β— 内酰胺类抗生素过敏反应的研究

β 内酰胺类抗生素过敏反应 的研究 袁雯玮 ( 天津市药品检验所 )

一 前言 抗菌药物是临床中最常用的基本药物, 同时也是较易发生不良反应的药物之一 临床中抗菌药物较常见的一类不良反应是药物所致的过敏反应 β 内酰胺类抗生素 氨基糖苷类抗生素及新开发的喹诺酮类抗生素均可引发不同类型的过敏反应, 但以 β 内酰胺类抗生素最为严重 特别是青霉素引发的过敏性休克反应, 不仅对患者的危害极大, 对医护人员的心理压力也很大

多年来的研究业已证明, 抗生素所致的速发型过敏反应并非由药物本身所致, 而和药物中存在的高分子杂质有关 此外, 一些抗菌药物中的高分子杂质, 如链霉素 某些头孢菌素等还和药物的毒性反应有关 故对抗菌药物中高分子杂质进行控制有着重要的意义

USP 第 23 版曾对头孢他定 (Ceftazidime) 中的高聚物进行控制 ; 一些国外生产厂对其产品中的高分子杂质也有内控标准, 如意大利先灵药厂对其产品 Ceftibutin 中 X 组相关物质的控制 ;

国内关于 β- 内酰胺类抗生素高分子杂质的研究工作是于 70 年代开始, 经历了近 40 年的研究, 于 2000 年版药典正式在 4 个品种 8 个药品标准中收载了高分子聚合物检查 2005 年版药典扩大到 11 个品种的 21 个药品标准中均有高分子聚合物检查

表 1 2005 年版药典检查高分子聚合物的品种增 修订情况一览表 2000 年版已收载品种 (8) 2005 年版修订品种 (2) 2005 年版增订品种 (13) 头孢他啶头孢他啶青霉素钠 注射用头孢他啶注射用头孢他啶注射用青霉素钠 头孢曲松钠注射用头孢曲松钠头孢噻肟钠注射用头孢噻肟钠头孢哌酮钠注射用头孢哌酮钠 青霉素钾注射用青霉素钾青霉素 V 钾青霉素 V 钾胶囊头孢呋辛钠注射用头孢呋辛钠 头孢唑啉钠注射用头孢唑啉钠阿莫西林阿莫西林胶囊头孢拉定 ( 供注射用 )

国内一些氨苄青霉素 (ampicillin) 生产厂为改进产品质量也曾对其生产药品的聚合物进行过考察和控制 中国药典 2005 年版 USP 第 25 版对氨苄西林钠的二聚物已进行控制

本文介绍近年来对 β 内酰胺类抗生素高分子杂质的研究进展情况, 主要包括聚合物形成机理 结构特性 过敏反应的研究和分离分析方法等方面

二 β 内酰胺类抗菌药物中的高分子杂质 分类及来源 1. 定义抗菌药物中的高分子杂质系指药品中分子量大于药物本身的杂质总称, 其分子量一般在 1000 5000, 个别可至 10000 道尔顿左右

2 分类及来源 β 内酰胺类抗菌药物中的高分子杂质按其来源通常被分为二类 : a. 外源性杂质 b. 内源性杂质

a. 外源性杂质 : 包括蛋白 多肽 多糖等类杂质, 或抗生素和蛋白 多肽 多糖等的结合物 外源性杂质一般来源于发酵工艺, 如青霉素中的青霉噻唑蛋白 青霉噻唑多肽等 其中蛋白 多肽类杂质在抗生素过敏反应中起着重要的作用

b. 内源性杂质系指抗菌药物的自身聚合产物 聚合物既可来自生产过程, 又可在储存中形成, 甚至在用药时也可产生, 如阿莫西林 (amoxycillin) 干糖浆, 当采用开水冲服时, 其高分子杂质可增加 100 倍 ( 图 1)

抗生素聚合物的免疫原性通常较弱, 但作为多价半抗原, 可引发抗生素速发型过敏反应 随着现代生产工艺的不断改进和提高, 目前产品中的外源性杂质日趋减少, 对内源性聚合物的控制是当前抗生素高分子杂质质量控制的重点

