VERSA 100 Mini PCR 用 于 自 动 实 时 定 量 PCR 反 应 体 系 的 建 立 PCR 技 术 通 常 是 定 性 检 测 特 定 RNA 与 DNA 序 列 的 常 规 方 法 而 现 在, 实 时 定 量 PCR 技 术 已 经 越 来 越 成 熟, 在 病 原 体 检 测 领 域 中 有 突 出 的 优 势, 并 已 在 医 疗 诊 断 领 域 中 崭 露 头 角 实 时 定 量 PCR 技 术 主 要 是 利 用 标 记 有 荧 光 染 料 的 特 异 性 探 针, 在 PCR 过 程 中 与 目 标 序 列 发 生 特 异 性 结 合 并 在 Taq 酶 作 用 下 发 生 水 解, 而 使 检 测 荧 光 的 强 度 发 生 变 化 这 些 变 化 将 用 于 监 测 反 应 进 程 并 估 算 模 板 量 由 于 荧 光 探 针 的 使 用, 使 核 酸 扩 增 的 快 速 检 测 与 精 确 定 量 均 成 为 可 能 由 于 检 测 过 程 高 度 灵 敏, 因 而 对 PCR 反 应 体 系 建 立 时 操 作 的 准 确 性 与 重 复 性 均 有 较 高 的 要 求 特 别 是 在 加 样 准 确 性 方 面, 将 直 接 影 响 到 最 后 的 定 量 结 果 因 此, 对 于 临 床 诊 断 实 验 室 中 进 行 病 原 体 定 量 PCR 诊 断 实 验 的 工 作 人 员 来 说,PCR 反 应 体 系 的 建 立 将 是 他 们 必 须 每 天 都 要 严 谨 面 对 的 重 复 操 作 本 文 将 Aurora Biomed 的 VERSA 100 Mini PCR 液 体 处 理 工 作 站 与 临 床 检 验 用 的 多 种 PCR 试 剂 配 合 使 用, 验 证 实 时 定 量 PCR 临 床 检 验 的 自 动 化, 达 到 高 效 可 靠 精 确 省 时 的 应 用 目 标 我 们 采 用 了 达 安 基 因 公 司 的 试 剂 因 为 他 们 的 试 剂 已 经 在 各 级 医 疗 机 构 被 广 泛 使 用 我 们 的 实 验 采 用 的 实 时 定 量 PCR 仪 是 Roche LightCycler 及 达 安 的 DA 7600 一 沙 眼 衣 原 体 核 酸 检 测 试 剂 盒 (PCR- 荧 光 探 针 法 ) 使 用 目 的 : 本 试 剂 盒 用 PCR 体 外 扩 增 法 检 测 沙 眼 衣 原 体 DNA, 适 用 于 沙 眼 衣 原 体 (CT) 感 染 的 辅 助 诊 断 原 理 和 用 途 简 介 : 本 试 剂 盒 用 一 对 沙 眼 衣 原 体 特 异 性 引 物 和 一 条 沙 眼 衣 原 体 特 异 性 荧 光 探 针, 配 以 PCR 反 应 液 耐 热 DNA 聚 合 酶 (Taq 酶 ) 四 种 核 苷 酸 单 体 (dntps) 等 成 分, 用 PCR 体 外 扩 增 法 检 测 沙 眼 衣 原 体 DNA 适 用 仪 器 :Roche LightCycler 根 据 试 剂 盒 使 用 说 明 进 行 标 本 采 集 保 存 和 运 送 及 DNA 的 提 取 PCR 反 应 体 系 建 立 1. 试 剂 准 备 : 按 比 例 (CT PCR 反 应 液 16ul/ 人 份 +Taq 酶 2ul/ 人 份 ) 取 足 够 量 的 PCR 反 应 液 及 Taq 酶, 装 于 离 心 管, 放 在 已 经 预 冷 的 8# 试 剂 冷 槽 中, 备 用 2. 盘 面 设 定 : 1000ul Tips 试 剂 冷 槽 Carousel A DNA plate 1 Carousel B DNA plate 2 将 黑 色 圆 形 卡 盘 从 LightCycler 中 取 出, 放 在 盘 面 左 边 的 CarouselA/B 盘 位 上 将 PCR 专 用 毛 细 管 依 次 插 到 圆 盘 的 孔 位 中
