学 校 编 码 :10384 分 类 号 密 级 学 号 :21620071151919 UDC 硕 士 学 位 论 文 Pygo2 转 基 因 小 鼠 模 型 的 建 立 及 表 型 分 析 Establishment and phenotype analysis of a Pygo2 transgenic mouse model 李 超 指 导 教 师 姓 名 : 李 博 安 教 授 专 业 名 称 : 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 论 文 提 交 日 期 :2010 年 4 月 论 文 答 辩 时 间 :2010 年 6 月 学 位 授 予 日 期 : 2010 年 4 月 答 辩 委 员 会 主 席 : 评 阅 人 :
厦 门 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 呈 交 的 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 指 导 下, 独 立 完 成 的 研 究 成 果 本 人 在 论 文 写 作 中 参 考 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 的 研 究 成 果, 均 在 文 中 以 适 当 方 式 明 确 标 明, 并 符 合 法 律 规 范 和 厦 门 大 学 研 究 生 学 术 活 动 规 范 ( 试 行 ) 另 外, 该 学 位 论 文 为 ( 发 育 与 肿 瘤 细 胞 生 物 学 ) 课 题 ( 组 ) 的 研 究 成 果, 获 得 ( ) 课 题 ( 组 ) 经 费 或 实 验 室 的 资 助, 在 ( ) 实 验 室 完 成 ( 请 在 以 上 括 号 内 填 写 课 题 或 课 题 组 负 责 人 或 实 验 室 名 称, 未 有 此 项 声 明 内 容 的, 可 以 不 作 特 别 声 明 ) 声 明 人 ( 签 名 ): 年 月 日
厦 门 大 学 学 位 论 文 著 作 权 使 用 声 明 本 人 同 意 厦 门 大 学 根 据 中 华 人 民 共 和 国 学 位 条 例 暂 行 实 施 办 法 等 规 定 保 留 和 使 用 此 学 位 论 文, 并 向 主 管 部 门 或 其 指 定 机 构 送 交 学 位 论 文 ( 包 括 纸 质 版 和 电 子 版 ), 允 许 学 位 论 文 进 入 厦 门 大 学 图 书 馆 及 其 数 据 库 被 查 阅 借 阅 本 人 同 意 厦 门 大 学 将 学 位 论 文 加 入 全 国 博 士 硕 士 学 位 论 文 共 建 单 位 数 据 库 进 行 检 索, 将 学 位 论 文 的 标 题 和 摘 要 汇 编 出 版, 采 用 影 印 缩 印 或 者 其 它 方 式 合 理 复 制 学 位 论 文 本 学 位 论 文 属 于 : ( )1. 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 查 核 定 的 保 密 学 位 论 文, 于 年 月 日 解 密, 解 密 后 适 用 上 述 授 权 ( )2. 不 保 密, 适 用 上 述 授 权 ( 请 在 以 上 相 应 括 号 内 打 或 填 上 相 应 内 容 保 密 学 位 论 文 应 是 已 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 定 过 的 学 位 论 文, 未 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 定 的 学 位 论 文 均 为 公 开 学 位 论 文 此 声 明 栏 不 填 写 的, 默 认 为 公 开 学 位 论 文, 均 适 用 上 述 授 权 ) 声 明 人 ( 签 名 ): 年 月 日
