TRIPLEX BIOSCIENCES 2011 年 1 月总第 12 期 XIBAO YU FENZI ZHENDUAN 细胞与分子诊断 CELLULAR AND MOLECULAR DIAGNOSIS 泰普生物科学 ( 中国 ) 有限公司 TRIPLEX INTERNATIONAL BIOSCIENCES(CHINA) CO.,LTD.
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细胞与分子诊断 Cellular & Molecular Diagnosis 双月刊 2011 年 1 月总第 12 期 主办单位 : 泰普生物科学 ( 中国 ) 有限公司 主编 : 苏珍霞梁嘉祺乔楠陈丽娇主审 : 谢佐福电子邮箱 :xbyfzzd@126.com 细胞与分子诊断 是泰普生物科学 ( 中国 ) 有限公司主办的学术期刊 本刊以广大病理医师 检验医师 基础医学工作者和各临床科室医师等为服务对象, 介绍分子病理诊断的进展, 反映细胞分子诊断的新技术 新理念, 具有很强的指导性, 搭建良好的学术交流和技术探讨的平台 本刊现为双月刊, 主要栏目有综述 论著 技术与产品 细胞与分子诊断最新进展 国外文献摘要等 希望大家多提意见和建议, 踊跃赐稿 欢迎述评 综述 论著 文摘 技术与方法 讲座和国内外研究动态等稿件, 在正式刊物发表前的文章也欢迎 来稿要求 : 1 文稿具有科学性 资料可靠, 数据准确, 文字精炼 2 综述 论著 讲座等一般不超过 5000 字, 文摘不超过 2000 字 3 综述和论著内的摘要 关键词 图表 统计学符号等参照 中华病理学杂志 稿约规定 4 来稿文责自负 请自留底稿, 未采用的稿件一般不退还作者 来稿 3 个月内决定是否采用文稿, 一经采用, 酌致稿酬 5 来稿欢迎以电子邮件的形式发送至 :xbyfzzd@126.com, 或请寄挂号信 : 福建省福州市金山金洲北路 7 号金山科技企业孵化器 7 号楼四层 细胞与分子诊断 编辑部收 ( 邮编 : 350002) 目录 全文翻译 结核病和利福平耐药的快速分子检测 2 Boehme CC,Nabeta P,Hillemann D,et al. 前沿进展 国内外细胞与分子诊断最新进展 11 国外期刊文摘 LKB1 基因在人类肺癌细胞中上皮间质转化 ( EMT) 的作用 16 晚期上皮性卵巢癌潜在的预后生物标记物 颗粒蛋白前体 16
2 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 结核病和利福平耐药的快速分子检测 全文翻译 Catharina C. Boehme, M.D., Pamela Nabeta, M.D., Doris Hillemann, Ph.D., Mark P. Nicol, Ph.D., Shubhada Shenai, Ph.D., Fiorella Krapp, M.D., Jenny Allen, B.Tech., Rasim Tahirli, M.D., Robert Blakemore, B.S.,Roxana Rustomjee, M.D., Ph.D., Ana Milovic, M.S., Martin Jones, Ph.D., Sean M. O Brien, Ph.D.,David H. Persing, M.D., Ph.D., Sabine Ruesch-Gerdes, M.D., Eduardo Gotuzzo, M.D., Camilla Rodrigues, M.D.,David Alland, M.D., and Mark D. Perkins, M.D. 摘要 背景全球结核病的控制工作因慢且不敏感的诊断方法而受到阻碍, 尤其在具有耐药性和有人类免疫缺陷病毒感染的病人中的检测 早期检出结核病对降低死亡率和阻断传播至关重要, 但敏感方法的复杂性和对基础设施的需求, 限制了其可及性和效果 方法 Xpert MTB/RIF 是一种检测结核分枝杆菌 (MTB) 和利福平耐药性 (RIF) 的自动化分子检测系统 我们利用此检测系统, 对 1730 例有疑似药物敏感性或多重耐药肺结核的病人采用全集成样本处理, 进而对检测结果进行评估 在秘鲁 阿塞拜疆 南非和印度, 符合研究条件的病人每人提供 3 份痰标本 其中,2 份标本用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸和氢氧化钠处理后进行显微镜检查 固体和液体培养, 以及 MTB/RIF 检测,1 份标本直接用显微镜检查和 MTB/RIF 检测 结果在培养阳性的病人中,1 次直接 MTB/RIF 检测检出了 561 例涂片阳性结核病患者中的 551 例 (98.2%), 以及 171 例涂片阴性结核病患者中的 124 例 (72.5%) 该试验对 609 例没有结核病患者中的 604 例是特异的 (99.2%) 在涂片阴性 培养阳性的结核病患者中, 加作第 2 次 MTB/RIF 试验, 可使敏感性提高 12.6 个百分点, 加作第 3 次试验可提高 5.1 个百分点, 而总的敏感性可增至 90.2% 与药敏分型检测相比,MTB/RIF 检测正确地识别出了 205 例有利福平耐药菌 ( 感染 ) 患者中的 200 例 (97.6%), 以及 514 例有利福平敏感菌 ( 感染 ) 患者中的 504 例 (98.1%) 除了 2 个病例以外, 其他病例的测序结果都验证了 MTB/RIF 检测的结果 结论 MTB/RIF 检测可在不足 2 小时的时间内, 在使用很少的手动时间的情况下, 直接从对未经预处理的痰液中灵敏检测出患者是否有结核病和利福平耐药性 据估计, 全球每年有 50 万多重耐药性结核病患者和 137 万同时感染结核病和 HIV 病毒的患者, 但是只有一小部分有机会获得充分的敏感病例检测或药物敏感性检测 由于涂片检测的假阴性结果导致携带 HIV 病毒的结核病的诊断延误事件也经常发生 患者由于未得到及时快速诊断并进行有效的治疗, 导致死亡率上升, 且加剧了继发抗药性 ( 包括广泛耐药性 ) 和持续感染 结核病和多重耐药结核病的检测方法主要有结核菌培养法和 PCR 技术, 但由于其操作的复杂性及对相关设备的需求, 限制了这些方法在参考实验室的应用 为满足高负担国家在疾病治疗方面对简单 且快速的检测工具的迫切需求, 一系列的结核病和耐药性全自动分子检测技术研究在一些公共或个人实验室联合展开 一种叫做 Xpert MTB/RIF 的自动检测结核杆菌 (MTB) 和利福平耐药性 (RIF) 的分子检测系统, 利用半巢式实时 PCR 技术扩增 rpob 基因上的一段 MTR 特异序列, 该序列有被分子标记的探针, 可检测利福平耐药基因的决定区 该检测是在 MTB/RIF 检测平台 (GeneXpert,Cepheid) 上进行的, 该平台把样品处理和 PCR 整合在一个一次性的塑料盒里, 包含细菌裂解 核酸提取 扩增和扩增检测所需的所有试剂 唯一需要手动操作的步骤是在移取一定体积至测试盒
