４３８ 畜牧兽医学报 从分 子 水 平 确 定 Ｋ 的 基 因 型 有 助 于 在 育 种 实践中快速准确地 控 制 猪 的 被 毛 类 型 但 第 一 步 必 须检测该基因拷贝数变异 ｍ ５ ６ ＣＮＶ 在最近的研究中 实 时 定 量 ＰＣＲ 侵 染 ７ 检测 ｑ 焦 磷 酸 测 序 ７ ８ ４２

畜牧兽医学报 ２０１１ ４２ ３ ４３７ ４４１ Ａ Ｖ Ｚ Ｓ 应用 ＭＧＢ 荧光探针技术确定猪 Ｋ 基因 拷贝重复数 王 韬 唐 辉 曾勇庆 李晓宁 闫 超 董林松 于希江 山东农业大学动物科技学院 泰安 ２７１０１８ 摘 要 旨在建立一种简便 快速检测猪 Ｋ 基因拷贝重复数 ＣＮＶ 的方法并应用 于 未 知 样 品 的 检 测 在 Ｋ 外显子 ２ 中设计 ｑｍ ＭＧＢ 探针 和 引 物 建 立 荧 光 实 时 定 量 ＰＣＲ 检 测 Ｋ 基 因 ＣＮＶ 的 方 法 结 果 表 明 ｑｍ ＭＧＢ 探针 扩 增 Ｋ 基 因 目 的 片 段 不 同 ＤＮＡ 梯 度 浓 度 Ｃ 值 差 异 极 显 著 Ｐ ００１ 变 异 系 数 低 １２ ２６ Ｋ 与 内 标 基 因 ＥＳＲ 的 扩 增 效 率 相 差 只 有 ４ 采 用 聚 类 分 析 推 测 了 待 测 的 ５０ 枚 样 品 Ｋ 的 ＣＮＶ分别归属于 ２ ６ 个拷贝 本研究建立的 ｑｍ ＭＧＢ 探针实时荧光 定 量 ＰＣＲ 检 测 Ｋ 基 因 ＣＮＶ的方法 具有简便 快速 特异性和稳定性好的特点 适合于普通实验室应用 关键词 猪 显性 Ｋ 位点 拷贝数 ＭＧＢ 探针 荧光定量 ＰＣＲ 中图分类号 Ｓ８５ ４ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０３６６ ６９６４ ２０１１ ０３ ０４３７ ０５ Ｄ Ｃ Ｎｍ Ｖ Ｐ Ｋ ｑｍ ＭＧＢ Ｐ ＷＡＮＧ ＡＮＧ Ｈ ＺＥＮＧ Ｙ ｑ Ｘ ＹＡＮ Ｃ Ｌ ＤＯＮＧ Ｌ ＹＵ Ｘ Ｃ Ａ ｍ Ｓ Ｓ Ａ Ｕ ２７１０１８ Ｃ Ａ ｍ ｗ ｍ ｍ ｍ Ｃ ＮＶ Ｋ Ｍ Ｂ ｍ ＭＧ ｑ ｗ ｑ ｘ ２ ｍ Ｋ ｑ ＰＣＲ ｗ ＣＮＶ ｗ ｍ ｑｍ ＭＧＢ ｗ Ｋ ２ ＤＮＡ ｍ Ｃ ｗ ｗ Ｐ ００１ ｗ ｗ ｍ １２ ２６ ｍ Ｋ ＥＳＲ ｗ ｘ ｍ ｑ ＣＮＶ Ｋ ５０ ｍ ２ ３ ４ ５ ６ ｍ ｗ ＰＣＲ ｑｍ ＭＧＢ ｍ ｍ ｗ ｑ ｍ ＣＮＶ Ｋ ｍｍ Ｋ ｗ ｗ ｍ Ｋ ｍ ＭＧＢ Ｑ ＰＣＲ 猪 的 显 性 白 被 毛 表 型 由 Ｋ 原 癌 基 因 控 制 １ ２ 该基因编码 干 细 胞 生 长 因 子 受 体 ｍ ３ ｍ ｗ Ｍ ｋ 等 是基因拷贝数 的 串 联 重 复 ４５０ｋ 一 是 内 含 子 １７ 第一 个 碱 基 Ｇ Ａ 的 突 变 导 致 外 显 子 １７ 表 达 缺失 ４ 