目 录 目 录 摘 要...1 Abstract...2 第 一 章 绪 论...3 1.1 Wnt 信 号 通 路 研 究 的 概 述...3 1.1.1 引 言...3 1.1.2 Wnt 信 号 通 路 的 分 类...3 1.1.3 经 典 Wnt 信 号 通 路...3 1.1.4 经 典 Wnt 信 号 通 路 的 生 物 学 作 用...4 1.2 Pygo 的 研 究 进 展...6 1.2.1 Pygo 的 发 现...6 1.2.2 Pygo 的 结 构...6 1.2.3 Pygo 与 Wg/Wnt 信 号 通 路...7 1.2.4 Pygo 与 非 Wg/Wnt 信 号 通 路...8 1.2.5 Pygo 的 生 物 学 功 能...8 1.3 小 鼠 相 关 的 研 究 概 述...10 1.3.1 转 基 因 小 鼠 的 研 究...10 1.3.2 毛 囊 的 研 究 进 展...12 1.3.3 小 鼠 乳 腺 的 研 究 进 展...14 1.4 本 课 题 研 究 的 主 要 目 的 内 容 和 意 义...18 第 二 章 材 料 与 方 法...19 2.1 常 用 药 品 和 试 剂...19 2.2 细 胞 株, 菌 株 和 质 粒...19 2.3 实 验 方 法...19 2.3.1 基 因 相 关 实 验 方 法...19 2.3.2 蛋 白 质 相 关 实 验 方 法...24 I
目 录 2.3.3 细 胞 相 关 实 验 方 法...25 2.3.4 小 鼠 相 关 实 验 方 法...28 第 三 章 结 果 和 讨 论...33 3.1 结 果...33 3.1.1 Pygo2 基 因 克 隆 及 转 基 因 载 体 构 建 制 备...33 3.1.2 Pygo2 转 基 因 载 体 的 构 建 及 转 基 因 小 鼠 的 获 得...35 3.1.3 出 生 小 鼠 PCR 的 检 测...35 3.1.4 Pygo2 转 基 因 小 鼠 western 的 检 测 结 果...36 3.1.5 转 基 因 小 鼠 的 传 代 情 况...37 3.1.6 Pygo2 转 基 因 小 鼠 免 疫 组 化 的 结 果 分 析...37 3.1.7 转 基 因 小 鼠 的 表 型 分 析...39 3.2 讨 论...44 3.2.1 Pygo2 与 毛 囊 发 育 之 间 的 关 系...44 3.2.2 Pygo2 和 小 鼠 乳 腺 发 育 之 间 的 关 系...45 3.2.4 Pygo2 与 乳 腺 癌 研 究 之 间 的 关 系...46 展 望...49 参 考 文 献...50 主 要 缩 略 语 及 英 文 对 照...55 致 谢...56 II
TABLE OF CONTENT TABLE OF CONTENT ABSTRACT (IN CHINESE)...1 ABSTRACT (IN CHINESE)...2 CHAPTER 1 Introduction...3 1.1 Review on Wnt signaling...3 1.1.1 Introduction...3 1.1.2 Classification of Wnt signaling pathway...3 1.1.3 Canonical Wnt signaling...3 1.1.4 Biological fuctions of Canonical Wnt signaling...4 1.2 Review on Pygo...6 1.2.1 Identification of Pygo...6 1.2.2 Molecular structure of Pygo...6 1.2.3 Biological fuctions of Pygo in Wg/Wnt signaling...7 1.2.4 Biological fuctions of Pygo in non-wg/wnt signaling...8 1.2.5 Biological fuctions of Pygo...8 1.3 Review on Mouse...10 1.3.1 reviewon transgenic mice...10 1.3.2 Review on hair follicles...12 1.3.3 Review on mouse mammary gland...14 1.4 Aims, contents and siganificance of this projects...18 CHARPTER 2 Materials and Methods...19 2.1 Chemicals and reagents...19 2.2 Cell line, E.coli and plasmids...19 2.3 methods...19 2.3.1 DNA work...19 2.3.2 Protein work...24 2.3.3 Cell work...25 2.3.4 Mice work...28 CHAPTER 3 Results and Disscusion...33 3.1 Results...33 III