细胞与分子诊断,2011 年 1 月, 总第 12 期之前往痰液中添加灭菌缓冲液 然后将 MTB/RIF 测试盒插入到 GeneXpert 装置中,2 小时之内便可得到结果 根据诊断准确性评估有关设计和实施的相关要求, 我们进行了多中心的 前瞻性的 MTB/RIF 评估, 并与现有的最佳参考标准进行比较, 以确定其在预期目标人群中的敏感性和特异性 方法研究人群 从 2008 年 7 月至 2009 年 3 月, 我们在秘鲁的利马 阿塞拜疆的巴库 南非的开普敦和德班 印度的孟买进行了五个试点研究 我们先后汇总了多名患有结核病或多重耐药结核病症状的成年人, 每人采集不少于 1.5mL 的痰标本 3 份 要求所选的患肺结核病患者在过去 60 天内未进行过任何结核病治疗, 而所选的多重耐药结核病患者则可包括受过结核病治疗的患者 正在接受治疗时不配合治疗的, 或与有多重耐药结核病症状的患者有直接接触的 所有患者均从肺结核 HIV 协同感染和多重耐药结核病流行且具有多样性的地区中筛选 ( 有关测试点的详细信息, 可查阅本文在 NEJM 网站的附录 ) 该研究方案通过了 8 个部级的公共审查机构或技术委员会的审查和批准 研究严格根据研究方案 (NEJM 中可查 ) 进行, 并获得了所有患者的书面同意 研究的介入没有改变病人的护理标准 研究设计和监督这项研究是由其发起者, 即瑞士创新诊断学基金会 (FIND) 设计和监督的 此外, 还得到了国家卫生研究院 Cepheid 公司和比尔 - 梅林达盖茨基金会的大力支持 数据收集由每个研究地点的研究者来进行, 然后由一个没有参与数据收集的统计学家进行数据统计分析, 最后由 FIND 的研究者起草论文初稿 所有研究者 3 均保证报道的数据的准确性和完整性 实验方法符合临床研究标准的病人被要求在 2 天内提供 3 份痰标本 (2 份点样本,1 份早上收集的样品 )( 图 1) 随机地从 3 份标本中挑选 2 份, 先用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸和氢氧化钠 ( NALC- NaOH) 处理, 离心后用 1.5mL 的磷酸缓冲液重悬, 通过 Ziehl-Neelsen 染色进行显微镜检查 固体 (LJ 培养基或 7H11 培养基 ) 和液体 ( 细菌生长指示管 960,BD 微生物系统 ) 培养以及 MTB/RIF 检测 第 3 份标本不进行 NALC- NaOH 处理,Ziehl-Neelsen 染色后直接在显微镜下检查和 MTB/RIF 检测 从每份标本中挑选第 1 份阳性培养物, 用 MPT64 抗原检测 (Capilia TB,Tauns 实验室 ) 判断结核杆菌的种属, 并用 LJ 培养基 ( 在利马 德班和巴库 ) 或 MGIT SIRE 培养基 ( 在开普敦和孟买 ) 按一定的比例培养, 间接测试培养物的药物敏感性 在 3 个试点, 第 1 份标本先用 NALC-NaOH 处理 离心 提取 DNA, 再依据产品使用说明, 用 COBAS AMPLICOR MTB 试剂盒 ( 罗氏 )( 在开普敦和孟买 ) 或 ProbeTec ET MTB 合成物直接检测试剂盒 (BD)( 在巴库 ) 对提取的 DNA 进行传统的核酸扩增 在另外 3 个试点, 根据 Genotype MTBDRplus 试剂盒 ( 线性探针反向杂交法 ) (Hain 生物科学 ) 的使用说明操作, 对培养分离物 ( 在巴库 ) 或第二份痰标本经 NALC- NaOH 处理后的沉淀物 ( 在开普敦和德班 ) 进行耐药基因分型试验, 其中包括涂片阴性的标本 所有参与研究的实验室均为有质量保证的参考实验室 5 个测试试点中, 有 4 个试点的研究实验室均位于临床诊所的 5km 范围内, 且采集的标本均在 2 天内进行检测 从巴库采集的痰标本被运送到位于 Borstel 的德国国家参考实验
4 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 图 1
细胞与分子诊断,2011 年 1 月, 总第 12 期室, 并在 1-5 天内进行检测 如果涂片和培养呈阴性, 但 MTB/RIF 检测或 PCR 检测呈阳性的病人, 或从中央数据库挑选的作为随机对照随访的病人, 则重复进行结核病分析 ( 涂片 培养 MTB/RIF 检测 X 射线造影 临床数据建立 ) 对常规实验室结果和由 3 位当地临床医生组成的临床审查委员会的临床报告进行重复分析, 最终确诊 HIV 检测结果通过汇总临床记录获得, 但仅是从一小部分病人中获得的 参与分子检测和参照检测的研究人员对其他的检测结果一概不知, 从而使偏差降到最低 MTB/RIF 检测的数据通过软件来判读, 与使用者无关 临床人员和审查委员会也无权知道核酸检测结果 所有研究人员均收到了随访病人的清单, 但并不知道随访原因 分析类别病人被分为四个类别进行分析 : 涂片和培养均呈阳性的结核病病人 ; 涂片阴性, 培养阳性的结核病病人 ; 未经过治疗但有所改善, 检查不到结核病细菌学特征的病人 ( 无结核病 ); 涂片和培养均呈阴性, 但经临床和 X 射线检测, 被认为是结核病病人 ( 临床结核患者 ) 涂片阳性的病例至少需要两张涂片( 当每 100 个镜检视野范围内可检出 1-10 个耐酸杆菌时 ) 来确定, 或者通过一张涂片甚至更多涂片 ( 当每 100 个镜检视野范围内可检出 10-99 个耐酸杆菌时 ) 来确定 培养阳性的病例需要通过至少有 1/4 培养物呈阳性结果来确定 由于需要一个明确的确诊结果, 将以下这些诊断结果不确定的病人排除 : 接受了结核病治疗 