提出 显性白表型由 Ｋ 基 因 的 ２ 个 突 变 引 起 一 收稿日期 ２０１０ ０４ ０１ 基金项目 山东省中青年科学家奖励基金 ２００８ＢＳ０７００９ 山东省科技攻关 ２００９ＧＧ１０００９０３６ 国家 ８６３ 重大专项 ２００８１０１００２ 作者简介 王 韬 １９８４ 男 山东青岛人 硕士生 主要从事动物遗传育种研究 Ｅ ｍ ｗ ｍ ｍ Ｅ ｍ 于希江 Ｅ ｍ ｘ ｍ 通讯作者 唐 辉 ｍ

４３８ 畜牧兽医学报 从分 子 水 平 确 定 Ｋ 的 基 因 型 有 助 于 在 育 种 实践中快速准确地 控 制 猪 的 被 毛 类 型 但 第 一 步 必 须检测该基因拷贝数变异 ｍ ５ ６ ＣＮＶ 在最近的研究中 实 时 定 量 ＰＣＲ 侵 染 ７ 检测 ｑ 焦 磷 酸 测 序 ７ ８ ４２ 卷 ＥＳＲ雌激素受体 作 为 定 量 试 验 的 内 标 基 因 探 针 和引物参见文献 ６ 以上探针 引物均由上海基康 生物技术有限公司合成 ３ 实时定量 ＰＣＲ 体系及反应条件 扩 增 反 应总 体 积 ２０ μｌ 包 含 ２ ｑｍｇ 寡核苷酸连接分析法 ｑｏｌａ 等技 术 都被 Ｍ Ｍ ｘ １０μＬ Ｋ 引物 ５００ｍ Ｌ １ ＭＧＢ 用来进行 ＣＮＶ检测 相 对 于 其 他 方 法 复 杂 不 便 探针 ２５０ｍ Ｌ １ 或 ＥＳＲ 引 物 ９００ｍ Ｌ １ 于一般实验室操作的缺点 实时定量 ＰＣＲ 通过 荧光 ｑｍ 探 针 ２５０ｍ Ｌ １ 模 板 ＤＮＡ４ μｌ 信号的检测可以直接对产物进行定量 操作简单 安 全 自动化程度高 不易产生污染 ９ 在荧光定 量检 ＰＣＲ 扩增条 件 为 ９５ 预 变 性 １０ ｍ ９５ 变 性 １５ ６０ 退火 延伸 ６０ ４０ 个循环 测中 ｑｍ ＭＧＢ 探 针 比 普 通 探 针 灵 敏 度 更 高 ４ 预试 验 ｑｍ ＭＧＢ 探 针 特 异 性 和 稳 定 特异 性 更 好 本 试 验 采 用 ｑｍ ＭＧＢ 探 针 技 术 通过 荧 光 定 量 ＰＣＲ 方 法 测 定 猪 Ｋ 基 因 的 拷 贝重复数 有望能够建立一种更加有效的检测方法 １ 材料与方法 １ 试验材料 中系白色杜洛克猪 ３８ 头 由临沂江泉原种猪场 和山东农业 大 学 合 作 培 育 杜 洛 克 猪 ６ 头 毛 色 棕 红 大白猪 ６ 头 毛色纯白 所有猪只均来自山东临 沂江泉原种猪场 采取耳组织样品用于 ＤＮＡ 提取 ２ 试剂与仪器 组织基因组 ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 ＡＮｍ Ｇ ｍ ＤＮＡ Ｋ 购自 ＡＮＧＥＮ 公司 ２ ｑ Ｍ Ｇ Ｍ Ｍ ｘ货号 ４３７１３５５ 购 自 美国 Ａ Ｂ ｍ公司 荧光定量 ＰＣＲ 使用 Ｓ Ｍｘ３０００ ＰＣＲ 仪 ＤＮＡ 浓 度 测 定 用 