TABLE OF CONTENT 3.1.1 Pygo2 Gene Clone, construction of K14-2 flag-pygo2...33 3.1 2 Transgenic Mice Production...35 3.1.3 detection results of Pygo2 transgenic mice by western...35 3.1.4 The result of western bolting in Pygo2 transgenic mice...36 3.1.5 Breeding of transgenic mice...37 3.1.6 Pygo2 transgenic mice immunohistochemical analys...37 3.1.7 Transgenic mice phenotype...39 3.2 Disscussion...44 3.2.1 Pygo2 and development of hair follicles...44 3.2.2 Pygo2 and development of mammary gland...45 3.2.4 Pygo2 and breast cancer...46 PROSPECTS...49 REFERENCE...50 ABBREVIATONS...55 ACKNOWLEDGEMENT...56 IV
摘 要 摘 要 Wnt 经 典 信 号 通 路 是 胚 胎 和 成 体 发 育 过 程 中 的 一 个 关 键 的 信 号 传 导 通 路, 参 与 细 胞 的 增 殖 分 化 凋 亡 等 基 本 过 程, 控 制 多 种 细 胞 的 命 运 Pygopus(Pygo) 是 Wnt 经 典 信 号 通 路 中 的 组 分, 具 有 保 守 的 PHD(Plant homology domain) 和 NHD( N-terminal homology domain) 结 构 域,PHD 可 以 通 过 与 BCL9/Legless 的 连 接, 而 与 Wnt 经 典 信 号 通 路 的 关 键 因 子 β-catenin 相 互 作 用, 通 过 NHD 调 控 靶 基 因 转 录, 进 而 在 Wnt 经 典 信 号 通 路 中 发 挥 功 能 为 了 进 一 步 了 解 Pygo 在 复 杂 生 物 整 体 中 的 功 能, 研 究 Pygo 在 众 多 的 基 因 彼 此 相 互 关 联 相 互 影 响 的 机 体 中 的 功 能 及 调 控 规 律 本 文 建 立 Pygo2 转 基 因 小 鼠 模 型 并 观 察 分 析 其 表 型 首 先 通 过 构 建 K14-2 flag-pygo2 的 转 基 因 构 件, 导 入 小 鼠 早 期 胚 胎, 建 立 Pygo2 转 基 因 小 鼠 在 对 转 Pgyo2 基 因 小 鼠 系 的 繁 育 和 研 究 中, 发 现 转 基 因 阳 性 小 鼠 中, 肉 眼 可 以 观 察 到 部 分 成 体 小 鼠 的 皮 肤 组 织 出 现 囊 肿 溃 烂, 取 这 部 分 皮 肤 进 行 石 蜡 切 片, 用 HE 染 色 观 察 基 本 形 态 结 构, 发 现 转 基 因 的 小 鼠 毛 囊 发 育 异 常, 出 现 毛 囊 增 生, 毛 囊 囊 肿, 以 及 毛 囊 生 长 方 向 的 错 乱 ; 同 时 乳 腺 组 织 比 野 生 型 小 鼠 早 熟, 乳 腺 形 成 肿 瘤 的 几 率 也 比 野 生 型 大 ; 通 过 免 疫 组 化 对 小 鼠 乳 腺 祖 细 胞 marker 分 子 K6 进 行 分 析, 发 现 转 基 因 小 鼠 K6 的 表 达 较 野 生 型 强, 此 外, 通 过 流 式 细 胞 术 分 析 原 代 细 胞, 证 实 转 Pygo2 基 因 小 鼠 的 干 细 胞 比 例 比 野 生 型 小 鼠 的 高, 证 实 Pygo2 与 乳 腺 细 胞 的 增 殖 有 关 所 有 这 些 结 果 表 明,Pygo2 在 小 鼠 皮 肤 和 乳 腺 的 发 育 以 及 乳 腺 肿 瘤 形 成 中 都 起 着 非 常 重 要 的 作 用 关 键 词 :Pygo;Wnt; 转 基 因 小 鼠 ; 乳 腺 ; 表 型 1
