農藥殘留快速檢驗試劑 Rapid Bioassay for Pesticide Residues (RBPR) Reagent Kit 500 tests / 1000 tests 使用說明書 Operation Manual 41362 台中市霧峰區中正路 189 號 ( 行政院農委會農業試驗所創新育成中心 ) 電話 04-2331-7869 傳真 04-2331-7859 網址 www.sichengbio.com
目錄 一 產品說明...1 二 檢測原理...1 三 產品內容...2 產品包裝規格...2 儲存條件...2 四 試劑配製說明...3 蒸餾水添加量.....3 試劑配製操作方法.3 試劑配製說明...4 五 操作流程...5 酵素活性測試...5 對照組測試...6 取樣流程...7 樣品組測試...8 六 結果判讀...9 抑制率之計算方式...9 抑制率判定標準...9 農藥類別判定...10 七 注意事項...10 八 未提供之必要實驗器材... 11 九 疑難排解...12 駟丞生物科技股份有限公司
一 產品說明 經由特殊品系家蠅體內提取出乙醯膽鹼酯酶 ( 酵素 ), 在經過國內農政單位近 20 年的研究及技術實際應用證實, 該酵素 (AChE) 的活性及偵測毒物敏感度為全世界最高, 尚無其他產品可以超越 應用此酵素發展 蔬果農藥殘毒快速檢測法, 檢測農作物農藥殘留, 可快篩近百種有機磷及氨基甲酸鹽類殺蟲劑之累計毒性 二 檢測原理 有機磷及氨基甲酸鹽類殺蟲劑會抑制乙醯膽鹼酯酶 (AChE) 之活性, 其抑制率與農藥之濃度呈正相關 在正常情況下, 乙醯膽鹼酯酶 (AChE) 可將基質 ( 碘化硫代乙醯膽鹼 ATCI) 分解為乙酸及硫代膽鹼, 硫代膽鹼與呈色劑 ( 二硫代二硝基甲酸 DTNB) 反應會產生黃色產物 利用在波長 412nm 下吸光值的變化量 (da/min) 計算出抑制率, 可用來判斷樣品中是否有有機磷及氨基甲酸鹽類農藥殘留 1 駟丞生物科技股份有限公司
三 產品內容 產品包裝規格 項次 內容物 500 Tests 1000 Tests 1 乙醯膽鹼酯酶 ( 酵素 )( AChE ) 1 瓶 2 瓶 2 基質 (ATCI) 1 瓶 2 瓶 3 呈色劑 (DTNB) 1 瓶 2 瓶 4 緩衝液 (PBS buffer) 3 瓶 ( 小 ) 3 瓶 ( 大 ) 5 溴水 (Bromine) 5 瓶 10 瓶 6 操作說明書 1 份 1 份 * 請於收到此套組後細心檢視以上表列中各項組成及數量, 若有任何缺失, 請立即反應 * 蔬果農藥殘毒快速檢驗另需自備 95% 酒精 ( 請採用公賣局藥用酒精 ) 儲存條件 1. 除緩衝液及溴水外, 試劑不論是粉狀或液狀 ( 已稀釋 ), 建議冷凍保存 2. 緩衝液粉末為避免受潮, 可儲存於 0 C 以下, 配製成溶液後可儲存於室溫下 30 天 ( 若要保存更久, 可先分裝並儲存於 0 C 以下 ) 3. 溴水儲存於室溫 保存期限 1. 試劑粉末儲存於 0 C 以下可保存兩年, 室溫下保存三個月 2. 試劑粉末配製成溶液後可於 0 C 以下保存 180 天 3. 溴水無保存期限, 但褪色後即失去效用 2 駟丞生物科技股份有限公司
四 試劑配製說明 蒸餾水添加量 項次 內容物 蒸餾水添加量 500 Tests 1000 Tests 1 乙醯膽鹼酯酶 ( 酵素 )( AChE ) 10ml 10ml 2 基質 (ATCI) 10ml 10ml 3 呈色劑 (DTNB) 50ml 50ml 4 緩衝液 (PBS buffer) 500ml 1000ml 5 溴水 (Bromine) 無 無 試劑配製操作方法 1. 每瓶乙醯膽鹼酯酶 ( AChE ), 加入 10ml 蒸餾水溶解, 分裝後保存於 0 C 以下 2. 每瓶基質加入 10ml 蒸餾水溶解, 分裝後保存於 0 C 以下 4. 每瓶呈色劑加入 50ml 蒸餾水溶解, 分裝後保存於 0 C 以下 5. 每瓶緩衝液以 1000ml 蒸餾水溶解後, 保存於室溫 6. 溴水保存於室溫 7. 酵素試劑使用前需回溫至室溫後才可進行檢測 3 駟丞生物科技股份有限公司
