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学校编码 :10384 密级 学号 :24520091152989 硕士学位论文 TNFAIP8 在胃癌中表达及临床意义 The Expression and Significance of TNFAIP8 in Gastric Cancer 指导教师姓名 : 闻 * 强 专业名称 : 外科学 论文提交日期 : 论文答辩日期 : 刘忠臣副教授 2012 年 4 月 2012 年 6 月 2012 年 4 月

厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果 本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和 厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 ( ) 课题 ( 组 ) 的研究成果, 获得 ( 资助, 在 ( ) 课题 ( 组 ) 经费或实验室的 ) 实验室完成 ( 请在以上括号内填写 课题或课题组负责人或实验室名称, 未有此项声明内容的, 可以不作特别声明 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

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摘要 摘要 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤 虽然胃癌发病的确切机制尚不完全清楚, 但环境因素 遗传因素等在胃癌的癌前病变及肿瘤发生发展过程中均起重要作 用, 尤其免疫调节异常 肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 8(Tumor necrosis factor-α induced protein-8, TNFAIP8,TIPE) 在细胞凋亡 信号传导 肿瘤细胞增生 侵袭及转移等过程中具有重要的调节作用 为了研究 TNFAIP8 在胃癌发生发展中的作用及机制, 本实验对胃癌病人手术切除的组织进行了 TNFAIP8 的表达检测, 构建了 TNFAIP8 过表达质粒, 以抗 DR5 单克隆抗体为刺激剂, 检测 TNFAIP8 过表达的人胃癌细胞系 BGC823 的凋亡及相关分子的变化 实验发现胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 的 mrna 水平和蛋白水平的表达量都与胃癌的分化和分期密切相关,TNFAIP8 在低分化和进展期胃癌中的表达明显高于中分化和早期胃癌 ; 通过流式细胞仪分析发现,TNFAIP8 过表达减少了胃癌细胞的凋亡, 延长了细胞周期的 S 期, 并且, 酶原 caspase 8 \ 9 \ 3 蛋白的表达无明显差异, 而活化 caspase8 \ 9 \ 3 蛋白的表达在转染 TNFAIP8 后明显减少, 提示过表达的 TNFAIP8 可能通过影响 caspase 的活性负性调控胃癌细胞的凋亡 以此, 我们认为 :TNFAIP8 可能参与了胃癌的发生 发展 关键词 : 胃癌 ; TNFAIP8; caspase I

Abstract Abstract Gastric cancer is the most common gastrointestinal malignancy. Although the precise pathogenesis of gastric cancer is remains unclear, environmental factors, genetic factors were central to the mechanism of gastric precancerous lesions and tumor development, Tumor necrosis factor-α induced protein- 8 ( TNFAIP8,TIPE) is a re-cently discovered antiapoptotic molecule. Recent data have demonstrated that TNFAIP8 is involved in the regulation of apoptosis, cellular signaling cascade andtumor proliferation. In order to study the role of immune mechanisms of TNFAIP8 in the devel opment of gastric cancer, first obtained clinical tissues from patients with gastri c cancer surgery: using immunohistochemical methods to detect the expression of TNFAIP8 in gastric carcinoma; Then constructed TNFAIP8 over-expression p lasmid;and then adopted anti-dr5 monoclonal antibody stimulate, detecting,casp ase and other protein. It was found that the mrna and protein level of TNFAIP8 expression in gastric cancer tumor tissue closely related to tumor differentiation and TNM stage, TNFAIP8 in poorly differentiated and advanced gastric cancer was significantly highe r than in the differentiation and early gastric cancer. After transfected BGC823 huma n gastric cancer cell lines, we found that caspase8/9/3 expresse significantly dif -ference before and after transfection, and have a certain impact on gastric can -cer cell apoptosis and cell cycle. Therefore, the expression of TNFAIP8 may play a important role in the process of development of gastric cancer and TNF -AIP8 may be involved in the gastric cancer development.so it is a new idea to provide to the further study of gastric cancer pathogenesis. Keywords:Gastric cancer;tnfaip8; caspase; II

目录 目录 摘 要... I ABSTRACT... III 第一章前言... 1 一胃癌的发病因素... 1 1 环境因素... 1 2 遗传因素... 2 3 免疫因素... 2 4 癌前期变化... 2 4.1 胃的癌前期状态... 2 4.2 胃的癌前期病变... 2 二胃癌的相关临床表现... 3 1 胃癌各期症状... 3 2 胃癌病人体征... 3 3 胃癌常见并发症... 4 三临床上常用的胃癌分型方法... 4 1 根据胃癌的发生部位分型... 4 2 根据具体形态分型... 4 2.1 早期胃癌... 4 2.2 中晚期胃癌... 4 3 根据胃癌组织分型... 5 3.1 根据组织结构分型 :... 5 3.2 根据组织发生方面分型 :... 5 四临床常用的胃癌分期方法... 5 1 UICC/TNM 分期法... 6 2 JGCA 分期法... 6 五胃癌的诊断 :... 7 III