培养阴性 ( 疑似多重耐药结核病 ), 至少有 1/4 培养物被污染, 仅有非结核杆菌生长, 利福平敏感性分型不确定, 痰液涂片阳性培养呈阴性, 培养物疑似交叉感染 ( 如仅有 1/4 培养物在 MGIT 培养基培养 28 天后才呈阳性结果, 或在 LJ 培养基中培养后菌落数少于 20 个 ), 病人死亡, 或者随访失败 5 MTB/RIF 检测 MTB/RIF 检测按照先前描述的方法进行 ( 图 2) 2 位研究人员均经过操作训练, 并通过了 4 次熟练测试 样本反应物分别按照 2:1 和 3:1 的比例加入到未经处理和净化处理的痰中 加入的样本反应物的量应满足测定分析所需的量 将密封的痰杯在室温下用手振荡 2 次 (15 分钟内 ), 然后分别移取 2mL 灭活的样本到测试盒中 ( 相当于 0.7mL 未经处理的痰液和 0.5mL 净化处理的痰液 ) 之后, 将测试盒插入到位于镜检室或多功能实验室的检测平台, 电子测试结果由 MTB/RIF 测试系统直接传送至中央数据库 测序对所有利福平抗性以及测试结果不一致的分离培养物针对利福平耐药基因 rpob 的 81-bp 核区进行双向测序, 其正向引物为 CGTGGAGGCGATCACACCGCAGAC, 反向引物为 AGCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT 整个过程在 3130xl 遗传分析仪 ( Applied Biosystems) 上运行, 使用 BigDye 终止子循环测序试剂盒 序列分析使用 ABI 序列分析软件 (version 5.2.0) 统计分析通过 1 次对痰液的直接检测,1 次对经处理后的沉淀样本检测,2 次检测结果相加 (1 次直接,1 次沉淀样本 ),3 次检测结果相加 (1 次直接,2 次沉淀样本 ), 来检测 MTB/RIF 的敏感性和特异性 如果组合里至少有一个检测结果是阳性的, 则认为该组结果是阳性的 无效 错误 和 无结果 的次数除以总数即为不确定结果的比例 当结果不确定, 而样本充足, 则进行一次重复, 并将第二次的结果用于分析 为了分析 1 次直接检测结果和 3 次相加结果, 还采用威尔逊二项式法来计算 95% 的置信区间 对于所有其它病人的 MTB/RI 检测结
6 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 图 2 MTB/RIF 测试分析过程 将样本处理液 ( 痰液样本体积的 2 倍 ) 加入痰液样本中振荡摇匀, 室温放置 15 分钟, 之后再振荡, 移取 2-3mL 样本到测试盒, 然后放入测试装置中, 所有的后续步骤为全自动的, 使用者可直接得到打 印结果, 如 MTB 检出,RIF 抗性未被检测到 PCR 为聚合酶链式反应的缩写 果, 以及对照测试结果, 采用广义估算方程来计算置信区间, 用以说明病人的聚类关系 结果病人 在 1462 例患者 (4386 份标本 ) 中, 涂片和培养阳性结核病患者 567 例 (38.8%), 涂片阴性 培养阳性结核病患者 174 例 (11.9%), 临床确诊的结核病患者 105 例 (7.2%), 无临床症状的结核病患者 616 例 (42.1%)( 表 1) 在 741 例培养阳性的患者中, 有 207 例 (27.9%) 在常规药物敏感性检测中表现为多 重耐药性 有 113 例患者由于提供样本数目 (103 例 ) 或体积 (10 例 ) 不足, 故检测结果被排除 还有 268 例患者由于各种原因也没有进行分析, 其中包括 115 例培养阴性, 但因疑似多重耐药而正接受治疗的 ( 图 1) 敏感性和特异性病例检测培养阳性的结核病患者中,MTB/RIF 检测的综合敏感性为 97.6% 涂片和培养阳性的敏感性为 99.8%, 涂片阴性 培养阳性的敏感性为 90.2%, 各个试点的综合敏感性没有显著的
HIV指人体免疫缺陷病毒 LJ指Löwenstein Jensen培养基 MGIT指分歧杆菌生长指示培养基 细胞与分子诊断 2011年1月 总第12期 7
8 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 对每名患者进行 3 次 MTB/RIF 检测 (2 次检测沉淀物,1 次直接检测 ), 得出的各试点专一特征如图 所得到的敏感性与结核病疑似患者和多重耐药性结核病疑似患者相比, 没有显著差异 (P=0.96) ( 详见表 3) 有 105 名样本培养阴性的患者, 已根据临床症状进行了结核病治疗,29.3% 的 MTB/RIF 检测显示阳性结果 ( 无数据 ), 在本研究中未进行深入研究 差异 (P=0.24, 卡方测试 )( 表 2) 每名患者的多个痰样本检测得到的综合敏感性与一次直接测定痰液得到的结果有一定差异 对于培养阳性的结核病, 一次直接的 MTB/RIF 测试, 其敏感性为 92.2%, 加作一次沉淀样本检测, 敏感性上升至 96.0% 对于涂片阴性 培养阳性的结核病患者, 一次检测的敏感性为 72.5%, 两次为 85.1%, 三次为 90.2% 通过 MTB/RIF 单一 直接检测鉴别的培养阳性患者所占的比例, 比在 LJ 培养基上培养的结果高 ( 附件中的表 1) 在 HIV 阳性的结核病患者中,MTB/RIF 测定的敏感性为 93.9%,HIV 阴性 的敏感性为 98.4%(P=0.02) 未经处理和经净化处理的痰样本检测得到的敏感性差异不大 (P=0.16) 一次直接的 MTB/RIF 检测的特异性大约为 72.5%, 二次为 85.1%, 三次为 90.2% 在各个试点对痰标本中萃取的 DNA 进行选择性 PCR 反应, 得到的 MTB/RIF 检测敏感性比通过 Amplicor 试剂盒检测的结果 ( 94.6% vs. 86.8%,P<0.01) 来得高, 与 ProbeTec 试剂盒检测的结果 (83.7% vs. 83.9%,P=0.96) 相似 MTB/RIF 检测的特异性和 Amplicor ProbeTec 试剂盒检测的结果无明显差异 ( 附件