三 β 内酰胺类抗生素高分子杂 质的形成机理及结构特征 β 内酰胺类抗生素主要包括青霉素和头孢菌素二大类 除青霉素 G 外, 临床中常用的 β 内酰胺类抗生素均为半合成抗生素, 故除青霉素 G 中还含有少量的青霉噻唑多肽外, 其他制剂中的高分子杂质主要是聚合物

1 青霉噻唑蛋白, 多肽 制剂中青霉噻唑蛋白, 多肽的分子量主要分布在 3500 2400 左右, 由青霉素的 β 内酰胺环和多肽上的伯氨基按亲核反应机理缩合而成, 主要在发酵工艺中形成, 高 ph 环境有利于缩合反应的进行 ;

样品在储存过程中, 多肽类杂质残留的自由氨基仍能和 β 内酰胺环反应, 直至被饱和, 反应速度和样品本身的水分含量及储存温度有关 青霉噻唑蛋白多肽比较稳定, 其基本结构见图 2-1

图 2 1

根据蛋白质 多肽与青霉素类抗生素分子结合位点不同还可能有下列反应产物 ( 基本结构见图 2 2) 但主要的蛋白多肽结合物为青霉噻唑蛋白多肽

图 2 2

2. 青霉素聚合物青霉素的聚合反应可按二种方式进行 : 1) 反应仅和母核结构有关, 侧链中的活性基团不参与反应, 此时, 一分子青霉素首先开环, 形成一新的活性位点, 并与另一分子青霉素聚合 该类聚合物的基本结构如图 3 所示 理论上, 所有青霉素均可按该反应机理聚合

图 3

2) 侧链参与的聚合反应主要以氨苄青霉素为代表, 反应时侧链上的氨基亲核攻击 β 内酰胺抗生素的羰基碳原子, 形成聚合物 基本结构于图 4 所示

图 4

对侧链不含氨基等活泼基团的青霉素, 聚合反应只按一种方式进行, 如羧苄青霉素 呋苄青霉素 青霉素 G 和 6 APA 等 ; 对氨苄青霉素等侧链含有氨基的青霉素, 聚合反应可按二种方式进行 利用质谱分析氨苄青霉素中的寡聚物, 证明氨苄青霉素中有多种不同的聚合产物存在 ( 表 1)

表 1 FAB MS 分析氨苄青霉素寡聚物混合组分 M/Z 可能的化合物结构 350 699 717 1046 1064 氨苄青霉素 (M + H) + 氨苄青霉素二聚物 (M + H) + 氨苄青霉素开环二聚物 (M + H) + 氨苄青霉素三聚物 (M - H) - 氨苄青霉素开环三聚物 (M - H) -

青霉素的聚合反应速度在液体条件下和溶液的酸碱度关系密切 ; 在固体条件下主要和样品的水分含量有关 图 5 为呋苄青霉素在不同 ph 条件下的聚合反应速度 图 6 为呋苄青霉素固体样品水分含量不同时的聚合反应速度

图 5

图 6

3 头孢菌素聚合物 3.1 头孢菌素的聚合反应亦包括二种类型 : 1) 只依赖于母核的 N 型聚合反应和侧链参与的 L 型聚合反应 对于 7 位侧链中不含有自由氨基的头孢菌素如头孢噻吩 头孢呋新 头孢哌酮等只能发生 N 型聚合反应 可以下式表达 :

上述反应中,3 位取代基的诱导效应对头孢菌素 β 内酰胺环的稳定性影响很大 取代基吸电子效应越强, 则减弱了羰基和 Δ 3 双键的共轭作用使 β 内酰胺越不稳定 一般情况下头孢菌素聚合反应与 β 内酰胺的稳定程度有关, 但 β 内酰胺环开环后,C 3 位取代基吸电子效应强弱又直接影响二氢噻嗪环中仲氨基的活性 若吸电子效应增强则活性降低, 使聚合反应速度减慢

因此,C 3 位取代基吸电子效应对聚合物产生的影响有一个量的界限, 聚合反应的快慢应视具体情况而定

2) 7 位侧链中有自由氨基的头孢菌素如头孢氨苄 头孢拉定 头孢噻肟等在酸性条件下, 氨基主要以季铵盐形式存在, 所以一般只发生 N 型聚合反应 在碱性条件下,N 型聚合物和 L 型聚合物都可以发生

