中 国 农 学 通 报 2013,29(26):19-24 Chinese Agricultural Science Bulletin 感 染 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 的 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 方 法 的 建 立 1,2 1,3 1,2 1,2 1,2 1,2 黄 梅 清, 朱 果 真, 陈 仕 龙, 郑 敏, 程 晓 霞, 陈 少 莺 ( 1 福 建 省 畜 禽 疫 病 防 治 工 程 技 术 研 究 中 心, 福 州 313; 2 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所, 福 州 313; 3 福 建 农 林 大 学 动 物 科 学 学 院, 福 州 307) 摘 要 : 为 建 立 感 染 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 (NDRV) 的 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 (2-DE) 方 法 本 研 究 通 过 对 人 工 感 染 NDRV 的 雏 番 鸭 肝 脏 病 变 的 观 察, 对 肝 脏 蛋 白 质 提 取 裂 解 液 的 配 方 样 品 上 样 量 一 向 等 电 聚 焦 (IEF) 参 数 等 条 件 的 对 比 和 优 化, 建 立 了 有 效 的 番 鸭 肝 脏 2-DE 方 法 结 果 表 明 : 采 用 攻 毒 后 病 变 最 典 型 的 第 5 天 的 番 鸭 肝 脏 作 为 研 究 样 品 ; 采 用 研 磨 - 超 声 - 裂 解 液 (7 mol/l 尿 素 2 mol/l 硫 脲 4% CHAPS 65 mmol/l DTT 40 mmol/l Tris-base 0.5% IPG buffer) 法 提 取 肝 脏 蛋 白 质, 结 合 2D clean-up kit 以 及 去 拖 尾 DeStreak 试 剂 纯 化 蛋 白, 按 1100 μg 上 样, 设 置 IEF 参 数 为 :50 V 12 h 200 V 1.5 h V 1000 V V 3 h V 60000 V h V 维 持, 采 用 胶 体 考 马 斯 亮 蓝 染 色, 能 获 得 分 辨 率 高 重 复 性 好 的 2-DE 图 谱 应 用 建 立 的 2-DE 方 法 和 PDQest 8.0 分 析 软 件, 发 现 26 个 与 正 常 番 鸭 肝 脏 蛋 白 表 达 水 平 超 过 3 倍 的 差 异 蛋 白 点 该 方 法 的 建 立 为 进 一 步 寻 找 NDRV 感 染 宿 主 组 织 相 关 蛋 白 以 及 水 禽 呼 肠 孤 病 毒 差 异 蛋 白 质 组 学 研 究 提 供 了 技 术 支 持 关 键 词 : 番 鸭 ; 肝 脏 ; 蛋 白 质 组 ; 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 中 图 分 类 号 :S852.65 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :2013-1350 Establishment of Two-dimensional Electrophoresis for Proteme of Liver from Muscovy Duck Experimentally Infected with Norvel Duck Reovirus Huang Meiqing 1,2, Zhu Guozhen 2,3, Chen Shilong 1,2, Zheng Min 1.2, Cheng Xiaoxia 1,2, Chen Shaoying 1,2 ( 1 Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center, Fuzhou 313; 2 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 313; 3 College of Animal Science, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 302) Abstract: The aim was to establish an efficient Two-Dimensional Electrophoresis (2-DE) ptotocol for proteomic method of livers from muscovy ducks which were experimentally infected with Norvel Duck Reovirus (NDRV). The conditions which included the