目录 1 实验室检查... 7 2 X 线表现... 7 3 纤维内窥镜检查... 7 4 脱落细胞学检查... 7 5 B 超... 7 6 CT 检查... 7 7 胃癌的 X 线表现... 7 7.1 早期胃癌的 X 线表现... 7 7.2 中晚期胃癌的 X 线表现... 8 8 内镜检查... 8 8.1 早期胃癌... 8 8.2 中晚期胃癌... 8 9 胃液检查... 9 10 生物学与生物化学检查... 9 六胃癌的治疗... 9 1 手术治疗... 9 1.1 根治性切除术... 9 1.2 姑息性切除术... 10 1.3 短路手术... 10 2 放射治疗... 10 3 化学治疗... 11 4 中医治疗... 11 5 免疫治疗... 11 6 中药治疗... 11 6.1 具有较强的整体观念... 12 6.2 可以弥补手术治疗 放射治疗 化学治疗的不足... 12 6.3 不影响劳动能力... 12 6.4 副作用小... 12 七 TNFAIP8 家族的研究进展... 12 7.1 TNFAIP8 家族及成员... 13 7.2 TNFAIP8 的结构与组织分布... 13 7.3 TNFAIP8 的生物学功能... 14 IV

目录 7.4 TNFAIP8 与肿瘤... 16 八细胞凋亡... 17 8.1 细胞凋亡... 17 8.2 凋亡细胞变化... 18 8.3 细胞凋亡调控... 18 8.4 细胞凋亡机制... 19 8.5 细胞凋亡信号转导... 21 8.6 重要的凋亡调控基因... 22 九实验方案设计... 23 9.1 研究目的和意义... 23 9.2 研究内容... 23 第二章胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 的表达情况研究及临床分析... 24 一材料和方法... 24 1 材料... 24 1.1 实验标本收集... 24 1.2 主要试剂及耗材... 24 1.3 主要仪器及设备... 25 1.4 主要溶液的配制... 28 2 方法... 28 2.1 RT-PCR 法检测胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8mRNA 的表达情况.. 29 2.2 胃癌肿瘤组织中总蛋白的提取... 29 2.3 Western blo 方法测定胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 蛋白表达情况 30 2.4 免疫组织化学方法测定胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 定位情况... 31 2.5 统计学方法处理实验数据... 31 二结果与分析... 32 1 RT-PCR 方法检测胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 表达情况... 32 2 Western-blot 方法检测胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 蛋白表达... 32 3 免疫组织化学法检测胃癌患者肿瘤组织中 TNFAIP8 定位情况... 34 4 综合检测结果... 35 三讨论... 37 V

目录 第三章 TNFAIP8 过表达质粒的构建和分析鉴定... 38 一材料和方法... 38 1 材料... 38 1.1 TNFAIP8cDNA 酶切引物 质粒载体... 38 1.2 主要试剂及耗材... 38 1.3 主要仪器及设备... 39 1.4 主要溶液的配制... 40 2 方法... 41 2.1 转化... 41 2.2 pires2-egfp 质粒菌种的冻存与复苏... 42 2.3 载体质粒 pires2-egfp 提取... 42 2.4 质粒 pires2-egfp 酶切及回收... 43 2.5 TNFAIP8cDNA 扩增... 43 2.6 TNFAIP8 cdna 菌液 PCR 产物纯化回收... 44 2.7 TNFAIP8 cdna 菌液 PCR 扩增产物双酶切... 44 2.8 目的基因与载体的连接... 45 2.9 重组质粒的转化 鉴定及测序... 47 二结果与分析... 48 1 pires2-egfp 质粒图谱和酶切位点... 48 2 琼脂糖电泳鉴定 pires2-egfp 质粒双酶切产物... 48 3 TNFAIP8 cdna PCR 扩增... 49 4 TNFAIP8 cdna 菌液 PCR 扩增产物双酶切... 50 5 TNFAIP8 过表达重组质粒鉴定及测序... 51 三讨论... 52 第四章转染 TNFAIP8 过表达质粒的 BGC823 细胞与细胞凋亡 机制的探讨... 53 一材料和方法... 53 1 材料... 53 1.1 质粒 细胞株 抗 DR5 单克隆抗体... 53 1.2 主要试剂及耗材... 53 VI

