglobin)
1954 年,Ingram V 等人利用指纹图谱 (Finger print) 技术 HbA HbS 胰蛋白酶 水解 28 个肽段 28 个肽段 双向纸层析 - 电泳
层析 电泳 HbA β- 链 :Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys HbS β- 链 :Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys
病因 : β- 亚基 (β- 链 ) 第 6 位的氨基酸残基不同 : Glu R 侧链是带负电荷的亲水基团, Val R 侧链是不带电荷的疏水基团 取代使原来血红蛋白分子表面的电荷发生了改变 等电点改变, 溶解度降低, 产生纤维沉淀, 从而压迫细胞质膜, 使扁圆形的红细胞变成镰刀形 不易通过毛细血管, 运输氧的功能下降, 导致组织缺血受伤, 严重的可以致死
病人血红蛋白 β 链第六位谷氨酸突变为缬氨酸, 这个氨基酸位于分子表面, 在缺氧时引起血红蛋白线性凝集, 使红细胞容易破裂, 发生溶血
治疗性矫正 用氰酸钾处理红细胞 使 HbS 分子的一个 N- 末端区缬氨酸的氨基被修饰, 就能 矫正 它的构象, 抑制镰刀状的发生, 使分子重新获得输氧能力
2. 地中海贫血病 病因 : 1 缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因 ; 2 所有基因都可能存在, 但一个或多个基因发生无义突变, 结果产生缩短了的蛋白链 ; 或发生移码突变, 致使合成的链含不正确的氨基酸序列 ; 3 所有基因都可能存在, 但突变发生在编码区之外, 导致转录被阻断或前体 mrna 的不正确加工 种类 : β 地中海贫血 α 地中海贫血
1. 相关概念 五 免疫球蛋白 免疫是人类和脊椎动物最重要的防御机制 抗原 (Antigen): 能引起免疫应答的任何分子或病原体, 包括病毒 细菌细胞壁 蛋白质或其他大分子 抗体 (Antibody, 或免疫球蛋白 Immunoglobulin): 由活化的成熟 B 淋巴细胞 ( 浆细胞 ) 分泌的球蛋白, 存在于血清中, 能识别和结合抗原引发免疫反应 抗体具有两个显著特点 : 高度的特异性和庞大的多样性
2. 免疫球蛋白的类别和结构 人的免疫球蛋白分为五类 :IgG IgA IgM IgD IgE
IgG 是血清中最丰富的免疫球蛋白 13% 6% 1% 80% IgG IgA IgM IgD+IgE
IgG 的结构 IgG 是呈 Y 型结构的球蛋白
根据组成多肽链的大小可分为轻链 (Light chain, L) 和重链 (Heavy chain, H) 轻链 :25KD,214 个氨基酸残基 重链 :50KD,450-570 个氨基酸残基
根据 L 链和 H 链一级结构的序列同源性可分为可变区 (Variable domain, V) 和恒定区 (Constant domain, C) 可变区 :V L & V H 恒定区 :C L, C H 1, C H 2, C H 3 铰链区 :
三级结构模型图
免疫球蛋白 IgG 的水解片段 木瓜蛋白酶 : 得到两个相同的 Fab 段和一个 Fc 段 胃蛋白酶 : 得到 F(ab) 2 的二价片段和若干小肽片段 (pfc )
3. 基于抗体 - 抗原相互作用的生化分 析方法 多克隆抗体与单克隆抗体是两个重要的生化分析试剂 ELISA( 酶联免疫吸附测定 ) 免疫印迹测定 (Western 印迹 ) 免疫亲和层析
1 多克隆抗体 多克隆抗体 : 是由多个不同的 B 淋巴细胞在应答一种抗原时产生的抗体 ; 是识别一个抗原的不同表位的多种抗体的混合物
单克隆抗体 : 是由生长在细胞培养物中的同一个 B 细胞的群体 ( 一个克隆 ) 合成并分泌的 ; 是均一的 ; 识别同一抗原表位的抗体 2 单克隆抗体
单克隆抗体的制备步骤 1 抗原制备 ; 2 免疫动物 ; 3 免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备 ; 4 细胞融合 ; 5 杂交瘤细胞的选择培养 ; 6 杂交瘤细胞的筛选 ; 7 杂交瘤细胞的克隆化 ; 8 单克隆抗体的检定 ; 9 分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 ; 10 单克隆抗体的大量制备
3 酶联免疫吸附测定 (ELISA) ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 酶联免疫吸附测定 : 以待测抗原 ( 或抗体 ) 与酶标抗体 ( 或抗原 ) 的特异结合反应为基础, 通过酶活力测定来确定抗原 ( 或抗体 ) 的含量 因为结合了免疫反应和酶催化反应, 所以是一种特异而又敏感的技术
酶标仪和酶标板
基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上, 并保持其免疫活性 测定时, 将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分 然后加入酶的作用底物催化显色, 进行定性或定量测定
操作步骤 将已知抗原吸附于固相载体, 加入待检标本 ( 含相应抗体 ) 与之结合 洗涤后, 加入酶标抗球蛋白抗体 ( 酶标抗抗体 ) 和底物进行测定
4 免疫印迹测定 (Immunoblot assay) Western 印迹 (Western blotting) 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法 将含有目标蛋白 ( 抗原 ) 的样品首先用电泳分离后, 通过转移电泳转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面, 然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测
Western blotting
5 免疫亲和层析 (Immunoaffinity chromatography) 是利用抗原和抗体所具有的专一亲和力而设计的层析技术 抗原和抗体在一定条件下能紧密结合成复合物, 而这种结合又是可逆的, 改变条件可将抗原抗体解离 当把抗原和抗体的一方 ( 称配体 ) 结合在惰性载体上使其固相化, 另一方随流动相流经该载体, 双方即结合为一整体 然后设法将它们解离, 从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质
六 氨基酸序列与生物学功能 同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质 : 在不同生物中行使相同或相似功能的蛋白质 氨基酸序列同源, 如血红蛋白 不变残基 可变残基
来自任何两个物种的同源蛋白质, 氨基酸序列之间的残基差异数目与这些物种间系统发生差异是成比例的, 也即在进化位置上相差愈远, 其序列之间的残基数目差别愈大 细胞色素 c: 含血红素的电子转运蛋白 存在于所有真核生物的线粒体中 一百零几个氨基酸残基,28 个不变残基 系统 ( 发生 ) 树 : 是用计算机分析细胞色素 c 序列并找出连接分支的最小突变残基数的方法构建起来的
P 85 人 黑猩猩 相同 猴 1 狗 10 金枪鱼 21 酵母 44 细胞色素 c 进化树
名词解释 别构效应 (Allosteric effect) 镰刀状细胞贫血病 (Sickle-cell anemia)