reagent of Lysis buffer, amount of loaded protein and parameters of Isoelectric Focusing (IEF) were compared and optimized. The pathological changes in livers were simultaneously observed. The results showed that the livers with characteristic pathology were chosen to be the samples, which were from muscovy ducks at the fifth day after inoculated with NDRV. The high-resolution and good-repeatability 2-DE images were obtained with 1100 μg of liver protein samples which were extracted by Lysis-buffer, purified by 2D clean-up kit, separated by 2-DE under suitable electrophoresis parameters, and stained with colloidal Coomassie brilliant blue G-250 solution. Analyzed with the software PDQest 8.0, 26 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 水 禽 呼 肠 孤 病 毒 致 病 性 差 异 的 机 理 研 究 (31172334); 国 家 863 项 目 家 禽 病 毒 病 基 因 工 程 疫 苗 创 制 (2011AA10A209) 第 一 作 者 简 介 : 黄 梅 清, 女,1980 年 出 生, 福 建 福 州 人, 助 理 研 究 员, 硕 士, 从 事 预 防 兽 医 学 研 究 E-mail:meiqingmail@126.com 通 讯 作 者 : 陈 少 莺, 女,1962 年 出 生, 福 建 福 州 人, 研 究 员, 硕 士, 从 事 动 物 传 染 病 病 原 与 防 治 研 究 通 信 地 址 :313 福 建 省 福 州 市 晋 安 区 新 店 埔 党 村 省 农 科 院 牧 医 所,Tel:+86-591-87884914,E-mail:chensy58@163.com 收 稿 日 期 :2013-05-08, 修 回 日 期 :2013-08-15
20 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn differentially expressed proteins spots were detected between the NDRV-NP03 infected group and the mock-infected group, of which the expression levels were more than 3 times in expression level. The established 2-DE method would pave the way for the further study on the host cell protein and differential proteomic analysis of waterfowl reovirus. Key words: Muscovy Duck; liver; proteomic; Norvel Duck Reovirus 0 引 言 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 (Norvel Duck Reovirus,NDRV) 是 近 年 来 中 国 水 禽 新 发 疫 病 鸭 出 血 坏 死 性 肝 炎 的 病 原 [1-2] NDRV 有 别 于 番 鸭 呼 肠 孤 病 毒 (Muscovy Duck Reovirus,MDRV), 具 备 感 染 番 鸭 半 番 鸭 麻 鸭 和 樱 桃 谷 鸭 等 多 种 水 禽 的 特 性,NDRV 是 借 助 哪 些 功 能 蛋 白 的 改 变 从 而 获 得 感 染 多 种 不 同 宿 主 的 能 力, 本 项 目 研 究 组 拟 从 蛋 白 质 组 学 方 面 阐 释 NDRV 实 现 多 宿 主 致 病 的 机 制 蛋 白 质 组 学 研 究 的 三 大 技 术 核 心 是 双 向 电 泳 计 算 机 图 像 分 析 与 大 规 模 数 据 处 理 技 术 以 及 质 谱 技 术 双 向 凝 胶 电 泳 (Two-Dimensional Electrophoresis,2-DE) 是 目 前 唯 