畜牧兽医学报 牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 基因在卡介苗中的优化表达 曾范利 张 云 张 梦 时 坤 李建明 刘 菲 李 晶 杜 锐 吉林农业大学中药材学院 长春 吉林农业大学动物科学技术学院 长春 长春金赛药业有限责任公司 长春 吉林农业大学研究生学院 教育部动物生产及产品质量安全重点实验室 吉林省药用动物二级实验室 长春 摘 要 为构建牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 基因工程活载体疫苗 根据已知的 ' 毒株 基因序列 利用 生物学软件对其进行分析 预测了可能存在的抗原表位 设计 对引物 分别扩增了包含预测抗原位点的 个片段 和 克隆至穿梭表达载体 65 中 经酶切 ' 扩增和测序证实已正确插入到表达载体中 构建了 个原核表达质粒 阳性重组质粒通过电转化到卡介苗 ' 感受态中 热诱导后 进行 & 分析和免疫印迹检测 结果表明 个重组质粒在卡介苗中均有不同程度的表达 表达产物与理论推测的相对分子质量一致 :* 结果显示其融合蛋白能被牛抗 的阳性血清识别 具有相应的反应原性 本研究为进一步研究 基因工程活载体疫苗奠定了基础 关键词 牛病毒性腹泻 C 黏膜病病毒 基因 卡介苗 优化表达中图分类号 文献标志码 文章编号 &4 &'' ' ' '' & * 2 5 4 4 --&''+-' - -''+-' - -''-&-' - &'&''& ' &' ' - & -&' ''+-' - ' ; *6 *; ;;;; * * ; ' * 6* *-+ 6 6& 6 6:-: 6 6 6 6 6*:- '* 65; '* *-6; 66 6 - 收稿日期 基金项目 国家科技支撑计划 国家自然科学基金 吉林省科技厅科技支撑计划 吉林农业大学博士启动基金 作者简介 曾范利 女 蒙古族 吉林松原人 讲师 博士 主要从事经济动物疫病研究 & ** 通信作者 杜 锐 & *
期 曾范利等 牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 基因在卡介苗中的优化表达 6 6* 6; : 6* * ' 6 & :* * : 6 * 6*-**:- -6;: *; ;; ' ;; * *; '6 + 6 牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 与猪瘟病毒 ' 和边界病病毒 同属于黄病毒科 * ;; 瘟病毒属 ; 主要引起牛 羊 猪 鹿等动物的病毒性腹泻 黏膜病 5 表现为腹泻 急 慢性黏膜病 持续性感染与免疫耐受 病畜流产 死胎和畸型胎等 是危害养殖 业的重要病原之一 该病呈世界性分布 尤其广泛流行于养殖业发达的国家和地区 宿主较为广泛 具有较高的感染率 且有扩大的趋势 给养殖业造成了严重的危害 目前国内外尚无安全有效的疫苗 成功研制一种有效的 疫苗是控制该病流行的最佳方法 是单股正链 病毒 为 : 成熟 病毒粒子略呈球形 直径 病毒粒子中的蛋白分为结构蛋白和非结构蛋白 只含有 个长的开放阅读框架 编码 个 能加工成所有病毒编码蛋白的多聚蛋白 & 是 的结构蛋白 该蛋白的保守性很低 是导致疫苗保护障碍和病毒持续性感染的重要原因之一 & 的端从 囊膜表面伸出 已经证明端 不但是决定 抗原性的主要部位 而且也是免疫中和反应以及与抗 抗体结合 宿主细胞识别 吸附的主要组成部位 因此 应用 基因构建基因疫苗和活载体疫苗也成为 的防制的一 个探索方向 ' 等研制了多价的 基因疫苗 与 个传统的 灭活苗一起接种妊娠母羊 然后进行同源毒株的攻毒试验 结果表明联合使用可以抵抗多株同源 的攻击 保护率高达 = 正是由于 & 蛋白所具有的免疫优势 使其成为人们防治 研究新型疫苗的首选靶蛋白 本研究对 基因可能的抗原表位进行分析 从而设计引物应用基因工程技术 将 的 基因不同区域分别克隆到整合型穿梭表达载体 65 中 构建了大肠杆菌 分枝杆菌整合穿梭表达质粒 65& 并进行优化表达 旨在获得反应原性较好的免疫蛋白 为进一步构建 基因重组卡介苗打下良好的基础 材料与方法 毒株和菌种 牛病毒性腹泻 C 黏膜病病毒 ' 株由李佑民先生惠赠 