将 整 盒 的 吸 头 打 开, 放 于 指 定 的 盘 位 打 开 仪 器 电 源, 在 软 件 中 设 定 试 剂 冷 槽 的 温 度, 等 待 该 部 件 达 到 设 定 的 温 度, 放 入 已 分 装 的 试 剂 3. 加 样 : 设 定 反 应 液 的 放 置 孔 位 及 每 孔 体 积, 选 定 DNA 模 板 的 来 源 及 体 积, 生 成 动 作 序 列, 工 作 站 将 自 动 开 始 配 置 反 应 液, 分 配 反 应 液, 转 移 模 板 建 立 完 成 后, 取 出 圆 形 卡 盘, 离 心, 倒 置 20 秒 后 放 入 仪 器 PCR 反 应 参 数 Program Target Incubation Tempe- Secondary Step Step Acqui- Analysis Cycles name Tempe- Time Target Size Delay sition Transition Tempe- Rate 1 93 2min 20.00 0 0.0 0 None None 1 2 93 5sec 20.00 0 0.0 0 None Quantifi- 40 57 45sec 20.00 0 0.0 0 Single cation 3 37 1min 20.00 0 0.0 0 None None 1 结 果 判 定 1. 如 果 增 长 曲 线 不 呈 S 型 曲 线 或 Ct 值 为 空 白, 则 判 样 品 的 CT DNA 总 含 量 小 于 检 测 极 限 2. 如 果 增 长 曲 线 呈 S 型 曲 线 且 Ct 值 <40, 则 按 以 下 方 法 判 读 : 若 样 品 的 C<5.000E+02, 则 该 样 品 的 CT DNA 总 含 量 <5.0 10 2 基 因 拷 贝 ; 若 样 品 的 5.000E+02 C 5.000E+08, 则 该 样 品 的 CT DNA 总 含 量 =C 基 因 拷 贝 ; 若 样 品 的 C>5.000E+08, 则 该 样 品 的 CT DNA 总 含 量 为 >5.0 10 8 基 因 拷 贝 如 果 需 要 精 确 定 量 结 果, 可 将 提 取 后 的 样 品 稀 释 至 线 性 范 围 内 再 检 测 本 检 测 方 法 的 灵 敏 度 和 线 性 范 围 根 据 临 床 考 核 结 果, 本 试 剂 盒 对 处 理 后 样 品 的 灵 敏 度 为 5.0 10 2 基 因 拷 贝, 线 性 范 围 为 5.0 10 2 ~5.0 10 8 基 因 拷 贝 结 果 本 实 验 中, 扩 增 样 品 数 为 15 个, 其 中 阳 性 定 量 参 考 品 6 个 阴 性 样 品 2 个 阳 性 样 品 6 个 空 白 对 照 1 个 扩 增 曲 线 及 标 准 曲 线 如 图 1 2 3, 由 图 可 知 阴 性 样 品 和 空 白 对 照 的 增 长 曲 线 为 不 规 则 的 折 线 且 Ct 值 为 空 白, 阳 性 样 品 和 阳 性 定 量 参 考 品 增 长 曲 线 呈 S 型 曲 线 且 Ct 值 <40; 标 准 曲 线 显 示 r = -1.00(r 数 值 应 介 于 -1.0~-0.97)
图 1 NoiseBand Curve 图 2 Analysis Curve