一 可 将 数 千 种 蛋 白 质 同 时 分 离 的 方 法,2-DE 技 术 联 合 质 谱 鉴 定 技 术 被 公 认 为 是 目 前 蛋 白 质 组 研 究 技 术 的 标 准 方 法 [3] 1956 年 [4] Smithies 等 提 出 了 2-DE 的 概 念 ;1975 年 意 大 利 生 化 学 家 O Farrell [5] 发 明 了 2-DE 技 术 ;1985 年 O Farrell 和 Klose 在 原 先 基 础 上 进 行 优 化 建 立 了 2-DE 技 术 2-DE 技 术 的 基 本 原 理 是 利 用 各 蛋 白 质 等 电 点 分 子 量 的 不 同, 通 过 第 一 向 等 电 聚 焦 (Isoelectric Focusing, IEF) 和 第 二 向 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE) 进 行 分 离, 得 到 可 反 映 蛋 白 质 的 等 电 点 分 子 量 含 量 和 种 类 的 二 维 图 谱 其 技 术 流 程 主 要 包 括 样 品 制 备, 第 一 向 IEF 及 胶 条 平 衡,SDS-PAGE, 蛋 白 检 测 与 图 像 扫 描 分 析 等 步 骤 2-DE 技 术 已 经 广 泛 地 应 用 于 医 学 农 业 和 微 生 物 学 等 研 究 领 域 在 动 物 医 学 方 面, 王 新 [6] [7] 洁 等 建 立 了 猪 肝 脏 蛋 白 质 组 2-DE 体 系 ; 徐 永 杰 等 [8] 建 立 了 猪 肌 肉 组 织 2-DE 的 分 离 条 件 ; 卢 占 军 等 建 立 并 优 化 了 雏 鸡 法 氏 囊 蛋 白 质 组 学 的 2-DE 体 系, 为 法 氏 囊 发 育 进 化 及 免 疫 功 能 的 研 究 提 供 了 新 技 术 和 方 法 ; [9] 王 郁 杨 等 提 取 了 人 工 感 染 新 城 疫 病 毒 的 鹅 的 脾 脏 蛋 白 并 进 行 了 2-DE, 初 步 分 析 了 差 异 蛋 白 表 达 点, 为 进 一 步 研 究 Ⅶ d 亚 型 新 城 疫 病 毒 对 水 禽 致 病 性 增 强 的 机 制 提 供 了 重 要 线 索 本 项 目 组 在 对 MDRV 和 NDRV 的 前 期 研 究 中 发 现 这 两 种 水 禽 呼 肠 孤 病 毒 在 致 病 性 致 细 胞 病 变 及 抗 原 性 都 有 差 异, 尤 其 是 NDRV 具 有 具 备 感 染 多 种 水 禽 的 特 性, 为 了 阐 明 NDRV 实 现 跨 宿 主 种 间 传 播 的 机 制, 本 研 究 建 立 了 人 工 感 染 NDRV 的 雏 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 组 2-DE 技 术 方 法, 该 方 法 的 建 立 为 进 一 步 寻 找 NDRV 感 染 宿 主 组 织 相 关 蛋 白 以 及 后 续 水 禽 呼 肠 孤 病 毒 差 异 蛋 白 质 组 学 研 究 提 供 了 技 术 支 持 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 和 病 毒 株 4 日 龄 健 康 番 鸭 购 自 莆 田 温 氏 公 司 NDRV-NP03 株 由 福 建 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所 动 物 病 毒 研 究 室 所 提 供 1.2 主 要 试 剂 IPG 胶 条 (24 cm Immobiline DryStrip) (ph 3-11) IPG buffer 尿 素 硫 脲 碘 乙 酰 胺 CHAPS DTT DeStreak 试 剂 2D clean-up 试 剂 盒 蛋 白 定 量 试 剂 盒 2-D Quant kit 均 购 自 GE Healthcare 公 司 ;Tris SDS 甘 氨 酸 丙 烯 酰 胺 过 硫 酸 铵 TEMED 购 自 Genview 公 司 ; 蛋 白 酶 抑 制 剂 Complete ULTRA mini EDTA-free EASYpack 购 自 Roche 公 司 ; 考 马 斯 亮 兰 G-250 购 自 SIGMA 公 司 ;PageRuler Prestained Protein Ladder 购 自 Thermo Scientific 公 司 ; 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 1.3 仪 器 Ettan IPGphor Ⅲ 等 电 聚 焦 系 统 Ettan IPGphor Manifold 胶 条 槽 Ettan DALTsix 大 型 垂 直 电 泳 系 统 MultiTemp(tm) Ⅲ 恒 温 循 环 水 浴 ImageScanner III 扫 描 仪 均 购 自 GE Healthcare 公 司 双 向 电 泳 凝 