形成的聚合物为两类聚合反应的混合物, 但两类反应的相对强度由化合物的具体结构所决定 如头孢曲松 头孢他定等侧链的自由氨基直接与噻唑环连接由于共轭效应使得自由氨基亲核攻击能力大大减弱, 故产品中聚合物主要为 N 型聚合物

3.2 固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度的关系 实验表明 ( 见表 2), 贮存温度较低时, 含水量差异对聚合物含量尽管有影响, 但差异不大 但当贮存温度上升至 37 时含水量差异对聚合物含量的影响十分显著

表 2 含水量 贮存温度对聚合物峰高值的影响 品名含水量 % 贮存温度 ( ) 聚合物峰高值 (mm) 头孢曲松 16.1 6.08 10.3 5.46 头孢噻肟 12.1 3.27 12.9 3.2 头孢哌酮 16.4 1.52 10.5 1.49 头孢他定 14.1 0.98 14.0 1.02 4 4 37 37 4 4 37 37 4 4 37 37 4 4 37 37 28 20 240 22 24 12 32 16 27 17 288 19 17 14 14 39

值得讨论的是头孢他定的实验结果, 当含水量为 14.1% 和 14.0%( 理论结晶水量为 14.1%) 时,4 和 37 贮存样品测得的聚合物基本接近 当含水量为 1.02% 37 贮存的样品高几倍 这可能是由于游离水为影响头孢菌素固态聚合反应的关键因素, 而温度对该反应的速度具有调节作用

四 高分子杂质过敏反应的研究 β 内酰胺类抗生素由于其高效 低毒, 因此临床应用十分广泛, 但其过敏反应发生率居各类药物之首, 尤其是过敏性休克危害极大 有报道, 据国际卫生组织统计, 青霉素类药物过敏反应发生率为 0.7% 10%, 过敏性休克发生率为 0.004% 0.04%

另有报道, 根据 15987 名病人接受头孢菌素类抗生素治疗, 有青霉素过敏史的病人头孢菌素过敏发生率为 8.1%, 无青霉素过敏史的病人为 1.9% β 内酰胺类抗生素引起过敏反应的原因是什么, 多年来的研究业已证明由 β 内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应并非药物本身所致, 而和药物中存在的高分子杂质有关

β - 内酰胺类抗生素本身并不是过敏原, 而只有当它们与蛋白 多肽 多糖等大分子载体共价结合成全抗原或本身聚合成多价半抗原后才能引发过敏反应

青霉素过敏反应中主要抗原决定簇 青霉噻唑基 (BPO)

头孢菌素过敏反应的主要抗原决定簇 7 位 R1 侧链

在动物实验中还证明不同侧链的青霉素因有共同的抗原决定簇 青霉噻唑基, 因此它们之间都能发生交叉过敏反应

各种不同侧链的头孢菌素因无固定的抗原决定簇, 故它们之间不发生交叉过敏反应, 只有当他们 7 位侧链的结构相同或相似时才会发生交叉过敏反应

这些发现对临床合理使用 β 内酰胺类抗生素, 控制交叉过敏反应是很有指导意义的

金少鸿等用葡聚糖凝胶过滤和 GDX 104 柱层析法首次从头孢噻肟 (CTX) 样品中分离到基本无抗菌活性的高分子杂质 在用兔抗 (CTX) 12 BSA 血清致敏豚鼠被动皮肤过敏反应 ( 豚鼠 PCA) 中, Kav = 0 的高分子杂质攻击时能引发 PCA 阳性反应 ( 图 8), 而用 Kav = 0.7 的 CTX 攻击时,PCA 反应为阴性 ( 图 9)

由此表明,CTX 本身仅是一个单价的半抗原, 而 CTX 中高分子杂质至少是具有二个抗原决定簇以上, 是能引发过敏反应的多价的半抗原

小鼠 PCA 试验和小鼠全身过敏性休克死亡试验的结果表明,CTX 中的高分子杂质能引发 IgE 介导的过敏反应, 是一种过敏性的高分子杂质

对临床上发生过敏反应的病历所使用的 CTX 样品进行分析, 结果可初步看出 CTX 中高分子过敏性杂质的多少与临床上过敏反应的发生率有一定的关系

图 8

图 9

五 口服 β 内酰胺类抗生素过敏反 应的研究 口服青霉素类抗生素国内外均有发生临床过敏反应的报道, 但对其中过敏原以及口服给药后如何通过胃肠道吸收而引发过敏反应未见实验报道