细胞与分子诊断,2011 年 1 月, 总第 12 期 9 多重耐药性是指具利福平和异烟肼抗性 在 723 例培养阳性的样本中, 有 720 例进行利福平抗性分析, 其余 3 例因 MTB/RIF 检测结果不能确定而被排除 通过对 15 个表型差异样本进行测序分析, 发现有 9 株菌株 rpob 突变, 且在药物敏感性检测上鉴定为具有利福平易感性 有 1 株菌株存在野生型基因, 差异分析发现有 3 株菌株发生交叉感染 对其中 2 株进行测序, 得出 :1 株发生 516 GTC 密码子突变,1 株发生 531 TTG 密码子突变 中的表 2) 多重耐药性检测利用 MTB/RIF 检测利福平和多重耐药性 ( 抗利福平和异烟肼 ), 得到的敏感性和特异性如表 3 所示 MTB/RIF 检测结果显示,718 名患者中有 15 名与表型检测结果不符 测序结果表明 9 株在药物敏感性检测上鉴定为具有利福平敏感性的菌株的耐药相关基因 rpob 发生突变 ; 一株菌株存在野生型基因 ; 在相同的培养条件下野生型菌株和突变菌株交叉感染的患者 3 名 考虑测序结果,MTB/RIF 检测正确地检测出 211 名患者中有 209 名具有利福平抗性 ( 敏感性 99.1%), 所有的 506 名患者均具有利福平易感性 ( 特异性 100%) 本研究中发现的 rpob 突变体在全球范围内具有代表性 :16 种不同的突变体已经被鉴定, 这只是个有限的数字, 几乎所有的抗性菌株都含有 516 526 和 531 密码 对于南非采集的样本, 我们直接用 Genotype MTBDRplus 试剂盒进行检测, 然后与 MTB/RIF 检测进行特征比较 在涂片阳性的痰标本中, 该试剂盒检测到的敏感性与 MTB/RIF 检测相似 但是, 在涂片阴性 培养阳性的患者标本中, 该试剂盒从 67 例样本中检测出 37 例假阴性结果 (55.2%) 在 115 例培养阴性 疑似多重耐药性并正接受治疗的结核病患者 ( 以及那些没有参与主要分析的患者 ) 中,51 例 MTB/RIF 检测呈阳性, 8 例检测出具有利福平抗性 我们观察到这 8 例患者在治疗失败后接受了二线治疗, 而医生并不清楚其 MTB/RIF 检测结果 作为对照, 我们从 MTB/RIF 检测呈阳性的患者中随机挑选 8 例, 并让其接受二线治疗, 但却都检测不到利福平抗性 虽然当前 MTB/RIF 被推荐用于疑似结核病 未经过治疗患者的检测中, 我们的数据显示, 对于接受过治疗 甚至经培养转化后的患者, 也可用该方法检测其多重耐药性 不确定率在 5190 例 MTB/RIF 检测中, 有 192 例 (3.7%) 是不确定的, 而用 MGIT 和 LJ 培养基培养,6920 例中有 381 例 (5.5%) 受污染, 前者的比率比后者低 (P<0.001) 再进行一次重复测试, 不确定率降至 1.2%(63/5190) 经过 139 次重复后, 有效的结果达 129 次
10 (92.8%) 没有一个患者在所有样本检测中都得到不确定结果 在 2072 例阳性结果的样本中共有 20 例 (1.0%) 不确定是否具有利福平抗性 这些不确定结果均发生于涂片阴性 培养阳性的痰样本中, 这些样本在 MTB/RIF 检测时需要经过很多次循环 (35-37 个循环 ) 通过更改系统, 允许对结果进行 40 个循环分析, 使 20 个不确定的结果中排除掉 19 个, 而不会影响该方法的特异性 讨论 本研究中设计的测定法, 可供低收入国家的医疗点用于准确检测肺结核并筛选利福平抗性患者 对符合本研究选择标准的患者, 该测定法鉴定了 97% 以上的通过培养法确诊的病例, 其中包括了 90% 以上涂片阴性的病例 在不同试点的试验, 病例检测和利福平抗性差异都是相似的, 调查结果表明这些发现有可能被广泛应用 鉴于涂片镜检对于感染 HIV 患者肺结核诊断的敏感性低, 在南非 HIV 感染率达 60-80% 的两个试点, 使用具有更高敏感性的 MTB/RIF 检测是很有必要的, 特别是对于那些涂片阴性的结核病患者 但是, 这项研究结果还不能广泛用于改善结核病患者的护理, 主要有以下几个原因 : 其一, 该研究中需要用到一些参考设备, 由于实验条件的变化 ( 如温度 电压等 ), 以及培训方式不同, 我们不确定该方法能否适用于镜检中心 卫生机构或其他医疗点的设备 但是, 在研究过程中收集的定性调查表表明, 无任何分子实验经验的人经 2-3 天持续的技术培训后便可作为技术员 ( 与经 2 个星期 Ziehl Neelsen 镜检培训的人做比较 ) MTB/RIF 检测操作简单, 且手动操作时间低于 15 分钟, 读数清晰有效, 具有一定的优势 然而它需要每年校准一 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 次, 在一些偏远的实验室很难做到, 特别是在农村 不过, 已在进行中的一些大规模项目证明了 MTB/RIF 检测的可行性和有效性 其二, 为简化操作,MTB/RIF 检测采用了复杂的技术, 使得价格昂贵 尽管 FIND 已商议对低收入国家公共部门的项目让价, 并正努力进一步降低检测成本, 但仪器设备和试验的投入远远比镜检来得高, 而很多国家当前的卫生保健设备还仅局限于镜检 不过,MTB/RIF 检测本身的成本远远比培养和药敏检测来得低 在全球范围内, 无效的结核病检测, 多重耐药性的增强和广泛耐药性患者剧增, 导致该病流行的国家的培养和药敏检测急剧膨胀 然而, 除少数参考中心外, 基础设施和参加过培训的人员远远不够, 且检测结果往往要 4 个月以后才能得到, 这大大降低了临床应用能力 标准 PCR 测试的复杂性又阻碍了其发展 MTB/RIF 检测使用自动 DNA 提取 扩增和检测技术, 并且在一个密闭的测试盒内进行, 有效地避免了污染 样本的处理简化为一非精密步骤, 即对痰液进行溶解和灭活, 使痰液里有活性的结核杆菌降至 6-8 个, 不需要用到生物安全柜 最近一项研究数据显示,MTB/RIF 检测不会产生传染性悬浮微粒, 该方法具备简单 安全的特点, 可用于参考中心外要求高性能 低成本和高敏感性的结核病和药物抗性的检测, 提高了检测可行性, 减少结核病诊断的时间延误, 而且不需要建立大量配备有先进 具生物安全设施的实验室 参考文献 ( 略 ) [ Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance.The New England Journal of Medicine.2010, 363(11):1070-1.]