胶 图 像 分 析 软 件 PDQuest 8.0 购 自 Bio-RAD 公 司 1.4 番 鸭 肝 脏 的 采 集 44 只 4 日 龄 健 康 番 鸭 随 机 分 为 攻 毒 组 和 对 照 组, 每 组 22 只 攻 毒 组 番 鸭 每 羽 腿 肌 接 种 0.2 ml NDRV-NP03 株 细 胞 毒 ; 对 照 组 每 羽 腿 肌 注 射 0.2 ml Hank s 液 接 种 1 3 4 5 6 天 后, 每 组 随 机 剖 杀 3 只 并 无 菌 采 集 肝 脏, 同 时 观 察 记 录 病 理 变 化 采 集 的 肝 脏 用 预 冷 的 PBS 溶 液 冲 洗 3 遍, 去 除 组 织 的 血 液 体 液 等, 保 存 于 -70 冰 箱 中 1.5 蛋 白 样 品 制 备 将 采 集 的 肝 脏 用 -70 预 冷 的 研 钵 磨 成 粉 末, 加 入 10 ml 含 总 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 裂 解 液 溶 解, 然 后 进 行 超 声 波 处 理, 裂 解 5 次, 每 次 持 续 2 s, 间 隔 10 s, 室 温 下 放 置 30 min, 于 15 40000 g 离 心, 取 上 清 按 2D-clean Up Kit 试 剂 盒 方 法 纯 化 蛋 白, 用 2-D Quant Kit 蛋 白 定
黄 梅 清 等 : 感 染 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 的 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 方 法 的 建 立 21 量 试 剂 盒 测 定 蛋 白 浓 度, 分 装 至 Eppendof 管 中,-70 冰 箱 保 存 本 研 究 对 比 了 裂 解 液 I 和 II 的 双 向 电 泳 效 果, 其 他 条 件 一 致 裂 解 液 Ⅰ:7 mol/l 尿 素 2 mol/l 硫 脲 4% CHAPS 65 mmol/l DTT 40 mmol/l Tris-base 0.5% IPG buffer; 裂 解 液 Ⅱ:9.8 mol/l 尿 素 2 mol/l 硫 脲 4% CHAPS 65 mmol/l DTT 40 mmol/l Tris-base 0.5% IPG buffer 1.6 双 向 电 泳 的 建 立 1.6.1 第 一 向 IEF 选 择 24 cm Immobiline DryStrip (ph 3-11), 将 样 品 加 入 水 化 上 样 缓 冲 液 (7 mol/l 尿 素 2 mol/l 硫 脲 2%CHAPS 0.5%IPG buffer 0.002% 溴 酚 蓝 储 备 溶 液 0.012%DeStreak 试 剂 ), 上 样 总 体 积 为 450 μl, 上 样 后 进 行 第 一 向 IEF 聚 焦 温 度 20, 每 根 胶 条 限 流 50 μa 本 研 究 比 较 了 3 种 不 同 的 样 品 上 样 量 与 IEF 参 数, 其 他 条 件 一 致 A: 上 样 量 为 600 μg,ief 参 数 Ⅰ;B: 上 样 量 为 900 μg,ief 参 数 Ⅰ;C: 上 样 量 为 1100 μg,ief 参 数 Ⅱ IEF 参 数 Ⅰ Ⅱ 见 表 1 1.6.2 IPG 胶 条 的 平 衡 及 第 二 向 SDS-PAGE IEF 结 束 后,IPG 胶 条 于 平 衡 液 Ⅰ(1% DTT 6 mol/l 尿 素 75 mmol/l Tris-HCl ph 8.8 29.3% 甘 油 2% SDS 0.002% 溴 酚 蓝 ) 中 作 用 15 min, 然 后 转 入 平 衡 液 Ⅱ(4% 碘 乙 酰 胺 6 mol/l 尿 素 75 mmol/l Tris-HCl ph 8.8 29.3% 甘 油 2% SDS 0.002% 溴 酚 蓝 ) 中 作 用 15 min, 最 后 移 至 12% 的 丙 烯 酰 胺 均 一 凝 胶 中 进 行 垂 直 SDS-PAGE 电 泳 电 泳 条 件 :3 W/gel 电 泳 45 min 后, 48 W/gel 电 泳 约 4 h, 当 溴 酚 蓝 指 示 剂 到 达 玻 璃 板 底 部 约 1 cm 时 终 止 电 泳 1.6.3 凝 胶 染 色 与 图 像 分 析 电 泳 结 束 后 采 用 胶 体 考 马 步 骤 升 压 模 式 水 化 Step S1 Step S2 Step S3 Grad S4 Grad S5 Step S6 Step 表 1 等 电 聚 焦 参 数 IEF 参 数 Ⅰ IEF 参 数 Ⅱ 电 压 /V 50 200 1000 时 间 12 h 1.5 h 3 h 00 Vh 任 意 时 间 电 压 /V 50 200 1000 时 间 12 h 1.5 h 3 h 60000 Vh 任 意 时 间 斯 亮 蓝 染 色 方 法 进 行 染 色 步 骤 : 水 洗 凝 胶 3 次, 每 次 10 min 然 后 于 固 定 液 (40% 无 水 乙 醇 10% 冰 乙 酸 ) 中 固 定 过 夜, 同 样 水 洗 3 次 后, 于 胶 体 考 马 斯 亮 蓝 G-250 染 色 液 (10% 磷 酸 10% 硫 酸 铵 0.12% 考 马 斯 亮 蓝 G-250 20% 甲 醇 ) 中 染 色 过 夜, 最 后 水 洗 脱 色 至 背 景 清 晰 用 Image Scanner 扫 描 仪 透 射 扫 描, 分 辨 率 300 dpi 保 存 图 像 用 Bio-Rad 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 图 像 分 析 软 件 PDQest 8.0 对 图 像 进 行 分 析 2 结 果 与 分 析 2.1 雏 番 鸭 肝 脏 病 变 雏 番 鸭 攻 毒 试 验 共 进 行 了 7 天 在 攻 毒 后 第 3 天 肝 脏 出 现 少 量 不 规 则 斑 块 状 坏 死 和 出 血, 第 5 天 出 现 大 量 不 规 则 坏 死 和 出 血 斑 ( 见 图 1), 病 理 变 化 过 程 同 参 考 文 献 [2] 报 道 一 致 本 研 究 中 的 样 品 采 用 攻 毒 后 病 变 最 典 型 的 第 5 天 的 番 鸭 肝 脏 2.2 样 品 蛋 白 的 制 备 用 2-D Quant kit 蛋 白 定 量 试 剂 盒 测 定 蛋 白 浓 度, 以 480 nm 的 OD 值 为 横 坐 标, 牛 血 清 白 蛋 白 质 量 (µg) A B A: 对 照 组 的 番 鸭 肝 脏 ;B: 感 染 NDRV 的 番 鸭 肝 脏 图 1 人 工 感 染 NDRV 5 天 后 的 番 鸭 肝 脏
22 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 为 纵 坐 标, 得 到 标 准 曲 线 方 程 为 Y=-170.29X-1.82, 其 线 性 相 关 系 数 R 2 =0.994, 测 定 并 计 算 蛋 白 样 品 的 浓 度, 测 得 肝 脏 蛋 白 浓 度 均 在 5~10 mg/ml 内, 并 且 每 个 蛋 白 浓 度 均 互 相 接 近, 可 用 作 双 向 凝 胶 电 泳 的 分 离 2.3 不 同 裂 解 液 对 电 泳 结 果 的 影 响 不 同 裂 解 液 制 备 的 样 品, 用 同 样 的 上 样 量 IEF 参 数 及 操 作 方 法, 在 同 一 块 凝 胶 上 进 行 SDS-PAGE 电 泳, 结 果 见 图 2 由 图 中 可 见,15~40 kda 椭 圆 形 范 围 内 A 图 肉 眼 可 见 的 蛋 白 点 更 多 更 清 晰 ;40~170 kda 长 方 形 方 框 内 A 图 蛋 白 点 较 大 较 清 晰, 而 B 图 有 很 多 垂 直 条 纹, 蛋 白 点 没 有 分 开 ; 两 张 图 中 碱 性 端 对 比,B 边 图 像 有 明 显 的 水 平 拖 尾 因 此, 选 定 裂 解 液 Ⅰ(A 图 ) 的 配 方 (7 mol/l 尿 素 2 mol/l 硫 脲 4% CHAPS 65mmol/L DTT 40mmol/L Tris-base 0.5% IPG buffer) 作 为 样 品 制 备 的 裂 解 液 2.4 不 同 上 样 量 与 IEF 参 数 对 电 泳 结 果 的 影 响 采 用 3 种 不 同 上 样 量 和 IEF 参 数 进 行 2-DE 电 泳 的 图 谱 结 果 见 图 3, 可 见 图 C 获 得 的 蛋 白 质 点 数 最 多, 并 且 各 蛋 白 点 分 离 更 清 晰 ; 图 B 中 垂 直 条 纹 和 水 平 条 纹 明 显 比 图 C 多, 聚 焦 不 足 图 A 获 得 的 蛋 白 点 稀 少 因 此 选 定 图 C 方 法 建 立 NDRV 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 方 法, 即 上 样 量 为 1100 μg,ief 程 序 为 :50V 12 h 200V 1.5 h V 1000V V 3 h V 60000 Vh V 维 持 2.5 感 染 NDRV 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 组 2-DE 的 建 立 感 染 NDRV 5 天 后 的 番 鸭 肝 脏 与 对 照 组 正 常 番 鸭 肝 脏 按 照 以 上 建 立 的 方 法 进 行 2-DE, 重 复 3 次, 结 果 见 图 4 用 PDQest 8.0 软 件 进 行 图 像 差 异 比 对 分 析, 找 到 26 个 表 达 水 平 超 过 3 倍 的 差 异 蛋 白 点 A: 裂 解 液 Ⅰ 提 取 蛋 白 ;B: 裂 解 液 Ⅱ 提 取 蛋 白 图 2 不 同 裂 解 液 提 取 的 番 鸭 肝 脏 蛋 白 的 双 向 电 泳 图 谱