德 国 Ｅ 公 司 Ｂ ｍ 紫外分光光度 计 ３ 试验方法 １ 猪耳组织 ＤＮＡ 的提取 按 ＤＮＡ 提 取试 剂盒的说明步 骤 提 取 基 因 组 ＤＮＡ 用 Ｂ ｍ 测定 样 品 的 基 因 组 ＤＮＡ 浓 度 后 置 于 ２０ 保 性分析 选取原种杜洛 克 样品 一 枚 以 一 系 列 ２ 倍 梯 度 浓 度 稀 释 的 ＤＮＡ 稀 释 梯 度 ２０ ２４ μｌ １ 为 模 板 对 Ｋ 基 因 进 行 扩 增 浓 度 设 置 ３ 次重 复 并 设 立 无 模 板 对 照 Ｎ ｍ Ｃ ＮＣ ５ 标准曲线的 建 立 试 验 采 用 单 一 扩 增 的 方法 即目的基因 Ｋ 和 内 标 基 因 ＥＳＲ 的 扩 增 反应在分开的两枚反应管中进行 选取一枚原种杜 洛克样品作为标准 样 品 以 一 系 列 ２ 倍 梯 度 浓 度 稀 释的 ＤＮＡ稀释梯 度 ２０ ２４ μｌ １ 为 模 板 对 目 的基因 Ｋ 和内 标 基 因 ＥＳＲ 进 行 定 量 扩 增 每 个浓度 ３ 个 重 复 并 设 ＮＣ 对 照 以 ＤＮＡ 相 对 浓 度为横 坐 标 以 Ｃ 值 为 纵 坐 标 分 别 绘 制 Ｋ 和 ＥＳＲ 基因的标准曲线 ６ 待测样品 Ｋ 基因拷贝数的测定 分别 对 ５０ 枚 未 知 样 品 体 系 内 终 浓 度 分 别 为 １ μｌ １ 的 Ｋ 和 ＥＳＲ 基 因 进 行 定 量 扩 增 每 次反应 包含一枚 标 准 品 样 品 一 枚 ＮＣ 对 照 每 个样品仍设置 ３ 个重复 当目的基因和 参 考 基 因 的 ＰＣＲ 扩 增 效 率 近 似 一致时 待 测 样 品 Ｋ 基 因 的 拷 贝 数 相 对 值 为 存备用 ２ Ｃ 其 中 Ｃ Ｃｍ Ｃ Ｃｍ 为 ２ 引物的 设计与合成 从 Ｅ ｍ 数据 库 待测样品 Ｋ 基因 的 Ｃ 值 减 去 ＥＳＲ 内 标 基 因 的 中下载猪 Ｋ 基因全序列 与 ＧＢｋ 中 Ｋ 的 Ｃ值 Ｃ 为 标 准 样 品 Ｋ 基 因 的 Ｃ 值 减 去 ｍｒｎａ 序列进行比对 区分 Ｋ 基因 的 ２１ 个 外 显 子 用 Ｐ ｍ Ｅｘ ０于外显子２中设计目的 基因 Ｋ 的 ｑｍ ＭＧＢ 探 针 和 引 物 引 物 序 列和探 针 序 列 ５ ３ 分 别 为 Ｋ ＧＣＡＧ ＥＳＲ 内标基因的 Ｃ值 １０ ４ 统计学分析 采用 Ｒ 软 件 Ｒ １ ０ 对 数 据 进 行 统 计 分 析 和统 计 图 绘 制 由 于 ６中计算的拷贝数相对值 ＧＣＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧ ＫＲ ＡＣＣＣＡＧＧＧ ＡＭ ＣＣＧＡＣ ＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡ ＫＰ 呈连续分布的实数 为便于合理分类 本研究用聚类 ＣＡＧＧＡＣＧ ＮＱ ＭＧＢ 选 取 猪 单 拷 贝 基 因 行归类 分析的方法对 ５０ 个未知样品 Ｋ 基因的拷贝数进