图 3 Standard Curve 二 人 巨 细 胞 病 毒 核 酸 扩 增 荧 光 定 量 检 测 试 剂 盒 使 用 目 的 : 本 试 剂 盒 适 用 于 定 量 检 测 尿 液 乳 汁 血 液 等 样 本 中 人 巨 细 胞 病 毒 (HCMV) DNA, 可 用 于 人 巨 细 胞 病 毒 感 染 的 辅 助 诊 断 和 人 巨 细 胞 病 毒 感 染 病 人 药 物 治 疗 的 疗 效 监 控 原 理 : 本 品 选 用 人 巨 细 胞 病 毒 株 ( 即 人 疱 疹 病 毒 5 型 )-AD169 基 因 组 中 编 码 即 刻 早 期 转 录 调 节 蛋 白 的 IE1 基 因 的 一 高 度 保 守 的 非 编 码 区 为 扩 增 区 域, 设 计 特 异 性 引 物 及 荧 光 探 针, 扩 增 片 段 长 度 为 86bp, 利 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术, 定 量 检 测 人 巨 细 胞 病 毒 (HCMV)DNA 适 用 仪 器 :Roche LightCycler 根 据 试 剂 盒 使 用 说 明 进 行 标 本 采 集 保 存 和 运 送 及 DNA 的 提 取 PCR 反 应 体 系 建 立 1. 试 剂 准 备 : 按 比 例 (HCMV PCR 反 应 液 16ul/ 人 份 +Taq 酶 2ul/ 人 份 ) 取 足 够 量 的 PCR 反 应 液 及 Taq 酶, 装 于 离 心 管, 放 在 已 经 预 冷 的 8# 试 剂 冷 槽 中, 备 用 2. 盘 面 设 定 : 1000ul Tips 试 剂 冷 槽 Carousel A DNA plate 1 Carousel B DNA plate 2 将 黑 色 圆 形 卡 盘 从 LightCycler 中 取 出, 放 在 盘 面 左 边 的 CarouselA/B 盘 位 上 将 PCR
专 用 毛 细 管 依 次 插 到 圆 盘 的 孔 位 中 将 整 盒 的 吸 头 打 开, 放 于 指 定 的 盘 位 打 开 仪 器 电 源, 在 软 件 中 设 定 试 剂 冷 槽 的 温 度, 等 待 该 部 件 达 到 设 定 的 温 度, 放 入 已 分 装 的 试 剂 3. 加 样 : 设 定 反 应 液 的 放 置 孔 位 及 每 孔 体 积, 选 定 DNA 模 板 的 来 源 及 体 积, 生 成 动 作 序 列, 工 作 站 将 自 动 开 始 配 置 反 应 液, 分 配 反 应 液, 转 移 模 板 建 立 完 成 后, 取 出 圆 形 卡 盘, 离 心, 倒 置 20 秒 后 放 入 仪 器 PCR 反 应 参 数 Program Target Incubation Tempe- Secondary Step Step Acqui- Analysis Cycles name Tempe- Time Target Size Delay sition Transition Tempe- Rate 1 93 2min 20.00 0 0.0 0 None None 1 2 93 5sec 20.00 0 0.0 0 None Quantifi- 40 57 45sec 20.00 0 0.0 0 Single cation 3 37 1min 20.00 0 0.0 0 None None 1 结 果 判 定 1. 如 果 增 长 曲 线 不 呈 S 型 曲 线 或 Ct 值 为 空 白, 则 判 样 品 的 HCMV DNA 总 含 量 小 于 检 测 极 限 2. 如 果 增 长 曲 线 呈 S 型 曲 线 且 Ct 值 <40, 则 按 以 下 方 法 判 读 : 若 样 品 的 C<5.000E+02, 全 血 乳 汁 尿 液 样 品 HCMV DNA 总 含 量 <5.0 10 2 基 因 拷 贝 /ml, 血 清 样 品 HCMV DNA 总 含 量 <2.0 10 3 基 因 拷 贝 /ml; 若 样 品 的 5.000E+02 C 5.000E+08, 全 血 乳 汁 尿 液 样 品 HCMV DNA 总 含 量 =C 基 因 拷 贝 /ml, 血 清 样 品 HCMV DNA 总 含 量 =4.0 C 基 因 拷 贝 /ml; 若 样 品 的 C>5.000E+08, 则 全 血 乳 汁 尿 液 样 品 HCMV DNA 总 含 量 >5.0 10 8 基 因 拷 贝 /ml, 血 清 样 品 HCMV DNA 总 含 量 >2.0 10 9 基 因 拷 贝 /ml 如 果 需 要 精 确 定 量 结 果, 可 将 提 取 后 的 样 品 稀 释 至 线 性 范 围 内 再 检 测 本 检 测 方 法 的 灵 敏 度 和 线 性 范 围 根 据 临 床 考 核 结 果, 本 试 剂 盒 对 处 理 后 样 品 的 灵 敏 度 为 5.0 10 2 基 因 拷 贝, 线 性 范 围 为 5.0 10 2 ~5.0 10 8 基 因 拷 贝 结 果 本 实 验 中, 扩 增 样 品 数 为 15 个, 其 中 阳 性 定 量 参 考 品 5 个 阴 性 样 品 2 个 阳 性 样 品 6 个 空 白 对 照 2 个 扩 增 曲 线 及 标 准 曲 线 如 图 4 5 6, 由 图 可 知 阴 性 样 品 和 空 白 对 照 的 增 长 曲 线 为 不 规 则 的 折 线 且 Ct 值 为 空 白, 阳 性 样 品 和 阳 性 定 量 参 考 品 增 长 曲 线 呈 S 型 曲 线 且 Ct 值 <40; 标 准 曲 线 显 示 r = -1.00(r 数 值 应 介 于 -1.0~-0.97)
图 4 NoiseBand Curve 图 5 Analysis Curve
图 6 Standard Curve 三 乙 型 肝 炎 病 毒 核 酸 定 量 检 测 试 剂 盒 (PCR- 荧 光 探 针 法 ) 使 用 目 的 : 本 试 剂 盒 适 用 于 定 量 检 测 血 清 或 血 浆 等 样 本 中 乙 型 肝 炎 病 毒 (HBV)DNA, 适 用 于 乙 型 肝 炎 病 毒 (HBV) 感 染 的 辅 助 诊 断 和 乙 型 肝 炎 病 人 药 物 治 疗 的 疗 效 监 控 原 理 : 本 试 剂 盒 用 一 对 乙 型 肝 炎 病 毒 特 异 性 引 物 和 一 条 乙 型 肝 炎 病 毒 特 异 性 荧 光 探 针, 配 以 PCR 反 应 液 耐 热 DNA 聚 合 酶 (Taq 酶 ) 核 苷 酸 单 体 (dntps) 等 成 分, 用 PCR 体 外 扩 增 法 定 量 检 测 乙 型 肝 炎 病 毒 DNA 本 试 剂 盒 的 检 测 下 限 为 5.0 10 2 IU/ml 适 用 仪 器 :PE GeneAmp 5700 ABI Prism 7000 ABI Prism 7300 ABI Prism 7500 DA7600 Line Gene icycler LightCycler 等 本 实 验 中 使 用 的 是 DA7600 根 据 试 剂 盒 使 用 说 明 进 行 标 本 采 集 保 存 和 运 送 及 DNA 的 提 取 PCR 反 应 体 系 建 立 1. 试 剂 准 备 : 按 比 例 (HBV PCR 反 应 液 40ul/ 人 份 +Taq 酶 3ul/ 人 份 ) 取 足 够 量 的 PCR 反 应 液 及 Taq 酶, 装 于 离 心 管, 放 在 已 经 预 冷 的 8# 试 剂 冷 槽 中, 备 用 2. 盘 面 设 定 :