顾立素等通过青霉素 V 钾进行了详细研究, 首先证实了青霉素 V 与其他注射用青霉素一样可以形成高分子聚合物, 其聚合速度与药物浓度 反应温度及 ph 等有关 制备的青霉素 V 聚合物可引发豚鼠皮肤被动过敏试验 (PCA) 阳性, 口服青霉素 V 高聚物后,30 分钟血清中可检出聚合物 ; 在 30 分钟至 1 小时可引发豚鼠 PCA 反应阳性, 从而证明了青霉素中高分子聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应

利用动物口服主动全身过敏反应模型确证了引发青霉素 V 钾 阿莫西林等口服青霉素过敏反应的主要过敏原也是它们的高聚物, 胃肠道吸收并不改变其过敏性, 而口服青霉素本身并不能引发过敏反应, 由此证实 β 内酰胺类抗生素过敏反应均与产品的质量有关

因此, 对于 β 内酰胺类抗生素的口服制剂, 特别是对于以前药形式存在的酯类口服 β 内酰胺类抗生素必须对其中的高聚物进行研究, 以指导工艺采取措施, 严格控制其含量, 减少临床过敏反应的发生 规定青霉素类抗生素口服制剂, 服前必必须进行皮肤过敏试验, 这是十分必要的

六 高分子杂质的测定方法及应用 1 分析方法概述 国内外已有许多分离 分析 β 内酰胺类抗生素中高分子杂质的报道 色谱法是主要分离分析的方法 其分离模式有三类 :(1) 反相模式 ;(2) 离子交换模式 ;(3) 凝胶色谱模式

由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性, 如均为过敏性杂质, 因此, 在药品质量控制中一般不需分别控制不同结构的高分子杂质含量, 而只需控制商品中高分子杂质的总量 故根据分子量差异进行分离的凝胶色谱模式是简便易行的分离模式

中国药品生物制品检定所金少鸿, 胡昌勤等发展了一个以葡聚糖凝胶 Sephadex G-10 为基础的凝胶色谱分析方法, 可方便地用于对各种 β 内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离 分析, 并满足药品质量控制要求

2 Sephadex G-10 凝胶色谱分析法的原理 2.1 分离原理 利用凝胶色谱的分子筛机制, 让药物分子自由进入凝胶颗粒内部, 而高分子杂质被排阻不能进入凝胶颗粒内部, 在色谱过程中不被保留, 最早被流动相洗脱至柱外 表现为保留时间最短, 而药物分子在柱子中滞留时间较长, 表现为保留时间较长

2.2 方法概述 根据 β 内酰胺类抗生素和其高分子杂质分子量的特点, 比较数种凝胶介质, 最后选用 Sephadex G-10 作为色谱系统的凝胶介质 ( 排阻分子量在 700 道尔顿左右 ) 通过选择适当的流动相, 调节洗脱速度, 成功地完成数十种 β 内酰胺类抗生素的高分子杂质分离

2.3 聚合物分析方法的完善 1) 聚合物对照品问题由于 β 内酰胺类抗生素形成聚合物的聚合度是不断变化的动态物质, 无法制备出具有固定含量的标准物质, 因此难以实现采用聚合物对照品的外标法定量,USP23 版中头孢他啶高聚物含量测定方法自 1995 年 1 月正式颁布后三年内一直因不能提供对照品而未予执行, 不得不在 1998 年 11 月颁布的 USP23 版第 9 增补版中删去高聚物测定项目

2) 面积归一化法定量的缺陷 由于聚合物含量很低, 加之凝胶色谱柱理论板数一般较低, 使药品本身色谱峰十分宽大, 致使积分仪准确积分有困难 所以 β 内酰胺类抗生素聚合物测定不适合采用面积归一化法定量