65 穿梭整合表达载体由吉林大学张西臣教授惠赠 65 载体 公司 牛抗 全血清抗体购自中国兽医药品监察所 标记兔抗牛 购自武汉博士德生物技术有限公司 卡介苗菌种由吉林大学张西臣教授惠赠 试剂与工具酶 氯 溴 吲哚 半乳糖苷 * 氨苄青霉素 6& 异丙基硫代 半乳糖苷 牛血清白蛋白 卡那霉素均为北京鼎国生物技术有限公司产品 '6* 为宝泰克公司产品 琼脂糖 核酸染料 连接酶 * 5 和 - 限制性内切酶均购自 公司 * 质粒小量试剂盒 凝胶回收试剂盒 显色试剂盒为杭州维特洁公司产品 - 全基因序列分析及氨基酸的二级结构预测 将 基因编码氨基酸序列利用 程序对蛋白二级结构特性进行预测 并应用 - * * 的亲水方案 & 的蛋白质表面可能性方案 6**+ 的柔性蛋白预测方案和 * 的抗原指数方案进行综合分析 为分析 基因在卡介苗表达的影响因素提供依据 将 基因推导的氨基酸序列利用 * ; 软件的蛋白质结构神经网络 预测和隐马可夫模型 55 预测对 & 蛋白的信号肽进行预测 利用 5 55; ; 生物学软件预测蛋白的跨膜区 根据多序列比对结果进行同源性分析 为下一步的蛋白表达 包被提供理论依据 基因优化表达引物的设计与合成 根据 ' 株 基因的序列及分析预测结果 设计包含 & 蛋白的不同区域的
畜牧兽医学报 对引物引物见表 D +JLET OG 优化表达质粒载体的构建 以 _]Z] D=-GDF- 株 为 模 板分 别 以 5Z' 5Z' 5Z*' 5Z' 5Z 和 5Z* 为 引 物 进 行 < 反 应 将 < 产 物 克 隆 于 6 载 体 中经 酶 切' < 鉴 定 为 阳 性 的 克 TSZ 隆将阳性质粒经 + 和 E6 双 酶 切与 经 相 应双酶切的 表达 载 体 进 行 连 接 反 应转 化 至大肠杆 菌 ^S& 中 经 含?= 氨 苄 蓝 白 斑 板 @ 卷 取 生 长 良 好 菌 落 接 种 到 N 培 养 基 中 含 @ g f * m @ -g 振 摇 培 养 &G W=- &&- 处 OZ 值 &' ' &时 _ 培 养 & 进行热诱 导即 @ m 水 浴 D 筛 选 出 表 达 量 高的菌株同 时 收 集 未 诱 导 的 菌 液 作 为 阴 性 对 照 取上述产物进行 ;Z; < 分析 D Y 表达产物的免疫印迹检测 将蛋白转移至 <Z5] 膜上 参 照 文 献 * +方 法 进 筛选挑取单个菌 落 接 种 于 @ _ 培 养 液 中 * 行 [ -X 一 抗 为 牛 抗 _]Z] 全 血 清 抗 体 二抗是辣根过氧化物 酶 标 记 的 兔 抗 牛 : G用 Z_ m' && -g 水浴振荡培养过 夜经质 粒 提 取 试 剂盒提取质粒经 < 和酶切进行鉴定后将 阳性 * * 二氨基联苯胺显 色试 剂盒 显 色 以 诱 导 前 的 重组卡介苗及空载体作为对照 克隆菌送宝生物工程大连有限公司测序将鉴定 正 确 的 克 隆 标 记 为 ' ' * ' ' @ ' 分别对 应 的 引 物 为 5 Z' 5 Z' 5 Z*' 5 Z' 5 Z' 5 Z* D T:L;LG 在卡介苗中的优化表达 将 个 重 组 质 粒 电 转 化 到 卡 介 苗 感 受 态 中挑 结 果 D 二级结构及抗原表位的预测 预测 发 现 螺 旋 区 域 主 要 集 中 的 @& 和 &*= = 区域& 折叠'转角及柔 性区无规 卷 曲共有 * 个区段均 分 布 于 整 个 蛋 白 的 整 个 区 域见图 表 < 基因的扩增引物 2 '= ' + -< < 引物名称 序列 基因中的位置 长度XT ; IF- < - JG- -G D < 5 FE6 666 < 5 FE6666 6 * *& < Z EF66 666 < Z EF666 && &*@ < Z* EF6666666666 && ** 2= 引物序列中斜体部分序列分别为 + 和 E6 酶切位点 < - = 5 5 Z Z=-Z*= +=-E6 -CE G C T Y IF- ETJ E ' 螺旋区段& _' 折叠区段& 6' 转角区域& '无规卷曲区域 & ' D L G -& _' = D 6' F - G -& ' =- G T G 图 I2 2&G 蛋白二级结构的预测 N 2 2 I2 2&G + 2?