Abstract Abstract Wnt/β-catenin signaling controls animal development both in embryo and adult, and plays a significant role in determining cell fate, growth, differentiation, and apoptosis. Pygopus (Pygo) is a new component of Wnt signaling with a conserved PHD finger that binds to Legless/BCL9, the adaptor between pygo and β-catenin and a conserved NHD which is generally thought to participate in Wnt target gene transactivation. In order to further understand its functions in complex organisms, we have established a transgenic mouse model of Pygo2. K14-2 flag-pygo2 was constructed and linearized, then transduced it into the early mouse embryos and finally the Pygo2 transgenic mice were obtained. Phenotypic analysis showed that many cysts and sores appeared on the skin in some adult mice. Morphologic observation of the skin sections indicated that the transgenic mice turned up phenotypes of follicular hyperplasia, follicular cysts and the misorientation of follicle growth. Meanwhile, the transgenic mice were found to have matured mammary tissues than the wild type littermates and some of the transgenic mice finally developed mammary tumors. Immunohistochemistry results showed that the expression of the progenitor cell marker K6 in transgenic mice was higher than that of in wild type mice. When the primary cultured mammary gland cells were analyzed by FACS assay, a statistically significant difference in the population of the stem/progenitor cells between wild type and TG mice was observed. All these results suggest that Pygo2 might play an important role in skin and mammary gland development and mammary tumorigenesis. Key words: Pygo2; transgenic mouse; mammary gland;phenotype 2
绪 论 第 一 章 绪 论 1.1 Wnt 信 号 通 路 研 究 的 概 述 1.1.1 引 言 信 号 通 路 是 指 能 将 细 胞 外 的 分 子 信 号 传 入 细 胞 内 并 发 挥 效 应 的 一 系 列 酶 促 反 应 通 路, 是 生 物 体 内 的 信 号 系 统 Wnt 信 号 通 路 ( 果 蝇 中 的 Wg 信 号 通 路 ) 是 一 条 十 分 保 守 的 信 号 传 导 通 路, 在 动 物 发 育 和 组 织 形 成 后 的 动 态 平 衡 中, 具 有 重 要 的 功 能 [1,2] 对 果 蝇 胚 胎 发 育 的 研 究 中 发 现 了 无 翅 基 因 (wingless) [3] 随 后 对 小 鼠 乳 腺 肿 瘤 病 毒 的 研 究 中 发 现 了 病 毒 整 合 激 活 的 癌 基 