细胞与分子诊断,2011 年 1 月, 总第 12 期 国内外细胞与分子诊断最新进展 11 前沿进展 第四代 HIV-1p24 抗原抗体检测试剂盒研制取得重要进展由中科院武汉病毒研究所 HIV 分子流行病学和分子病毒学学科组与单抗实验室共同合作, 经过三年的不断实验和反复研究, 已研制出了适于我国流行 HIV 毒株检测的第四代 HIV- 1p24 抗原抗体检测试剂盒 第四代 HIV-1p24 抗原抗体检测试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法, 不仅具有很好的灵敏性和特异性, 而且成本较低, 操作简单快速 中国药品生物制品鉴定所以现在国内使用的进口试剂盒作参比, 对本试剂盒所进行的临床评价鉴定结果称 : 考核试剂和参比试剂具有较高的一致性, 考核试剂特异性及敏感性较好, 能准确检测出我国主要流行的 HIV-1 病毒株的感染, 并能检测出 HIV-1 窗口期的感染 BBI 阳转血清盘的检测结果提示 : 考核试剂检测 HIV-1 早期感染的能力略强于参比试剂 ; 病毒培养物的检测结果提示, 考核试剂检测 P24 抗原的能力高于参比试剂 目前, 武汉病毒研究所与珠海一家公司合作, 已正式向国家药监局提交了 人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒 ( 酶联免疫法 ) 批准文号的申请 ( 武汉病毒研究所 ) 研究发现某些基因变异影响乳腺癌患病风险有研究曾发现, 与乳腺癌有关的基因 BRCA1 发生变异会显著提高女性患乳腺癌的风险 由美国梅奥诊所领导的一个国际科研小组在 9 月份的英国学术刊物 自然 遗传学 上报告说, 当 BRCA1 基因发生变异使女性患乳腺癌的风险提高时, 另外 5 个基因的变异会对这一风险产生影响 研究人员进行的全基因组关联分析涉及 11 个国家的 20 个研究中心 第一组研究对象是 1193 名携带 BRCA1 变异基因且患有浸润性乳腺癌的 40 岁以下妇女 研究人员分析了上述妇女基因组中总共约 55 万个基因变异, 然后将这些变异与第二组研究对象的全部基因变异进行对比分析 后者的总人数为 1190 名, 她们都是携带 BRCA1 变异基因却没有患乳腺癌的同龄妇女 随后, 研究人员将基因分析的范围缩小到 96 个单核苷酸多态性 (SNP), 并在两个更大的样本中进行了类似对比 结果发现, 位于 19p13 染色体某区域的 5 个基因的变异, 与携带 BRCA1 变异基因的妇女患乳腺癌的几率密切相关 报告主要撰稿人 梅奥诊所研究人员弗格斯 库奇博士说, 这一研究成果将有助于科研人员加深理解乳腺癌的最初病因, 并确定在那些携带 BRCA1 变异基因的妇女中, 哪些人更容易患乳腺癌 ( 新华网 ) 台研发出登革热检测试剂与抗体据台湾 中广新闻 报道, 台湾南部登革热疫情今年特别严重, 目前治疗只能针对个别症状下手, 对此, 中研院 研发出检测试剂与登革热四型综合性抗体, 未来透过试剂快速检测出患者登革热的型别, 然后利用治疗性抗体予以对症下药, 阻止病毒感染, 有助于日后治疗并预防登革出血热的发生 每年夏季, 台湾南部 东南亚地区都饱受登革热疫情困扰, 最担心就是发生登革出血热病状, 对此, 中研院 研发出登革热治疗蛋白质药物与检测试剂, 四型登革热病毒都具备 结合性好, 快速试剂未来可协助患者快速分辨病毒型别, 检验时间可以从四小时缩短到
12 半小时以内, 一方面可抢快, 然后给予研究团队开发的治疗性抗体, 以防有漏网之鱼, 可让治疗更有效 中研院 细胞与个体生物学研究所研究员吴汉忠说 : 当发烧抽血检验有登革病毒, 为了阻止变成出血性登革热 登革出血热的时候, 我们这时候可以施打治疗性抗体, 它可以阻止登革热病毒继续感染细胞, 这样一来, 可以减缓甚至治疗效果 研究团队指出, 这项治疗性抗体在活体外的保护是可以将近百分百阻止病毒感染, 比起目前发表最好的单株抗体强三倍, 另外在动物试验目前对动物保护存活率, 也有比较强的防御力, 现阶段研究已经进入动物实验阶段, 未来研究成果, 可应用在登革热检测试剂的研发 对抗第二型登革热病毒的治疗性抗体, 治疗或预防登革出血热的发生 ( 中新网 ) 可控制癌症基因开关的分子首次合成为了阻止肿瘤生长蔓延, 科学家们不断从各个途径不懈努力 美国科学促进会 英国 自然 杂志网站 9 月底报道, 美国达那 法博癌症研究所一个国际联合研究小组研制了一种分子, 能让控制癌症的基因指令失效, 从根本上抑制了癌症肿瘤的生长 他们研究的是一种罕见却极具侵袭性的癌症, 即儿童与青年睾丸核蛋白中线癌 (NM C), 这是一种完全由基因特征来定义的疾病 BRD4-NUT 基因易位 NMC 癌症是由染色体 换位 引起, 两个来自不同染色体的基因连接在一起, 这种异常的合并蛋白称为 BRD4-NUT 细胞中的基因指令就像是一种 书签, 染色质基板上的表观基因为 书写 蛋白, 另一组表观基因好比橡皮擦, 称为 抹擦 蛋白, 能清除书签 而第三种表观基因蛋白, 是一种能 阅读 指令 书签 的蛋白, 从而控制基因开关, 这正是研究人员瞄准的目标 结果, 有一种组合分子做到了这一点, 研 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 究人员将其命名为 JQ1 这种组装分子是一套组装起来的 表观基因组, 能影响细胞的多层机制, 从而控制基因行为 它兼具两种功能 : 一是锁住 NMC 癌细胞中的异常蛋白, 二是让它们停止分化复制, 忘记 自己癌细胞的身份, 逐渐恢复成正常细胞的样子 他们从病人身上移植了 NMC 癌细胞到实验室小鼠身上, 并给一些小鼠使用了 JQ1 分子 布雷德纳说, 效果非常明显, 所有接受了 JQ1 分子治疗的小鼠都活了下来, 而没用 JQ1 的都死了 目前, 该团队正在扭转分子形状, 以发挥其最大功效 ( 科技日报 ) 科技创新奖铜奖 : 低价致病基因检测技术创立仅三年时间的硅谷新秀 Counsyl Inc. 