試劑配製說明 1. 若無蒸餾水時, 可使用市面上販售之純水替代, 勿使用礦泉水 RO 逆滲透水 等 2. 酵素試劑建議分裝成 1ml/ 管, 以避免反覆冷凍 解凍 3. 因溴水易揮發, 使用時請盡量縮短打開瓶蓋的時間, 使用後請旋緊瓶蓋 若每次使用量較少, 建議先進行分裝, 以延長保存時間 4. 緩衝液粉末不易溶解, 配製時請注意務必確定完全溶解後再使用 4 駟丞生物科技股份有限公司
五 操作流程 酵素活性測試 1. 取 3ml 緩衝液加入比色管內 2. 加入 20µl 酵素 3. 加入 100µl 呈色液 4. 加入 20µl 基質 5. 將溶液混合均勻後, 放入分光光度計在波長 412nm 下量測每分鐘吸光值的變化 (da/min) 測吸光值波長 412nm 取 3ml 緩衝液 加 20µl 酵素液 加 100µl 呈色液 加 20µl 基質混合均勻 5 秒 * 每瓶酵素配製好後都需檢測酵素活性, 酵素活性需在 0.40-0.50 da/min 之間 當酵素活性高於 0.50 da/min 時, 依酵素濃度調整公式加蒸餾水稀釋, 低於 0.40 da/min 時則需加入 酵素粉末 提高其活性 * 酵素濃度調整公式 : 蒸餾水添加量 =( 實測 da/min 值 -0.45)/0.45X 總體積 5 駟丞生物科技股份有限公司
對照組測試 1. 取 3ml 緩衝液加入比色管內 2. 加入 20µl 酵素 3. 加入 20µl 95% 酒精, 將溶液混合均勻, 並開始 計時 4. 於 30 秒後至 2 分 50 秒之間加入 100µl 呈色液 5. 於 3 分鐘時加入 20µl 基質 6. 將溶液混合均勻後, 放入分光光度計在波長 412nm 下量測每分鐘吸光值的變化 (da/min) * 連續兩次對照組測試誤差需小於 0.014 才能繼續樣品組測試 時間 0:00 0:30-2:50 3:00 分 測吸光值波長 412nm 取 3ml 緩衝液 加 20µl 酵素液 加 20µl 酒精混合均勻 加 100µl 呈色液 加 20µl 基質混合均勻 5 秒 6 駟丞生物科技股份有限公司
樣品萃取流程 每件樣品皆需同時檢測氨基甲酸鹽與有機磷類殺蟲劑 檢測氨基甲酸鹽 : 1. 以內徑約 1 英吋的不鏽鋼管切取蔬菜樣品 4 片或 1 公克蔬果樣品, 稍加切碎後置於玻璃試管中 2. 在試管中加入 1ml 95% 酒精, 振盪 20 秒後靜置 3 分鐘 3. 將萃取液倒至乾淨的試管中 農藥殘留快速檢測試劑 氨基甲酸鹽 (P=O) 以取樣器取 4 片葉子 切碎後放入試管中 加 1ml 酒精 振盪 20 秒靜置 3 分鐘後倒出 檢測有機磷劑 : 1. 以內徑約 1 英吋的不鏽鋼管切取蔬菜樣品 4 片或 1 公克蔬果樣品, 稍加切碎後置於玻璃試管中 2. 在試管中加入 2ml 95% 酒精以及 100µl 溴水, 振盪 20 秒後靜置 3 分鐘 3. 將萃取液倒至乾淨的試管中, 靜置 20 分鐘等溴水揮發後, 方可進行檢測 有機磷劑 (P=S) 以取樣器取 4 片葉子 切碎後放入試管中 加 2ml 酒精 加 100µl 溴水 振盪 20 秒靜置 3 分鐘後倒出再靜置 20 分鐘 7 駟丞生物科技股份有限公司