因 即 为 整 合 基 因 (int) [4] 之 后, 研 究 证 明 果 蝇 的 [4, int 基 因 就 是 wingless, 因 此 将 两 个 基 因 统 一 命 名 为 Wnt 基 因 家 族 5] 近 年 来, Wnt 信 号 通 路 越 来 越 成 了 研 究 的 热 点 之 一 1.1.2 Wnt 信 号 通 路 的 分 类 根 据 下 游 效 应 基 因 的 不 同,Wnt 信 号 通 路 可 以 分 为 经 典 的 Wnt/β-catenin 信 号 通 路 (canonical Wnt/β-catenin pathway) 和 非 经 典 的 Wnt 信 号 通 路 : 细 胞 平 面 极 性 通 路 (Wnt/PCP planar cell polarity pathway) 和 Wnt/Ca 2+ 信 号 通 路 经 典 的 Wnt 信 号 转 导 通 路 : 通 过 β-catenin 核 易 位, 激 活 靶 基 因 的 转 录 活 性 ; 细 胞 平 面 极 性 通 路 (PCP 通 路 ): 涉 及 RhoA 蛋 白 和 Jun 激 酶, 主 要 控 制 胚 胎 的 发 育 时 间 和 空 间 在 细 胞 水 平 上, 此 通 路 通 过 重 排 细 胞 骨 架 来 调 控 细 胞 极 性 ;Wnt/ Ca 2+ 通 路 : 此 通 路 可 诱 导 细 胞 内 Ca 2+ 浓 度 增 加 并 激 活 Ca 2+ 敏 感 的 信 号 转 导 组 分, 如 钙 调 蛋 白 敏 感 的 蛋 白 磷 酸 酶 依 赖 钙 调 蛋 白 的 蛋 白 激 酶 Ⅱ 和 活 化 T 细 胞 核 因 子 NF2AT Wnt/Ca 2+ 通 路 和 经 典 Wnt 信 号 转 导 通 路 相 互 作 用, 但 此 通 路 在 动 物 中 是 否 保 守 以 及 在 肿 瘤 发 生 中 是 否 有 意 义 目 前 还 不 清 楚 1.1.3 经 典 Wnt 信 号 通 路 经 典 的 Wnt 信 号 通 路 是 胚 胎 和 成 体 发 育 过 程 中 的 一 个 关 键 性 的 信 号 传 导 通 路 在 没 有 Wnt 信 号 的 情 况 下, 由 Axin APC GSK3beta 等 组 成 的 降 解 复 合 体 (destruction complex) 持 续 降 解 胞 浆 内 的 β-catenin, 使 β-catenin 蛋 白 保 持 在 较 低 水 平 当 细 胞 接 受 Wnt 信 号 时,Wnt 信 号 传 导 至 膜 上, 通 过 与 跨 膜 的 Wnt [6] 3
绪 论 受 体 ( 如 Frizzled 等 ) 结 合, 并 使 得 Dsh 结 合 Axin 而 破 坏 Axin APC GSK3beta 组 成 的 降 解 复 合 体, 从 而 使 胞 浆 内 的 GSK-3 散 失 对 β-catenin/armadillo 的 磷 酸 化 作 用, 当 胞 浆 内 的 β-catenin/armdillo 聚 集 到 一 定 程 度 后, 进 入 细 胞 核, 与 TCF/LEF 结 合 调 节 DNA 转 录, 激 活 Wnt 信 号 通 路 的 下 游 靶 基 因, 控 制 细 胞 行 为 这 整 个 过 程 需 要 多 种 蛋 白 共 同 协 助 完 成 图 1.1 经 典 Wg/Wnt 信 号 通 路 示 意 图, 左 图 为 无 Wnt 信 号 刺 激 时 ; 右 图 为 有 Wnt 信 号 刺 激 时 Figure1.1 Schematic of canonical Wg/Wnt signaling In the absence of Wnt signaling(left panel)in the presence of Wnt signaling (right panel) 1.1.4 经 典 Wnt 信 号 通 路 的 生 物 学 作 用 已 知 经 典 Wnt 信 号 通 路 和 大 量 组 织 的 发 育 及 疾 病 过 程 相 关, 如 骨 骼 脑 眼 睛 皮 肤 心 脏 等 [7,8] 在 皮 肤 和 肺 的 发 育 过 程 中, 它 主 要 和 细 胞 命 运 的 决 定 有 关 [9,11], 而 肠 道 和 淋 巴 结 的 发 育 中, 主 要 和 干 细 胞 / 祖 细 胞 的 增 殖 及 分 化 相 关 [2,12] 在 发 育 过 程 中, 胚 胎 干 细 胞 的 自 我 更 新 及 分 化 与 Wnt 信 号 通 路 中 的 许 多 基 因 相 关 如 : 通 过 敲 除 APC 而 持 续 激 活 Wnt 经 典 信 号 通 路 可 以 促 进 维 持 胚 胎 干 细 胞 4