3) 自身对照外标法 β- 内酰胺类抗生素高分子杂质具有高度不均一性和不确定性, 高分子杂质本身不稳定, 对照品不易制得, 经试验表明 ; 在特定条件下 ( 一般在以流动相为水的条件下 ),β- 内酰胺抗生素由于分子间的氢键, 静电 疏水相互作用等可形成表观分子量较大的缔合物, 在 Sephadex G 10 凝胶色谱系统中的色谱行为与高分子杂质相同, 都在 Kav=0 处表现为单一色谱峰, 利用该特点, 制定自身对照外标法

该方法灵敏度高, 重现性尚好, 测定精密度达到一般微量测定的误差要求 已有 21 个品种正式列入中国药典 2005 年版质量控制的项目

七. β- 内酰胺类抗生素高分子杂质测定法应用指导原则 本法用于药物在生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能引起过敏反应的高分子物质的检查 抗生素药物高分子杂质系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称 β- 内酰胺类抗生素药高分子杂质的分子量一般在 1000-5000 道尔顿, 个别可达到 10000 道尔顿

本方法系统适用性试验应注重高分子杂质峰与单体峰的分离度, 并应考察对照测定系统与供试品测定系统中兰色葡聚糖 2000 溶液峰的保留时间 (Kav=0) 比值 理论板数与拖尾因子

1. 根据 β- 内酰胺类抗生素高分子杂质的分子量特点, 采用凝胶色谱分离 凝胶色谱填料首先为葡聚糖凝胶 G-10(Sephadex G 10), 也可用葡聚糖交联糖琼脂凝胶 ( Superdex peptide) 等 1.1 Sephadex G 10 其排阻分子量为 700 道尔顿, 因此除部分寡聚物外,β- 内酰胺类抗生素高分子杂质在色谱过程中均不保留, 即所有高分子杂质表现为单一色谱峰, 其 Kav=0

1.2 兰色葡聚糖 2000 在色谱过程中不保留, 所以可用兰色葡聚糖 2000 的保留时间来表示高分子杂质的保留特性 2 高分子杂质测定用流动相一般选用磷酸盐缓冲液, 也可根据药品性质选择不同盐的缓冲液 2.1 缓冲液的离子强度对溶质的保留行为与响应值有影响

2.2 缓冲液的种类 ph 以及洗脱速度对溶质的色谱行为均有影响 3 检测器选用 UV 检测器, 波长一般为 UV 254nm 或 280nm 4 用自身对照外标法计算高分子杂质限度 :

4.1 β- 内酰胺类抗生素高分子杂质具有高度不均一性和不确定性, 高分子杂质本身不稳定, 对照品不易制得, 经试验表明 ; 在特定条件下 ( 一般在以流动相为水的条件下 ),β- 内酰胺抗生素由于分子间的氢键, 静电 疏水相互作用等可形成表观分子量较大的缔合物, 在 Sephadex G 10 凝胶色谱系统中的色谱行为与高分子杂质相同, 都在 Kav=0 处表现为单一色谱峰, 利用该特点, 制定自身对照外标法

4.2 个别品种由于本身结构的影响在特定的条件下仅有少部分分子间发生缔合或缔合物本身又不稳定时, 应根据药物本身分子结构特征等改用其他可形成缔合物结构类似品种替代, 并用校正因子计算结果

5. 系统适用性试验中应进行以下试验 : 5.1 分离度 : 照分子排阻色谱法项下规定, 分离度计算公式为 : R= 高聚物的峰高 >2.0 单体与高聚物峰间的谷高 分离度试验用溶液配置时, 可加入一定量 的兰色葡聚糖 2000, 使聚合物的峰面积达到 该品种限度规定的 1-2 倍

5.2 以兰色葡聚糖 2000 的保留时间表示高分子杂质的保留特征, 并规定对照溶液色谱峰及高分子杂质色谱峰与兰色葡聚糖 2000 色谱峰的保留时间的比值, 一般为 0.93-1.07

5.3 规定对照溶液进样的重复性, 连续进样 5 针, 峰面积相对标准偏差 (RSD) 应 5.0% 6 供试品溶液进样量与高分子杂质峰面积间的相关性要求, r>0.99

附图. 头孢噻肟钠样品分析色谱图

附图. 头孢唑林钠样品分析色谱图

附图. 氨苄青霉素钠样品分析色谱图

附图. 青霉素钠样品分析色谱图

附图. 头孢他定样品分析色谱图

再 见!