期 曾范利等牛病毒性腹泻黏膜病病毒 基因在卡介苗中的优化表达 = 软 件 对 蛋 白 进 行 单 参 数 预 应 用 Z2; 测显 示 亲 水 性 较 高 有 &' @' @&' ' ' *' ****&' **= = 应用不同软件对其氨基酸的一级结构的亲水性预测 &' @' @@' &*= = 的区段& 蛋白的柔曲 性预 测显示 个区段& 蛋白 的抗 原 结果显 示 在 *' **' @&@' ' @@ 指数 较 高 的 有 个 区 域包 括 ' &' * &'@'*&@'*'@**' *@@'*'*&*&'*&*'*& *' @*' @' &&' &' **@' *'@@''@*' **' ****= = 区 段 同 样 有 较 高 的 亲 水 性 应 用 Z2S2 预 测 的 抗 原 肽 段 指 数 与 ^ = [ J ' @' *&*' *&*' ***&= =& 按 方案预测 的表 面 可 能 性 区 域 有 & 个 方 案 有 所 不 同但 在 *'&@'*' ' *' ****@= =区段 显 示 抗 原 指 ' *@' *'&''' ' @ @ ' *' @@@' ' 数均较高图 这些区段可 能在 二 级 结 构 上 形 成 抗原簇 *''*'&'& 图 I2 2&G 蛋白的亲水性抗原指数和表面可能性预测 N 2 I2 2&G + 22? + + == 22 2 2?+??- 22 基因推导的氨基酸序列由神 经网 络法 预测结果显示 蛋白序列 *@ 个 2末端氨 基酸 残 基为信号肽序列最佳切割位点在 *@*& 氨基酸 处图 *概率较低为 &' **且位于 蛋白疏水性 氨基酸区段隐马可夫模 型NSS预 测 结 果 显 示 蛋白不 含 有 信 号 肽 图 而 生 物 学 软 件 6S NSS ; Y Y' ' & 预 测 结 果 表 明 蛋 白 跨 膜 螺 旋区位于 *@*= =图 @ 图 I2 2&G 蛋白的信号肽的隐马可夫模型预 测 OSJJ 2FN N 2 + + I2 2& 2 G + 2=? S 2J 6 WJ O 2FN SJJ D 重组质粒的构建及鉴定 _]Z] D=-GDF- 株 经 < 扩 增产 物 经 图 EI2 2&G 蛋 白 信 号 肽 的 神 经 网 络 法 预 测 OCC 2FN EN 2 + + I2 2& 2 G + 2 =? C 2 @ 6 < O 2FN OCC a 琼脂糖凝胶电泳 得 到 了 与 个 预 期 设 计 大 小 的 特 异 性 片 段 以 ' ' * ' ' @ ' 的 重 组 质 粒 为 模 板 空 质 粒 做阴性对照分别以 5Z' 5Z' 5Z*' 5Z'
畜牧兽医学报 图 I2 2&G 蛋白的跨膜区的预测 N 2 2 <<= 2 I2 2& G+ 2 5Z' 5Z* 为 引 物 进 行 < 鉴 定结 果 得 到 ' &*@' ' @@' ' XT 的 片 段与 预 期 相符图 经 + 和 E6 双 酶切同样 扩增 出 个 目 的 片 段 图 证 明 成 功 构 建 个 重组质粒 S' Z&&& Z2 相 对 分 子 质 量 标 准& ' ' ' * ' ' @ ' 的 < 产物& '阴性对照 & S' Z&&&Z2 = W ' <T F J * @ =- T Y ' 2G= Y E& 图 T+JLET 各重组质粒的 NI 鉴定结果 + < +JLET <= 22 T G <=?NI + D E:I4 菌株稳定性鉴定 将制 备 的 _ 质 粒 用 双 酶 切 + ' E6 进行鉴定得到 将 重 组 卡 介 苗 连 续 传 代 @ 次每 次提 取 质 粒 做 < 