目录 1.3 主要仪器及设备... 55 1.4 主要溶液的配制... 58 2 方法... 58 2.1 人肾上皮细胞系 293T 细胞培养... 58 2.2 人胃癌细胞系 BGC823 细胞培养... 59 2.3 293T/BGC823 细胞转染... 60 2.4 adr5mab 应用方案... 60 2.5 Westernblot 检测转染 TNFAIP8 过表达重组质粒 BGC823 细胞中 TNFAIP8 的表达... 62 2.6 RT-PCR 检测转染 TNFAIP8 过表达重组质粒 BGC823 细胞中 TNFAIP8mRNA 的表达... 64 2.7 Hoechse33342 染色检测 adr5mab 诱导的 BGC823 细胞凋亡... 64 2.8 MTT 检测转染 TNFAIP8 过表达重组质粒 BGC823 细胞的凋亡... 66 2.9 流式细胞仪检测转染 TNFAIP8 过表达重组质粒的 BGC823 细胞凋亡... 67 2.10 流式细胞仪检测转染 TNFAIP8 过表达重组质粒的 BGC823 细胞周期... 67 2.11 Westernblot 检测转染 TNFAIP8 过表达重组质粒 BGC823 细胞对 caspase 凋亡通路的影响... 69 二结果与分析... 69 1 293T/BGC823 细胞培养及转染... 70 2 转染重组质粒的 TNFAIP8 表达情况... 71 3 Hoechse33342 和 MTT 检测 adr5mab 诱导的 BGC823 细胞凋亡... 73 4 流式细胞仪检测过表达的 TNFAIP8 对 BGC823 细胞凋亡和周期的影响... 75 5 Westernblot 检测过表达的 TNFAIP8 对 caspase 凋亡通路的影响... 77 三讨论... 79 总结... 81 参考文献... 86 致谢... 87 VII

Contents Contents ABSTRACT... III CHAPTER I INTRODUCTION... 1 I ETIOLOGY OF GASTRIC CANCER... 1 1 Environmental factors... 1 2 Hereditary factors... 2 3 Immunity factors... 2 4 Precancerous lesion... 2 4.1 Precancerous conditions... 2 4.2 Precancerous lesions... 2 II CLINICAL MANIFESTATIONS OF GASTRIC CANCER... 3 1 Symptoms... 3 2 Physical examinations... 3 3 Common complications... 4 III CLINICAL TYPING OF GASTRIC CANCER... 4 1 Locations... 4 2 Figures... 4 2.1 Early stage... 4 2.2 Advanced stage... 4 3 Tissue typing... 5 3.1 Tissue structure... 5 3.2 Tissue originate... 5 Ⅳ CLINICAL STAGING OF GASTRIC CANCER... 5 1 UICC/TNM... 6 2 JGCA... 6 Ⅴ DIAGNOSIS OF GASTRIC CANCER... 7 1 Laboratory examination... 7 2 X-ray... 7 3 Fiber endoscopy... 7 4 Cytology examination... 7 5 Type-B ultrasonic... 7 6 CT... 7 VIII

Contents 7 Results of X-ray... 7 7.1 Early stage... 7 7.2 Advanced stage... 8 8 Fiber endoscopy... 8 8.1 Early stage... 8 8.2 Advenced stage... 8 9 Gastric juice examination... 9 10 Biologic and biochemical examination... 9 Ⅵ TREATMENT OF GASTRIC CANCER... 9 1 Operation... 9 1.1 Radical operation... 9 1.2 Palliative operation... 10 1.3 By-pass operation... 10 2 Radiation therapy... 10 3 Chemiotherapy... 11 4 Chinese traditional therapy... 11 5 Immunotherapy... 11 6 Traditional Chinese medicine therapy... 11 6.1 More concept of wholism... 12 6.2 Cover the shortage of other treatments... 12 6.3 No influence of labor capacity... 12 6.4 Less side effect... 12 Ⅶ ADVANCES IN TNFAIP8 FAMILY... 12 7.1 TNFAIP8 family and its members... 13 7.2 TNFAIP8 structure and tissue distribution... 13 7.3 The biological function of TNFAIP8... 14 7.4 TNFAIP8 and tumor... 16 Ⅷ APOPTOSIS... 17 8.1 Apoptosis... 18 8.2 Apoptotic cells change... 18 8.3 Regulation of apoptosis... 19 8.4 Mechanism of apoptosis... 21 IX

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