以其低成本的基因测试技术获得科技创新奖 (Innovation Award) 铜奖, 该技术能够检测出准父母可能携带的导致下一代患遗传疾病的基因 Counsyl Inc. 开发的基因测试技术只需采集唾液样本, 检测成本仅 350 美元左右 科技创新奖评委 合资公司 Lux Capital 的特约合伙人博克 (Larry Bock) 说,Counsyl 的技术对有生育携带家族疾病婴儿风险的家庭的生活质量会有很大的影响, 该技术结合了之前已存的功能, 但更高级, 应用更广泛, 也更经济 据介绍, 该公司使用一种特制的微阵列 一种可同时检测多种基因变异的实验室芯片 和一种精密的统计软件来追踪基因中致病的变异 该公司说, 对于覆盖范围内的疾病, 该检测至少与一般的单一疾病测试一样精确 全民孕前基因筛查的支持者大胆地声称 : 如果这些检测被广泛推广, 将会大幅减少 甚至有可能消除遗传疾病 父母如果发现他们携带的基因可能导致他们的孩子有患这些疾病的风险, 可以选择其他方法, 例如领养或人工授
细胞与分子诊断,2011 年 1 月, 总第 12 期精 大范围的基因检测还将减少婴儿死亡率, 20% 到 30% 的婴儿均死于基因疾病 ( 华尔街日报 ) 日本发现一种免疫细胞可从癌细胞内将其杀灭日本林原生物化学研究所近日宣布, 其研究者培育的一种免疫细胞, 能进入癌细胞并从内部将它们杀死 这是一种与外部进攻癌细胞完全不同的机制, 有望用于新的抗癌疗法 能如此杀死癌细胞的是一种名为 HOZOT 的免疫细胞, 由研究人员在 2006 年通过培养脐带血中的白细胞制作而成 该研究所首席研究员竹内诚人和同事在试管实验时发现, HOZOT 细胞会选择癌细胞并入侵, 而不会进入正常细胞 将 HOZOT 细胞与人的乳腺癌 胃癌和大肠癌细胞混合在一起后, HOZOT 细胞就会向癌细胞移动, 附着在癌细胞上, 接着整个 HOZOT 细胞都会侵入癌细胞 在接下来的约 2 至 4 小时里, HOZOT 细胞会逐渐杀死癌细胞 研究人员认为, 是 HOZOT 细胞携带的杀癌蛋白质在癌细胞内部扩散, 破坏了癌细胞的结构, 进而导致其死亡 竹内诚人指出 : 这是一种如同特洛伊木马一样潜入对手内部并杀死对手的方式 希望今后利用癌症患者的血液, 培育出与 HOZOT 细胞拥有同样功能的细胞, 用于治疗 对于化疗药物不易发挥作用的癌症, 也有望用 HOZOT 细胞, 把化疗药物直接运送到癌细胞内部 目前, HOZOT 细胞还远不能侵入所有种类的癌细胞 研究人员准备利用小鼠继续实验, 提高 HOZOT 细胞侵入癌细胞的几率, 争取在 5 年后开展临床试验 ( 新华网 ) 一种骨质疏松药有望用于乳腺癌治疗美国和奥地利研究人员日前报告说, 他们 13 发现了一种与乳腺癌有关的蛋白质 与此相关的好消息是, 研究人员此前就曾发现这种蛋白质会引起骨质疏松并已研发出针对它的临床药物, 因此治疗骨质疏松的相关药物有望很快被转化为可治疗乳腺癌的药物 新一期英国 自然 杂志刊登了两份分别由美国和奥地利研究人员完成的报告, 他们独立研究但得出了一致结果 前些年, 许多妇女曾接受应对更年期的激素替代疗法, 在此过程中使用的人工合成孕激素导致了乳腺癌发病率上升 两份报告都确认了这一现象背后的原因, 即孕激素激活了一种名为 RANKL 的蛋白质, 从而诱发乳腺癌 美国研究人员测试了可抑制蛋白质 RANKL 功能的药物在防治乳腺癌方面的效果 结果发现, 在同样的致癌环境下, 服用了相关药物的实验鼠乳腺癌的发病几率更低 而奥地利研究人员使用经过基因修正的实验鼠进行实验 由于基因被改变, 这些实验鼠体内的蛋白质 RANKL 不能发挥正常功能, 与普通实验鼠相比, 它们在同样致癌环境下乳腺癌的发病几率也更低 据介绍, 与大多数基础研究成果需较长时间才能转为实际应用不同, 这一发现有望短期内催生新的可用于治疗人类乳腺癌的药物 此前研究表明, 蛋白质 RANKL 还与骨质疏松有关, 并且研究人员已开发出针对这种蛋白质的骨质疏松临床药物 也许只需稍加变化, 就可将这种骨质疏松药物用于治疗乳腺癌 ( 新华网 ) 英国研究人员发现新前列腺癌风险标记物英国研究人员日前报告说, 他们发现人体尿液中一种蛋白质可作为前列腺癌风险标记物 研究人员认为, 这一发现有助开发一种新的 较为方便的检测前列腺癌变的技术 英国癌症研究会等机构的研究人员在美国学术期刊 科学公共图书馆综合卷 上报告