３ 期 ４３９ 王 韬等 应用 ＭＧＢ 荧光探针技术确定猪 Ｋ 基因拷贝重复数 ２ 结 果 似一 致 可 以 通 过 ２ Ｃ 方 法 对 Ｋ 进 行 相 对 定 量 １０ １ 预试验 ｑｍ ＭＧＢ 探针检测效果分析 原始 ＤＮＡ 浓 度 １６ μｌ １ 按 ２ 倍 稀 释 至 表 １ｑＭ ＭＧＢ 实时定量 ＰＣＲ 检测 Ｋ 基因 拷 贝 数 的 １ μｌ １ 得到 ５ 种 不 同 浓 度 的 系 列 工 作 液 经 过 ｑｍ ＭＧＢ 探针荧光实时定量 ＰＣＲ 检测 得 到的 １Ｓ ｑｍ ＭＧＢＲ ｍｑ 扩增曲线见图 １ 由 图 １ 可 见 不 同 浓 度 组 间 Ｋ 基因的扩增曲线呈 现 间 距 相 等 的 平 行 曲 线 每 个 浓 度的 Ｃ值相差约 １ 个循环 表明该方法检测基因的 拷贝数具有良 好 的 线 性 范 围 进 一 步 的 分 析 表 明 标准曲线的直 线 相 关 系 数 ２ ９９９ 说 明 线 性 关 稳定性 ＰＣＲ 项目 ｍ ＤＮＡ 浓度 μｌ １ ＤＮＡ １ ２ ４ ８ １６ 珚 Ｃ ２８ ２０ ２７ ２５ ２６ ０７ ２５ ０８ ２ ９０ ＳＤ ０４ ０４ ０７ ０６ ０４ ＣＶ １４ １３ ２６ ２４ １７ 系非常好 扩增产物测序结果与扩增的目的片段完 全吻合 表明该方法的特异性好 图 １２ 倍系列稀释 ＤＮＡ 样品 Ｋ 基因的扩增曲线 ｗ ２ Ｋ １Ａｍ 图 ２ 标准品 Ｋ 和 ＥＳＲ 基因的标准曲线 Ｋ ＥＳＲ ２Ｓ ＤＮＡ ｍ ３ 未知样品 Ｋ 基因的定量检测 表 １ 列出了每个 ＤＮＡ 浓 度 下 ３ 次 重 复 测 定 的 珚 Ｋ 基因 Ｃ值的平均 数 Ｃ 标 准 差 ＳＤ 和 变 异 系数 ＣＶ 本 试 验 测 定 的 Ｃ 值 变 异 系 数 的 变 异 范围从 １３ ２６ 均 在 １ 的 合 理 范 围 内 表明 ｑｍ ＭＧＢ 实 时 定 量 ＰＣＲ 方 法 具 有 很 好 的稳定性和可重复性 ２ 标准曲线 以 Ｋ 和ＥＳＲ 各浓度的 Ｃ平均值为纵坐标 以 ＤＮＡ 相对浓度的 值 为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 对 ５０ 头猪的基因拷贝数进行了定量检测 记录 所得 Ｃ值 对样品 Ｎ ５０ 的 ２ Ｃ值进行聚类分 析 区分未知样品 Ｋ 基因 的 拷贝 数图 ３ 当 类 间距离小于 ４ 时 可将 ５０ 个样品归入 ５ 个不同的 类 即分别对应 ２ ６ 个 拷 贝 数 图 ４ 表 示 了 不同拷贝数的样品对应的 ２ Ｃ值 ２ ６个拷 贝重 复 数 对 应 的 ２ Ｃ 平 均 值 ± 标 准 误 分 别 是 ８９± ０４ ２８± ０３ ７１± ０２ １３± ０４ ２５± ０５ 各组均 数 间 差 异 极 显 著 Ｐ ００１ 图 ２ 由图 ２ 可知 Ｋ 和 ＥＳＲ 对应的 ２ 个扩增 ６ 头杜洛克均为 ２ 拷贝 大 白 猪 为 ５ 或 ６ 个 拷 贝 白 标准 曲 线 的 斜 率 之 差 为 ０６１ 小 于 １ 扩 增 效 率 色杜洛 克 除 了 １ 头 为 ２ 拷 贝 外 其 余 ３７ 头 为 ３ ６ 分别为 ９７ ０ 和 ９９ ４ 相差 ４ 小于 ５ 即认 拷贝 为一致 这说明目标基因和内标基因的扩增效率近

４４０ 畜牧兽医学报 ４２ 卷 图 ３ 待测样品 ２ Ｃ值的系统聚类图 Ｎ ５０ ３Ｈ ｋｗ ｍ ２ Ｃ Ｎ ５０ 尽管我们知道衡量样品 Ｋ 拷贝 重复 数 的值 Ｃ 与拷贝数呈正相关 但对未知样品检测得到 的 ２ Ｃ 值呈现连续变异 究竟每个样品含几个拷贝 需 ２ 要合理分组 为避 免 人 为 分 组 造 成 的 偏 差 本 研 究 采用系统聚类分析方法根据样品间数据差异的大小 即距离 将样品进 行 聚 类 分 组 因 为 相 同 拷 贝 数 样 品间的 ２ Ｃ值 会 更 接 近 聚 类 分 组 结 果 表 明 不 同拷贝数组间的 ２ Ｃ平均值 有 显 著 差 异 且 标 准 误 小 说明分类较为合理 除了拷贝 数 最 高的一组外 其余 ４ 组 ２ Ｃ的比值近似为 ２ ３ ４ ５ 依 次 对应 ２ ５ 个拷贝 数 拷 贝 数 较 高 组 的 ２ Ｃ值 偏高 可能意味着猪群中有 ６ 个以上拷贝数的存在 ５ 这与 Ｐ 等 的检测结果有相似之处 各组 间 图 ４Ｋ 基 因 拷 贝 重 复 数 的 相 对 定 量 值 ２ Ｃ Ｎ ５０ ２ Ｃ ｍ ４Ｒ ｑ Ｋ Ｎ ５０ ３ 讨 论 ｑｍ ＭＧＢ 探针由于采用特殊的设计 特异 性 灵敏度 稳 定 性 比 普 通 探 针 大 大 提 高 １１ 从 本 的 ２ Ｃ无重叠现象 试验误 差 小 检 测 效 果 好 于 文 献 ５ 中使用的普通 ｑｍ 探针实时定量 ＰＣＲ 方 法 ６ 头杜洛克猪的 Ｋ 均为 ２ 拷 贝 大 白 猪 ５ 或 ６ 个拷贝各 ３ 头 白色杜洛 克 猪 除 了 １ 头 为 ２ 拷 贝 外 其余 ３７ 头为 ３ ６ 拷 贝 白 色 杜 洛 克 系 普 通 杜 洛克与大约克猪杂 交 选 育 的 被 毛 白 色 的 种 群 Ｋ 基因重复拷贝数的分布符合预期值 研究结果来看 ｑｍ ＭＧＢ 探针得到的扩 增 曲线 特异性和稳定性 都 很 好 扩 增 效 率 高 为 Ｋ 基 因 拷贝重复数的定量测定提供了很好的基础 本研究 建 立 的 以 ｑｍ ＭＧＢ 探 针 为 基 础 的 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检测 Ｋ 基 因 拷 贝 重 复 数 的 方 