黄 梅 清 等 : 感 染 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 的 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 方 法 的 建 立 23 A: 上 样 量 为 600 μg,ief 参 数 Ⅰ;B: 上 样 量 为 900 μg,ief 参 数 Ⅰ;C: 上 样 量 为 1100 μg,ief 参 数 Ⅱ 图 3 不 同 上 样 量 和 IEF 参 数 的 2-DE 图 谱 A: 人 工 感 染 NDRV 组 ;B: 对 照 组 图 4 番 鸭 肝 脏 蛋 白 2-DE 图 谱 3 结 论 本 研 究 比 较 了 不 同 裂 解 液 样 品 上 样 量 和 一 向 IEF 参 数 对 电 泳 图 谱 的 影 响, 最 终 建 立 了 人 工 感 染 NDRV 的 番 鸭 肝 脏 2-DE 技 术 : 研 磨 - 超 声 - 裂 解 液 (7 mol/l 尿 素 2 mol/l 硫 脲 4% CHAPS 65 mmol/l DTT 40 mmol/l Tris-base 0.5% IPG buffer) 法 提 取 肝 脏 蛋 白 质, 结 合 2D clean-up kit 以 及 去 拖 尾 DeStreak 试 剂 纯 化 蛋 白,1100 μg 的 上 样 量, 设 置 IEF 参 数 为 :50 V 12 h 200 V 1.5 h V 1000 V V 3 h V 60000 V h V 维 持, 采 用 胶 体 考 马 斯 亮 蓝 染 色 应 用 该 技 术 发 现 26 个 与 正 常 番 鸭 肝 脏 蛋 白 质 表 达 水 平 超 过 3 倍 的 差 异 蛋 白 点, 这 些 蛋 白 点 的 变 化 可 能 是 病 毒 感 染 后 引 起 损 伤 肝 脏 的 代 谢 改 变 或 病 理 产 物, 改 变 了 参 与 炎 症 反 应 的 组 织 蛋 白 质 的 表 达 水 平 ; 也 有 可 能 是 病 毒 感 染 组 织 后, 肝 脏 组 织 发 生 病 变 引 起 组 织 蛋 白 质 的 修 饰 或 突 变 因 此, 下 一 步 试 验 将 把 差 异 蛋 白 点 进 行 质 谱 鉴 定, 分 析 生 物 学 功 能, 为 进 一 步 寻 找 NDRV 感 染 宿 主 组 织 相 关 蛋 白 以 及 后 续 水 禽 呼 肠 孤 病 毒 差 异 蛋 白 质 组 学 研 究 提 供 技 术 支 持 4 讨 论 蛋 白 质 的 样 品 制 备 是 2-DE 技 术 中 最 关 键 的 环 节 [10], 既 要 获 得 重 复 性 好 纯 度 高 的 蛋 白, 同 时 要 尽 量 减 少 提 取 过 程 中 蛋 白 的 损 失 要 获 得 组 织 内 的 总 蛋 白, 除 对 组 织 进 行 有 效 的 破 碎 外, 利 用 解 离 剂 表 面 活 性 剂 两 性 电 解 质 还 原 剂 等 成 分 可 以 实 现 蛋 白 的 有 效 溶 解 尿 素 是 裂 解 液 中 最 常 用 的 解 离 剂, 它 的 浓 度 是 蛋 白 质 提 取 及 2-DE 效 果 的 主 要 因 素 之 一, 不 同 样 品 需 要 摸 索 尿 素 的 最 佳 浓 度 本 研 究 比 较 了 7 mol/l 和 9.8 mol/l 的 尿 素 使 用 量, 结 果 表 明 : 尿 素 浓 度 为 7 mol/l 的 裂 解 液 适 用 于 番 鸭 肝 脏 总 蛋 白 的 提 取, 该 浓 度 的 使 [11] [12] 用 与 王 为 刚 等 提 取 拟 穴 青 蟹 卵 巢 刘 忠 华 等 提 取 [8] 鹅 肝 脏 卢 占 军 等 提 取 雏 鸡 法 氏 囊 所 使 用 的 尿 素 浓 [13] 度 一 致, 而 王 珊 珊 等 用 8 mol/l 尿 素 提 取 黄 瓜 根 系 [14] 李 翠 云 等 用 9.8 mol/l 尿 素 提 取 海 滨 木 槿 叶 片 蛋 白 质 能 得 到 较 好 的 图 谱 效 果, 由 此 表 明 提 取 动 物 组 织 蛋 白 质 使 用 尿 素 浓 度 7 mol/l 的 裂 解 液 较 为 适 合 本 研
24 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 究 中 用 2D clean-up 试 剂 盒 处 理 样 品, 有 效 地 去 除 了 样 品 中 的 盐 类 物 质, 减 少 了 2-DE 垂 直 条 纹 及 水 平 拖 尾 现 象, 得 到 了 较 好 的 2-DE 图 谱, 证 实 了 GE Healthcare 公 [15] [16] [17] 司 关 于 该 产 品 的 描 述, 与 王 隆 柏 李 丽 梅 何 犇 等 关 于 2D Clean-Up 试 剂 盒 的 试 验 结 果 一 致 样 品 上 样 量 是 影 响 2-DE 的 重 要 因 素, 上 样 量 太 低, 不 利 于 低 