14 说, 这种名为 MSMB 的蛋白质由正常的前列腺细胞产生, 其功能是调控前列腺细胞的死亡 研究人员对 350 名男性进行了前列腺组织和尿液取样, 并检测他们尿液中 MSMB 蛋白质含量 结果发现, 与健康男性相比, 患有前列腺癌的男性尿液中 MSMB 蛋白质含量明显要低 领导这项研究的海利惠特克博士说, 检测尿液中这种蛋白质含量的方法非常简单, 所以它有可能发展成一种新的 较为方便的检测前列腺癌的技术 目前常规的前列腺癌检查方法是基于一种叫做前列腺特异抗原的生物标记物 但是人体血液中前列腺特异抗原的含量受多种因素影响, 从而影响该方法的准确性 参与研究的罗莎琳德伊尔斯表示, 截至目前, 检测血液中前列腺特异抗原含量仍是诊断前列腺癌最有效的方法, 但这种方法有许多局限性 因此, 当务之急是寻找诸如 MSMB 蛋白质这样新的生物标记物, 并将其应用于前列腺癌的检查和诊断 ( 新华网 ) 香港浸会大学最新研究发现人参能抑制肺癌肿瘤据香港中通社报道, 香港浸会大学中医药学院最近完成一项有关人参抗癌功效的研究, 以实验用小鼠作研究, 结果确定食用适当份量的人参, 能有效抑制肺癌肿瘤生长, 同时不会损害正常细胞 研究结果已经获国际医学期刊 细胞生物化学杂志 接纳发表 这项研究由中医药学院院长刘良带领的研究团队进行, 以接种有肺癌细胞的小鼠进行实验, 安排它们分组食用不同剂量的人参乙醇提取物 ( 简称 EAG), 而对照组则完全没有食用 EAG 经过约一个月后, 发现进食了低剂量 EAG 的小鼠组别出现轻微的抗癌效果, 而以每公斤体重食用一克 EAG 比例的小鼠组别效果较明显, 它们接种在皮下的癌瘤体积和重量, 较没有服用人参的对照组别有明显减少, 显示人 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 参发挥了抗癌功用 与此同时, 服用人参组别的小鼠体重没有下降, 也没有出现异常反应或死亡, 反映人参没有损害小鼠的正常健康 研究小组将进一步采用多种其它的癌症动物模型, 研究人参对多种癌症病人的辅助医疗价值, 同时研究人参提取物与化疗药物联合使用的成效 ( 中新网 ) 以色列开发出皮肤癌探测装置以色列皮肤癌扫描公司开发出一种皮肤癌探测装置, 可及时发现皮肤上出现的恶性癌变, 对皮肤癌早期防治很有帮助 这种名为 皮肤扫描 650 的装置利用光纤扫描进行诊断, 使用时只需将装置放在需检查部位旁, 由光源发射光线对病变区域进行扫描, 细胞被照射后会将部分光线反射回来, 并由仪器将收集到的光信号转变为电信号, 通过对所获数据类型和模式进行分析, 即可对检测结果作出判断 研究人员在拉宾医学中心的试验显示, 这种装置探测早期皮肤癌的有效率为 92% 据称, 此项技术是基于生物热辐射现象开发的 研究发现, 活的生物体会以热的形式辐射能量, 如果机体的热辐射出现异常, 则可能意味着某些部位产生了病变 由于癌细胞扩散速度快于健康细胞的正常分裂, 在新陈代谢过程中会以较高的频率释放能量, 因此, 利用仪器探测和分析这种变化, 即可提早发现是否发生癌变 ( 科技日报 ) 美发现人体多种癌症通用标记据英国 新科学家 网站 10 月 20 日报道, 科学家找到了一种扫描方法, 可以迫使多种类型癌症自动 现形, 这种癌症通用标记有助医生发现并治愈肿瘤, 或实施手术切除肿瘤 这项技术的关键是促卵泡激素 (FSH) 受体, 这种受体通常控制着女性的生殖周期, 因此, 该受体在前列腺肿瘤中会大量出现 美国
细胞与分子诊断,2011 年 1 月, 总第 12 期纽约大学西奈山医学院奥里莉亚 拉都和同事在 1336 个人类肿瘤 ( 包括前列腺癌肿瘤 乳腺癌肿瘤 肺癌肿瘤和肝癌肿瘤等 ) 样本中都搜寻出了它的踪迹 该研究团队在 FSH 受体的抗体上贴上彩色标签, 并将其应用于这些样本中 他们发现, 在每个样本中, 这些抗体都会奔向肿瘤周围的血管 虽然并不知道肿瘤血管为什么表达这些受体, 但拉都认为, 这可能是因为有助于形成新的血管 拉都指出, 这个标记可被用于肿瘤的定位和治疗 目前, 不同的成像技术被用来确定不同类别的肿瘤, 使用这个标记, 一种成像技术就能够检测到全身不同部位的肿瘤, 这种更大范围的扫描可更早探测出继发性肿瘤 伦敦大学癌症研究中心凯尔巴 霍迪瓦拉 - 戴勒克对此表示赞同 她认为, 这无疑是一个好的标记, 在手术中尤其有用 使用贴了彩色标签的抗体来凸显肿瘤的边缘能使手术 一个一个地去掉肿瘤 另外, 她还表示, 也可将一种抗癌药物贴在一个 FSH 受体的抗体上, 用以专门攻击肿瘤 ( 科技日报 ) 中科院上海生科院发现抑癌基因机制可减轻肺癌恶性转移日前从中科院上海生科院获悉, 该院生化与细胞所的科研人员阐明抑癌基因 LKB1 抑制肺癌转移的新机制, 并发现赖氨酰氧化酶是肺癌转移治疗中潜在的分子靶点, 这将为肺癌的临床治疗提供理论基础和新的策略 该成果日前在线发表在国际知名学术期刊 Proceedings of the National Academy of Sciences 上 肺癌是当今全球范围内危害性最大的疾病之一, 具有高发病率和高致死率 超过 90% 的癌症患者死于肿瘤的转移和扩散 肺癌转移是一个复杂过程, 其中癌细胞和细胞外基质的 亲密互动 是肿瘤转移过程中一个很重要的 15 事件 科学家发现, 肺癌中有一个新的抑癌基因 LKB1, 其功能性缺失突变在人类非小细胞肺癌中普遍高发, 而且 LKB1 的功能丧失可以显著地促进肺癌的转移, 但具体作用机理一直不清楚 中科院上海生科院生化与细胞所的季红斌课题组和葛高翔课题组通过合作, 