绪 论 的 未 分 化 状 态 [13] 而 在 胚 胎 中 过 量 表 达 Wnt-1 或 持 续 表 达 β-catenin 可 阻 止 神 经 元 分 化, 并 激 活 Wnt 信 号 通 路 的 靶 基 因 c-myc 和 cyclind1 从 而 促 进 细 胞 的 自 我 更 新 [14,15] 在 消 化 系 统 中,β-catenin/TCF 复 合 体 可 以 影 响 隐 窝 细 胞 细 胞 周 期 G1 期 的 进 程, 从 而 调 控 肠 上 皮 细 胞 增 殖 和 分 化 的 平 衡 [2] 在 毛 囊 发 育 中, 敲 除 β-catenin 会 引 起 毛 囊 发 育 的 停 止, 即 使 在 毛 囊 发 育 完 成 后 敲 除 β-catenin, 毛 发 生 长 也 无 法 生 长, 而 且 β-catenin 的 敲 除 还 会 干 扰 干 细 胞 的 分 化, 影 响 细 胞 的 分 化 命 运, 使 得 皮 肤 毛 囊 缺 失, 表 皮 干 细 胞 却 增 多 另 外,Tcf-3 的 阻 断 可 以 促 进 毛 发 生 长 而 抑 制 上 皮 方 向 的 发 育,lef1 则 阻 碍 毛 发 生 长, 促 进 皮 脂 腺 和 角 质 细 胞 的 生 长 [10] 在 对 成 体 海 马 区 皮 质 增 殖 的 研 究 中 发 现, 阻 断 Wnt 信 号, 增 殖 会 受 到 严 重 影 响, 表 明 Wnt 经 典 信 号 是 成 体 海 马 神 经 形 成 的 要 调 节 器 [16] 而 β-catenin 在 维 持 神 经 干 细 胞 增 殖 从 而 在 大 脑 发 育 以 及 维 持 大 脑 皮 质 正 常 结 构 上 具 有 重 要 的 意 义 [17] 另 外 GSK-3 也 参 与 了 成 体 神 经 干 细 胞 的 分 化 以 及 细 胞 的 存 活, 抑 制 GSK-3 则 可 以 促 进 神 经 元 分 化, 激 活 β-catenin 下 游 靶 基 因 的 转 录, 减 少 细 胞 凋 亡 [18] 在 肿 瘤 的 研 究 中, 发 现 Wnt 经 典 信 号 通 路 的 调 控 失 常 是 多 种 类 型 细 胞 发 生 癌 变 的 主 要 原 因 之 一 目 前 发 现 的 大 量 调 节 细 胞 增 殖 分 化 肿 瘤 发 生 的 基 因 是 受 Wnt 经 典 信 号 通 路 转 录 调 控 的, 例 如 c-myc 和 cyclind1, 这 两 个 Wnt 经 典 信 号 通 路 的 靶 基 因 都 能 在 细 胞 周 期 中 加 速 G1/S 期 的 进 程 [19] Wnt 经 典 信 号 通 路 中 任 何 一 部 分 发 生 障 碍, 如 抑 癌 基 因 Axin,APC 发 生 隐 性 突 变,β-catenin 自 身 突 变 等, 均 会 使 β-catenin 在 细 胞 内 大 量 富 集, 导 致 Wnt 经 典 信 号 通 路 的 不 恰 当 激 活, 引 发 肿 瘤 的 产 生 [20, 21] 此 外, 许 多 在 肿 瘤 细 胞 生 长 中 起 着 重 要 作 用 的 生 长 因 子 也 是 Wnt 信 号 通 路 的 靶 基 因, 如 受 Wnt 信 号 通 路 正 调 控 的 VEGF [22] 而 非 直 接 作 用 靶 基 因 P21 则 可 以 和 Myc 基 因 协 同 作 用 控 制 细 胞 的 增 殖 和 分 化 状 态 此 外, 研 究 还 认 为 Wnt 经 典 信 号 通 路 在 肿 瘤 干 细 胞 自 我 维 持 过 程 中 起 了 重 要 作 用 而 肿 瘤 的 耐 药 学 说 认 为 肿 瘤 的 生 长 是 源 于 少 量 的 肿 瘤 干 细 胞 (TSC,Tumor Stem Cell) 肿 瘤 干 细 胞 是 具 有 自 我 更 新 能 力 和 分 化 潜 能 的 细 胞, 被 认 为 是 肿 瘤 异 常 增 殖 侵 袭 转 移 耐 药 以 及 复 发 的 根 源 这 些 肿 瘤 干 细 胞 由 于 不 能 被 有 效 的 治 疗 方 法 杀 灭, 成 为 肿 瘤 复 发 的 根 源 因 此,Wnt 经 典 信 号 通 路 作 为 肿 瘤 形 成 [23] 5
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