樣品組測試 1. 取 3ml 緩衝液加入比色管內 2. 加入 20µl 酵素 3. 加入 20µl 樣品液, 將溶液混合均勻, 並開始計時 4. 於 30 秒後至 2 分 50 秒之間加入 100µl 呈色液 5. 於 3 分鐘時加入 20µl 基質 6. 將溶液混合均勻後, 放入分光光度計在波長 412nm 下量測每分鐘吸光值的變化 (da/min) 7. 依吸光值變化速率與對照組之差異計算其抑制率 時間 0:00 0:30-2:50 3:00 分 測吸光值波長 412nm 取 3ml 緩衝液 加 20µl 酵素液 加 20µl 樣品液混合均勻 加 100µl 呈色液 加 20µl 基質混合均勻 5 秒 8 駟丞生物科技股份有限公司
六 結果判讀 抑制率之計算方式 : 對照組之吸光值 - 樣品之吸光值抑制率 (%) = -------------------------------- 100 對照組之吸光值 抑制率判定標準 : 抑制率 建議處理方式 35% 有機磷與氨基甲酸鹽類農藥殘留疑慮較小, 可清洗後安心食用 35%-45% 有機磷與氨基甲酸鹽類農藥疑似殘留, 建議加強清潔 45% 有機磷與氨基甲酸鹽類農藥可能超標 9 駟丞生物科技股份有限公司
農藥類別判定 農藥類別無溴水加溴水結果 氨基甲酸鹽 (P=O) 陽性反應 ( 抑制率 >35%) 陽性反應 ( 抑制率 >35%) 無溴水與加溴水組別抑制率相近 有機磷劑 (P=S) 陰性反應 ( 抑制率 <35%) 陽性反應 ( 抑制率 >35%) 無溴水與加溴水組別抑制率落差大 七 注意事項 1. 試劑使用前皆請先回溫至室溫, 並混合均勻後再使用, 使用完畢後儲存於 0 C 以下 2. 溴水請於通風處使用, 以確保人員健康 3. 未使用完的溴水可保存於螺蓋玻璃瓶中, 以避免溴水揮發, 褪色後請勿使用 4. 酵素試劑加蒸餾水配製後, 冷凍可保存 180 天 5. 酵素活性會隨溫度改變, 溫度上升時酵素活性會變高, 因此建議在恆溫的環境下進行檢測 6. 酵素活性若因溫度變化而改變時, 活性範圍在 0.20-0.60 da/min 之間皆可正常使用, 但第一次配製完成時需調整酵素活性到 0.40-0.50 da/min 之間 7. 使用比色管時, 請拿霧面的兩側, 勿觸摸比色管的透明面, 以免干擾檢測結果 10 駟丞生物科技股份有限公司
八 未提供之必要實驗器材 儀器 耗材 1. 分光光度計 : 可讀取波長 412nm 之吸光值變化 2. 20 μl 自動吸管 3. 100 μl 自動吸管 4. 5000 μl 自動吸管 5. 計時器 1. 4ml 比色管 2. 200 μl 自動吸管套 3. 5000 μl 自動吸管套 4. 玻璃試管 5. 塑膠離心管 6. 石蠟膜 試藥 95% 酒精 ( 公賣局藥用酒精 ) 11 駟丞生物科技股份有限公司
九 疑難排解 問題 可能原因及建議 實驗誤差 : 可能為實驗操作的誤差, 建議吸取樣品及試劑時, 要注意吸取的量是否準確 抑制率出現負值 環境溫度變化太大 : 若連續 3 次以上出現負值, 可能是因環境溫度變化太大產生的影響, 建議重新做對照組, 並儘量避免在溫度變化大的環境下進行檢測 樣品含水量較多 : 若蔬果樣品的含水量較大, 容易產生懸浮物, 造成抑制率出現負值 特殊樣品 : 部份品項的樣品, 因澱粉值含量較高, 檢測時容易出現負值 12 駟丞生物科技股份有限公司
問題 酵素活性太高或太低 未出現呈色反應 基質變黃 可能原因及建議 溫度變化大 : 酵素活性會隨溫度改變, 溫度上升時酵素活性會變高, 因此建議在恆溫的環境下進行檢測 酵素變質 : 若配製酵素時未正確使用蒸餾水, 或酵素未適當保存, 可能會導致酵素變質, 而影響酵素活性 未加入酵素 呈色劑或基質 : 檢測過程中未加入酵素 呈色劑或基質, 建議重新檢測 基質汙染 : 實驗操作過程中需注意吸取不同試劑時, 需更換自動吸管套, 避免試劑交叉汙染 13 駟丞生物科技股份有限公司