首次阐明 LKB1 的作用机制 研究发现, 原来微环境中肿瘤转移的相关基因赖氨酰氧化酶 LOX 受 LKB1 的信号调控, 在 LKB1 缺失的情况下, LOX 会变得活跃, 激活信号通路增强细胞的侵袭能力, 成为肿瘤转移的 帮凶 在肺癌小鼠模型中, 通过抑制 LOX 的方法, 可以显著减轻肺癌的发生和恶性转移 ( 中国上海网 ) Nature: 胰腺癌从初发到转移的时间线 Christine Iacobuzio-Donahue 及其同事利用全基因组 外显子组 测序来分析来自相同患者的原发胰腺癌和一种或多种转移肿瘤 他们发现肿瘤由截然不同的亚克隆组成, 确定了转移性癌症克隆在原发肿瘤内演化的演化图, 并且估计了肿瘤发展的时间尺度 基于这些数据他们估计, 在胰腺肿瘤发生的开始和原发的 非转移性肿瘤的形成之间的平均时间为 11.8 年, 而指示性转移克隆的出现另需 6.8 年 这些数据表明存在一个潜在很大的机会窗口, 在此时段内也许有可能相对较早地检测出癌症来 Peter Campbell 及其同事利用下一代测序方法检测了 13 名胰腺癌患者的染色体重排 结果显示患者间存在相当大的异质性, 表明在转移的发生过程中基因组不稳定和演化是持续存在的 但对所研究的大部分患者来说, 所发现的基因重排中超过一半存在于所有转移肿瘤和原发肿瘤中, 从而使其成为在这种疾病的早期和晚期进行治疗干预的潜在目标 (Nature)
16 Cellular & Molecular Diagnosis,January 2011,Vol.12 国外期刊文摘 LKB1 基因在人类肺癌细胞中上皮间质转化 (EMT) 的作用 上皮间质转化 (EMT) 是癌症细胞中一种关键性的表型改变, 激发其侵入和转移 肺癌细胞往往表现出间充质细胞表型, 但是, 导致肺癌细胞中 EMT 诱导而发生遗传改变的原因仍然未知 最近的研究表明, 多达三分之一的肺腺癌发生了 LKB1 基因突变 因此, 为了研究肺癌发生过程中因 EMT 诱导而导致 LKB1 基因失活的可能性, 我们通过稳定或瞬时敲除 LKB1 基因, 形成连续的肺上皮细胞和肺腺癌细胞 LKB1 基因敲除增加了细胞运动性和侵袭能力, 并诱导多种间充质细胞标记蛋白的表达, 以及 ZEB1( 一种上皮细胞钙粘蛋白转录抑制因子和 EMT 诱导物 ) 的表达 最近的调查结果显示, mir-200 a/c 表达与由间充质细胞表型所决定的 LKB1 基因敲除克隆中的 ZEB1 呈负相关 此外,LKB1 的瞬时敲除诱导了 ZEB1 mrna, 增加了细胞运动性 ( 受 ZEB1 抑制 ) 这些结果强烈表明,LKB1 基因的失活诱导了 ZEB1 表达, 促使肺癌细胞发生 EMT [ Roy B C, Kohno T K, Iwakawa R, et a l. Involvement of LKB1 in epithelial mesenchymal transition( EMT) of human lung cancer cells. Lung Cancer.2010,70(2):136-145.] 晚期上皮性卵巢癌潜在的预后生物标记物 颗粒蛋白前体 目的 : 很少有研究检测上皮性卵巢癌 (EOC) 复发的生物标记物 我们已经证明在 EOC 中, 颗粒蛋白前体 (PGRN) 和分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 (SLPI) 起上调作用, 存活因子过表达 我们推断他们可以预测隐蔽性 EOC 的存在 方法 : 从病情基本缓解的 EOC 患者中每 3 个月采集一次血浆样本, 直到复发, 测量样本中的 PGRN,SLPI 和已知的生物标记物 HE4 所得到的临床数据和 CA125 结果均被纳入统计分析 根据 Kaplan-Meier 分析, 在中间值区分标记物, 估算无进展生存率 (PES) 和总生存率 (OS) 根据受试者操作特征(ROC) 曲线统计计算曲线下面积 (AUC), 评估鉴别能力 并利用 Cox 比例风险模型, 评估 PFS,OS 和生物标记物的关系, 调整临床预后因素 结果 : 通过对 23 名 EOC 晚期患者中采集的 样本进行评估,3 个月后, 我们发现 PGRN 是唯一与 PFS(P<0.0001) 和 OS(P<0.003) 有关的生物标记物 经过 18 个月的跟进, 观察到 AUC=0.944, 敏感性和特异性分别达到 93% 和 100% 通过 ROC 分析结果和临床因素调整 PFS 浓度为 59 ng/ml, 得到 Cox 模型风险比为 23.5( 95% CI: 2.49 220) 而 SLPI, HE4 和 CA125 的结合, 并没有使模型发生改变 结论 : 我们得到的资料数据表明了 EOC 患者中 PGRN 的 PFS 和 OS 之间潜在的独立联系 但还需要进一步的研究来验证这一发现, 以证实 PGRN 是否能作为该评估的潜在生物标记物 [Jasmine J H,Minshu Y,Nicole H,et al.progranulin is a potential prognostic biomarker in advanced epithelial ovarian cancers. Gynecologic Oncology, 2010, 120 (1):5-10.]