丰 度 蛋 白 质 的 检 测 ; 上 样 量 过 高, 会 使 高 丰 度 蛋 白 点 过 大, 掩 盖 了 低 丰 度 蛋 白, 不 利 于 后 期 分 析, 同 时 可 能 在 聚 焦 的 过 程 中 部 分 蛋 白 在 胶 条 槽 中 凝 固 沉 淀, 堵 塞 凝 胶 孔 径, 影 响 一 向 IEF IEF 参 数 设 置 的 合 理 与 否 则 直 接 关 系 到 蛋 白 的 分 离 效 果 [18], 聚 焦 时 间 过 长 或 太 短 都 会 使 蛋 白 点 出 现 横 条 纹, 低 电 压 除 盐 不 充 分, 会 导 致 聚 焦 时 不 能 达 到 最 高 电 压, 蛋 白 质 得 不 到 较 好 的 分 离 样 品 上 样 量 的 选 择 还 与 IPG 胶 条 的 长 度 及 凝 胶 染 色 方 法 密 切 相 关, 胶 条 越 长, 检 测 出 的 斑 点 越 多, 蛋 白 质 的 选 取 与 鉴 别 也 越 容 易, 为 了 获 得 样 品 的 最 大 的 分 辨 率 和 载 样 量, 本 研 究 采 用 24 cm 胶 条 本 研 究 第 二 向 电 泳 结 束 凝 胶 染 色 采 用 胶 体 考 马 斯 亮 蓝 染 色 方 法, 该 方 法 灵 敏 度 高, 可 检 测 低 至 100 ng 的 蛋 白 点 [19], 比 硝 酸 银 染 色 操 作 更 简 单, 定 量 更 准 确, 与 质 谱 兼 容 根 据 GE Healthcare 公 司 的 蛋 白 质 双 向 电 泳 操 作 手 册 中 对 于 24 cm 胶 条 胶 体 考 马 斯 亮 蓝 染 色 方 法 推 荐 的 上 样 量, 本 研 究 比 较 了 600 900 1100 μg 这 3 个 不 同 的 上 样 量, 结 合 IEF 参 数 设 置 摸 索 了 番 鸭 肝 脏 2-DE 最 佳 的 上 样 量 与 IEF 参 数, 结 果 表 明 当 上 样 量 为 1100 μg, 电 压 V 聚 焦 时 间 延 长 至 60000 Vh 时, 获 得 了 较 好 的 分 离 效 果, 蛋 白 质 点 数 多 分 离 清 晰, 与 李 翠 云 等 报 道 的 选 用 24 cm 胶 条 1000 μg 上 样 量 采 用 胶 条 考 马 斯 亮 蓝 染 色 方 法 基 本 一 致 [14] 本 研 究 获 得 的 电 泳 图 谱 中 酸 性 端 出 现 了 水 平 条 纹 且 有 蛋 白 质 聚 集 团 状, 可 能 是 由 于 存 在 过 载 的 高 丰 度 蛋 白 使 蛋 白 聚 集, 从 而 导 致 部 分 蛋 白 在 等 电 点 沉 淀, 引 起 水 平 条 纹 在 高 分 子 区 域 和 碱 性 端 出 现 垂 直 条 纹, 并 且 碱 性 端 有 水 平 条 纹 有 许 多 因 素 能 导 致 垂 直 条 纹 的 产 生, 主 观 因 素 如 平 衡 溶 液 配 制 不 当 或 者 平 衡 不 充 分 ; 电 泳 时 间 过 长 ; 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 储 存 温 度 过 低 或 者 使 用 之 前 没 有 回 复 到 室 温, 可 能 导 致 SDS 沉 淀, 蛋 白 出 现 垂 直 条 纹 等 本 研 究 中 采 用 了 多 种 方 法 避 免 垂 直 条 纹 的 产 生, 如 SDS-PAGE 快 速 电 泳, 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 在 使 用 前 两 小 时 新 鲜 配 制, 结 果 仍 然 在 高 分 子 区 域 和 碱 性 端 出 现 垂 直 条 纹, 可 能 是 由 于 蛋 白 未 被 SDS 充 分 包 裹, 之 前 考 虑 延 长 平 衡 时 间 使 SDS 充 分 包 裹 蛋 白, 但 是 平 衡 时 间 延 长 会 损 失 一 些 小 的 多 肽 (<15 kda), 因 此 本 研 究 中 每 次 平 衡 时 间 仍 为 15 min 2-DE 技 术 中 蛋 白 质 巯 基 的 非 特 异 性 氧 化 反 应 也 是 一 个 常 见 问 题, 尤 其 是 在 ph 值 >7 的 情 况 下, 经 常 表 现 为 水 平 拖 尾 和 多 余 的 斑 点 因 此 本 研 究 使 用 了 GE Healthcare 公 司 的 去 拖 尾 DeStreak 试 剂, 减 少 了 由 蛋 白 质 氧 化 所 产 生 的 斑 点, 获 得 了 较 好 的 电 泳 图 谱 参 考 文 献 [1] 陈 少 莺, 陈 仕 龙, 林 锋 强, 等. 一 种 新 的 鸭 病 ( 暂 名 鸭 出 血 性 坏 死 性 肝 炎 ) 病 原 学 研 究 初 报 [J]. 中 国 农 学 通 报,2009,25(16):28-31. [2] 陈 仕 龙, 陈 少 莺, 程 晓 霞, 等. 新 型 鸭 呼 肠 孤 病 毒 分 离 株 的 致 病 性 研 究 [J]. 