鉴 定仍 能 得 到 清 晰 的 目 的 条 带结果见图 D 重组蛋白的诱导表达结果 经 ;Z; < 电泳确定构建的重组卡 介苗 经 诱导后分别表达出 了 个 融 合 蛋 白其 相 对 分 子 质 量分别为 *' ' *' ' ' @' *' ' *' * 和 ' WF 与预期结果基本一致图 @ 卷 S ' Z@&&& Z2 相 对 分 子 质 量 标 准& ' ' * ' ' ' @ ' 的酶切产物&S ' Z&&&Z2 相对分 子质量标准 S ' Z@&&&Z2 = W & ' -C E G - T F J * @ =- T Y Z&&&Z2 = W E&S ' 图 Y+JLET OG 的酶切鉴定结果 Y[ 2 2 NJLET OG @ 22 O R 2?< S' Z&&& Z2 相 对 分 子 质 量 标 准& '转 染 ' ' * ' ' ' 的重组卡介苗 产物 @ < S'Z&&& Z2 = W & '< T F J_ =- J XE * @ =- T Y E 图 & 重组卡介苗质粒的 NI 鉴定结果 &[ 2 2 <= 22 :I4=?NI D a 2= 结果分析 表达产物经 ;Z; < 电泳 后转 移 到 <]Z5 膜上进行重组蛋白 活 性 检 测重 组 蛋 白 均 出 现 了 特 异的 反 应 带而 对 照 组 空 载 体 无 此 条 带 图 &证 明表达产物具有一定的反应原性 E 讨 论 由于 _]Z] 的 囊 膜 糖 蛋 白 的 2 端 既 是 决 定 _]Z] 抗原 性 的 主 要 部 位也 是 与 抗 _]Z] 抗
期 曾范利等 牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 基因在卡介苗中的优化表达 区段则显示为一致性较高的区段 尤其在 区段中连续出现分值较高的区域 在 和 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 5 蛋白质相对分子质量标准 卡介苗空载体 '65& '65& ' 65& '65& '65 & '65& 5 * * 6 6 -; 图 重组卡介苗 结果 & 5 蛋白质相对分子质量标准 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 65& 重组卡介苗 卡介苗空载体 5 * * 6 '65& '65& '65& ' 65& '65& '65 & 6 -; 图 重组卡介苗免疫印迹检测结果 & =' 体结合 介导免疫中和反应及与宿主细胞识别 吸附的主要部位 是引起免疫反应的重要保护性抗原 该基因的变异性较强 其变异使 对其生存环境具有较好的适应性 保护动物不受同源毒株的攻 击 因此 基因是基因工程疫苗的首选保护性抗原基因 但由于 & 蛋白的全基因序列在卡介苗中的表达量较低 本试验将其截短除去部分抗原指数较低的序列 选择合适的载体构建重组卡介苗 本研究运用软件进行单参数预测 结果显示在 这些片段的抗原表位指数均相对较高 根据 & 蛋白的结构特性 不同程度地除了 & 蛋白 ' 端影响 & 蛋白的表达的跨膜疏水区域 构建了 65& 65& 和 65& 个重组表达质粒 同时本研究尝试着去除了 & 蛋白端抗原指数较低的 个氨基酸序列分别构建 65& 65& 和 65& 个重组表达质粒 期待从这些未报道的抗原表位中寻找到能够影响抗原表位的构象表位 蛋白构象影响抗原的性质的区域 使蛋白质在表达时产生的空间构象有利于主要抗原簇的暴露 能够与抗体产生作用 本试验通过构建 基因的不同的区域的表达质粒 电转化到卡介苗中 诱导 表达 