法 还 具 有 操 作简便 快捷 ３ ５ 可 完 成 测 定 的 特 点 不 需 昂 贵设备 在一般实验室即可完成 ４ 结 论 本研 究 建 立 了 ｑｍ ＭＧＢ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检测 Ｋ 基 因 拷 贝 重 复 数 变 异 的 方 法 该 方 法可以直接对产物 进 行 定 量 具 有 良 好 的 稳 定 性 和 特异性 而且操作简单 安全 自动化程度高 不易产 生污染 不需昂贵设备 适合在普通实验室检测

３ 期 ４４１ 王 韬等 应用 ＭＧＢ 荧光探针技术确定猪 Ｋ 基因拷贝重复数 Ｂ ｍ Ｄｍ 参考文献 Ｋ ｗ Ｊ Ｍｍｍ Ｇｍ １９９９ １０ １ ＪＯＨＡＮＳＳＯＮＭ ＥＬＬＥＧＲＥＮＨ ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ １２ １１３２ １１３６ Ｌ ｍ ｗ ７ ＰＥＬＢＥＲＧ Ｇ ＤＡＹＡ ＰＬＡＳＯＷＧ Ａ ｋ ＡＬＢＰＤＧＲＡ ｍ ｍ ｍ ｍ ８ Ｊ Ｇ ｍ １９９２ １４ ４ ９６５ ９６９ Ｊ Ｇ ｍ Ｒ ２００３ １３ ２ ＪＯＨＡＮＳＳＯＮ Ｍ ＣＨＡＵＤＨＡＲＹ Ｒ ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ Ｌ Ｐ ｍ ｗ ｗ ９ ２１７１ ２１７７ ８ ＳＥＯ Ｂ ＰＡＲＫ Ｅ ＡＨＮ Ｓ Ａ ｍ Ｋ ｚ ｍ ｑ ｗ ｍ ｍ Ｊ Ｋ Ｍｍｍ Ｇｍ １９９６ ７ １１ ８２２ ８３ Ｊ ＢＭＣ Ｇ ２００７ ８ ８ ３ ＷＥＨＲＬＥ ＨＡＬＬＥＲ Ｂ ＷＥＳＯＮＪＲ ９ ＨＥＤ Ｃ ＳＥＶＥＮＳ Ｊ ＬＶＡＫ Ｋ Ｒ ｍ ｋ ｍ ＰＣＲ Ｊ Ｇ ｍ Ｒ １９９６ ６ １０ ｑ ｚ Ｊ ｗ Ｂ １９９７ １９ ４ ３３７ ３４５ ９８６ ９９４ １０ ＬＶＡＫ Ｋ ＳＣＨＭＧＥＮ Ａ Ｒ ４ ＭＡＲＫＬＵＮＤ Ｓ Ｋ ＪＡＳ Ｊ ＲＯＤＲＧＵＥＺ ＭＡＲＮ Ｇ Ｅｘ Ｄ Ｕ Ｒ ｍ Ｑ ＥＺ Ｈ Ｍ ｍ ｗ ２ ＣＭ Ｊ Ｍ ２００１ ２５ ＰＣＲ ｍ Ｊ Ｇ ｍ Ｒ １９９８ ８ ８ ８２６ ８３ ４ ４０２ ４０８ １１ ＫＵＭＡＲ Ｓ ＲＥＥＤ Ｍ ＳＣＨＷＥＺＥＲ Ｂ Ｓ ５ ＰＥＬＢＥＲＧ Ｇ ＯＬＳＳＯＮ Ｃ ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ Ｌ ＤＮＡ ｘ Ｋ Ｕｘ ｍ Ｊ Ｎ Ａ ｍ ｗ ｍ Ｊ Ｒ １９９８ ２６ ３ ８３１ ８３８ Ｇ ２００２ １６０ １ ３０５ ３１ ６ ＧＵＲＡ Ｅ ＥＶＡＮＳ Ｇ ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ Ｌ 编辑 郭云雁