西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版,2010,38(4):14-18. [3] Gorg A, Weiss W, Dunn M J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics[j].proteomics,2004,4 (12):3665-3685. [4] Smithies O, Poulik M D. Comparison and combination of the starch-gel and filter-paper electrophoretic methods applied to human sera: two-dimension electrophoresis[j].nature,1956,68(4): 636-643. [5] O Farrell P H. High resolution two-dimensional gel electrophoresis of proteins[j].j Biol Chem,1975,(10),250:4007-4021. [6] 王 新 洁, 韩 剑 众, 曲 道 峰, 等. 猪 肝 脏 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 体 系 的 建 立 及 优 化 [J]. 肉 类 研 究,2011,11(25):1-5. [7] 徐 永 杰, 熊 远 著. 猪 肌 肉 组 织 双 向 电 泳 分 离 条 件 的 建 立 及 常 见 问 题 分 析 [J]. 农 业 生 物 技 术 学 报,2012,20(1):105-112. [8] 卢 占 军, 秦 爱 建, 陈 欣 虹, 等. 雏 鸡 法 氏 囊 蛋 白 质 组 学 双 向 电 泳 技 术 的 建 立 及 其 初 步 分 析 [J]. 畜 牧 兽 医 学 报,2009,40(6):944-951. [9] 王 郁 杨, 开 妍, 段 志 强, 等. 新 城 疫 病 毒 人 工 感 染 鹅 脾 脏 差 异 表 达 蛋 白 质 组 初 步 分 析 [J]. 畜 牧 兽 医 学 报,2012,43(7):1088-1095. [10] Rabilloud T. Solubilization of proteins in 2-D eletrophoresis[j].an outline,methods Mol Biol,1999:112(9):9-19. [11] 王 为 刚, 王 艺 磊, 张 子 平, 等. 拟 穴 青 蟹 卵 巢 蛋 白 质 双 向 电 泳 的 样 品 制 备 方 法 [J]. 水 产 科 学,2011,30(6):352-355. [12] 刘 忠 华, 杨 晓 勤, 张 军, 等. 鹅 肝 脏 蛋 白 质 提 取 与 双 向 电 泳 分 离 技 术 研 究 [J]. 中 国 家 禽,2011,33(21):30-32. [13] 王 珊 珊, 郝 宇 涵, 任 婧 祺, 等. 黄 瓜 根 系 蛋 白 质 组 分 析 的 双 向 电 泳 技 术 条 件 优 化 [J]. 沈 阳 农 业 大 学 学 报,2012,43(2):233-236. [14] 李 翠 云, 姜 彦 成, 乔 桂 荣, 等. 海 滨 木 槿 叶 片 蛋 白 质 双 向 电 泳 体 系 的 建 立 [J]. 西 南 林 业 大 学 学 报,2012,32(4):30-35. [15] 王 隆 柏, 王 晨 燕, 吴 学 敏, 等. 高 致 病 性 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 方 法 的 建 立 与 优 化 [J].2012,34(5):365-369. [16] 李 丽 梅, 王 秀 梅.HepG2 细 胞 蛋 白 质 组 双 向 电 泳 条 件 的 优 化 与 图 谱 的 建 立 [J]. 内 蒙 古 医 学 杂 志,2011,43(5):527-529. [17] 何 犇, 唐 伟, 罗 华 铭, 等. 精 索 静 脉 曲 张 不 育 患 者 精 子 蛋 白 质 双 向 电 泳 技 术 的 建 立 与 优 化 [J]. 重 庆 医 科 大 学 学 报,2012,37(2):143-146. [18] Nagalla S R, Canick J A, Jacob T, et al. Proteomic analysis of maternal serum in down syndrome: identification of novel protein biomarkers[j].j Proteome Res,2007,6(4):1245-1257. [19] Dyballa N, Metzger S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels [J].J Vis Exp, 2009,30:1431.