个不同的融合蛋白 :* 结果显示 个区域的基因均在卡介苗中有不同程度的表达 65& 65& 分别诱导表达出 和 的融合蛋白与 的阳性血清相反 应 与李娇 徐兴然等报道的一致 研究证实 通过去除 & 蛋白 ' 端的疏水序列 诱导表达后 基因在卡介苗中的表达量有了不同程度的提高 同时笔者也除去了 & 蛋白端的抗原表位指数较低的一段区域 在自然状态下这些被除去的部分 端 ' 端的表位是隐藏的 ' 端的抗原表位在表达的融合蛋白时可能暴露在载体蛋白的表面 与抗 体相互作用 本试验所用载体 65 具有能将 分段表达质粒整合到 ' 染色体上的优点 由于 65 载体上存在 启动子 能够有效地指导 基因在 ' 中表达 经长期传代培养发现 不需连续抗生素筛选也并没有发现其质粒丢失的现象 并且也未改变 ' 的生物学特性 研究表明 ' 是一种特别难于培养的细菌 增殖一代需要较长的时间 ' 作为多价的活载体 疫苗在外源蛋白表达方面还有很多需要探索和解决的问题 主要表现在 具有生物活性蛋白的免疫原性取决于它的空间构象 ' 缺乏翻译后的修饰加工并且二硫键的形成等作用有限 某些免疫活性表位是否能在 ' 中获得最佳免疫效果有待研 究 蛋白的表达水平低等 目前已成功构建可以同时表达多个蛋白的含有双启动子的穿梭表达载
畜 牧 兽 医 学 报 卷 体 为进一步研制多价 ' 疫苗提供了技术基础 本研究成功构建了 基因截短重组卡介苗 并对重组卡介苗的反应原性进行了检测 为研制开发有效防治结核病和牛病毒性腹泻 黏膜病的二价基因工程活载体疫苗打下一定的基础 结 论成功克隆了牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 ' 株 基因的 段包含预测抗原位点的片段 亚克隆至穿梭表达载体 65 中 成功构建了 个 基因截短重组卡介苗 个重组卡介苗不同程度地表达 表达产物与理论推测的相对分子质量一致 :* 结果显示其融合蛋白能被牛抗 的阳性血清识别 具有相应的反应原性 参考文献 殷 震 刘景华 动物病毒学 5 版 北京 科技出版社 王新平 周绪斌 瘟病毒间的差异及起源 动物医学进展 王丹娜 牛病毒性腹泻病毒 6 基因的分段表达及其抗原性分析 哈尔滨 东北农业大学 ' & 5 '*5* * **6; :;; * ; 2 & && * ** : : ;; * ; 李昭春 牛病毒性腹泻病毒 ' 检测及分型研 ' 4 &;; * ; 6*- 66* 4&' 6 ** ; *:;; ; & :;6 * ;*-; ; 6 * * 66 & & 抗体技术实验指南 5 沈关心 龚非力 译 北京 科学出版社 钟发刚 牛病毒性腹泻病毒抗原检测 流行病学研究及分离株 & 基因的克隆表达 雅安 四川农业大学 李 娇 薛 飞 朱远茂 等 牛病毒性腹泻病毒 & 蛋白的截短表达与鉴定 中国预防兽医学报 杜 锐 刁 燕 韩俊友 等 牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 ' 株 基因在卡介苗中的表达 中国兽医学报 徐兴然 涂长春 余兴龙 等 牛病毒性腹泻病病毒 ' 株 基因的克隆及在大肠杆中的高效表达 中国预防兽医学报 黄 新 王新华 钟发刚 等 牛病毒性腹泻病毒玛纳斯株 基因的克隆及其主要抗原表位区的分段达 中国兽医科学 沈周俊 丁国庆 抗膀胱癌新型制剂 重组卡介苗的研究 临床泌尿外科杂志 丁国庆 人干扰素 : 基因重组卡介苗的构建及抗膀胱癌作用的研究 杭州 浙江大学 刘海涛 分泌 和 的基因重组卡介苗构建和抗膀胱肿瘤实验研究 上海 复旦大学 编辑 白永平 究 哈尔滨 东北农业大学