1000ul Tips 试 剂 冷 槽 Carousel A PCR plate Carousel B DNA plate 将 PCR 单 管 或 8 连 管 放 在 PCR plate 盘 位 将 整 盒 的 吸 头 打 开, 放 于 指 定 的 盘 位 打 开 仪 器 电 源, 在 软 件 中 设 定 试 剂 冷 槽 的 温 度, 等 待 该 部 件 达 到 设 定 的 温 度, 放 入 已 分 装 的 试 剂 3. 加 样 : 设 定 反 应 液 的 放 置 孔 位 及 每 孔 体 积, 选 定 DNA 模 板 的 来 源 及 体 积, 生 成 动 作 序 列, 工 作 站 将 自 动 开 始 配 置 反 应 液, 分 配 反 应 液, 转 移 模 板 建 立 完 成 后, 取 出 PCR 管, 离 心, 放 入 DA 7600 样 品 槽 PCR 反 应 参 数 Program name Target Incubation Acquisition Analysis Cycles Tempe Time 1 93 2min None None 1 2 93 45sec None None 10 55 1min None None 3 93 30sec None Quantification 30 55 45sec Single 结 果 判 定 1. 如 果 增 长 曲 线 不 呈 S 型 曲 线 或 Ct 值 =30, 则 判 样 品 的 HBV DNA 总 含 量 小 于 检 测 下 限 2. 如 果 增 长 曲 线 呈 S 型 曲 线 且 Ct 值 <30, 则 按 以 下 方 法 判 读 : 若 定 量 数 值 在 线 性 范 围 内 :1.00E+003 C 1.00E+008, 则 样 品 HBV DNA 总 含 量 为 C IU/ml; 如 果 定 量 数 值 在 线 性 范 围 外, 有 两 种 情 况 : ⑴C>1.00E+008, 则 样 品 HBV DNA 总 含 量 >1.0 10 8 IU/ml 如 果 需 要 精 确 定 量 结 果, 可 将 提 取 后 的 样 品 稀 释 至 线 性 范 围 内 再 检 测 ⑵C<1.00E+003, 则 样 品 的 HBV DNA 总 量 为 C IU/ml, 定 量 数 值 供 参 考 产 品 性 能 指 标 根 据 临 床 考 核, 本 试 剂 盒 的 检 测 下 限 为 5.0 10 2 IU/ml, 线 性 范 围 为 1.0 10 3 ~1.0 10 8 IU/ml 结 果 本 实 验 中, 扩 增 样 品 数 为 16 个, 其 中 阳 性 定 量 参 考 品 6 个 阳 性 样 品 6 个 阴 性 样 品 2 个 空 白 对 照 2 个 阳 性 定 量 参 考 品 的 扩 增 曲 线 及 标 准 曲 线 如 图 7, 其 余 样 品 的 扩 增 曲 线
如 图 8 由 图 可 知 阴 性 样 品 和 空 白 对 照 的 增 长 曲 线 为 不 规 则 的 折 线 且 Ct 值 为 空 白, 阳 性 样 品 和 阳 性 定 量 参 考 品 增 长 曲 线 呈 S 型 曲 线 且 Ct 值 <40; 标 准 曲 线 显 示 R 2 = 0.9965 图 7 阳 性 定 量 参 考 品 的 扩 增 曲 线 及 标 准 曲 线 图 8 样 品 及 空 白 的 扩 增 曲 线 结 论 Aurora Biomed 的 VERSA 100 移 液 工 作 站 结 合 达 安 基 因 的 沙 眼 衣 原 体 核 酸 检 测 试 剂 盒 人 巨 细 胞 病 毒 核 酸 扩 增 荧 光 定 量 检 测 试 剂 盒 乙 型 肝 炎 病 毒 核 酸 定 量 检 测 试 剂 盒 用 于 自 动 的 实 时 定 量 PCR 系 统, 既 适 用 于 Roche LightCycler 的 圆 盘 PCR 反 应 体 系 建 立, 又 适 用 于 单 管 8 连 管 96 孔 板 的 PCR 反 应 体 系 建 立 VERSA 100 移 液 工 作 站 建 立 的 各 种 形 式 的 PCR 反 应 体 系 均 可 得 到 精 确 可 靠 的 结 果, 而 且 能 够 有 效 避 免 交 叉 污 染, 满 足 高 密 集 型 和 高 重 复 性 的 操 作 要 求