时 荧 光 定 量 (Realtime )PCR 检 测 服 务 原 理 所 谓 的 实 时 荧 光 定 量 PCR, 其 反 应 体 系 中, 引 入 了 一 种 荧 光 化 学 物 质, 随 着 PCR 反 应 的 进 行,PCR 反 应 产 物 不 断 累 计, 荧 光 信 号 强 度 也 等 比 例 增 加 每 经 过 一 个 循 环, 收 集 一 个 荧 光 强 度 信 号, 这 样 我 们 就 可 以 通 过 荧 光 强 度 变 化 监 测 产 物 量 的 变 化, 从 而 得 到 一 条 荧 光 扩 增 曲 线 一 般 而 言, 荧 光 扩 增 曲 线 可 以 分 三 个 阶 段 : 荧 光 背 景 信 号 阶 段, 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 和 平 台 期 在 荧 光 背 景 信 号 阶 段, 扩 增 的 荧 光 信 号 被 荧 光 背 景 信 号 所 掩 盖, 我 们 无 法 判 断 产 物 量 的 变 化 而 在 平 台 期, 扩 增 产 物 已 不 再 呈 指 数 级 的 增 加 PCR 的 终 产 物 量 与 起 始 模 板 量 之 间 没 有 线 性 关 系, 所 以 根 据 最 终 的 PCR 产 物 量 不 能 计 算 出 起 始 DNA 拷 贝 数 只 有 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段,PCR 产 物 量 的 对 数 值 与 起 始 模 板 量 之 间 存 在 线 性 关 系, 我 们 可 以 选 择 在 这 个 阶 段 进 行 定 量 分 析 为 了 定 量 和 比 较 的 方 便, 在 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 中 引 入 了 两 个 非 常 重 要 的 概 念 : 荧 光 阈 值 和 CT 值 荧 光 阈 值 是 在 荧 光 扩 增 曲 线 上 人 为 设 定 的 一 个 值, 它 可 以 设 定 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 任 意 位 置 上, 但 一 般 我 们 将 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3-15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 到 达 设 定 的 域 值 时 所 经 历 的 循 环 数 被 称 为 CT 值 ( threshold value ) 定 量 荧 光 扩 增 曲 线 是 荧 光 量 与 循 环 数 的 图 表 荧 光 阈 值 线 的 位 置 一 般 事 实 上 位 于 减 去 本 底 的 位 置 上, 这 时 的 荧 光 信 号 超 过 了 荧 光 背 景 信 号 并 且 开 始 增 加 对 某 一 样 品 的 C( t ) 值 就 定 义 为 荧 光 量 与 荧 光 阈 值 线 交 叉 时 的 循 环 数 CT 值 与 起 始 模 板 的 关 系 研 究 表 明, 每 个 模 板 的 CT 值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关 系, 起 始 拷 贝 数 越 多,CT 值 越 小 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线, 其 中 横 坐 标 代 表 CT 值, 纵 坐 标 代 表 起 始 拷 贝 数 的 对 数 因 此 只 要 获 得 未 知 样 品 的 CT 值,how? 即 可 从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品 的 起 始 拷 贝 数 SYBR Green Ⅰ 荧 光 染 料 荧 光 定 量 PCR 实 验 过 程
a. 准 备 样 品 及 试 剂 PCR Master Mix ; 光 学 96 孔 板 和 光 学 盖 ; 客 户 样 品 cdna ( 浓 度 不 低 于 10ng/ul ); b. 设 计 并 合 成 引 物 和 TaqMan 探 针 c. 定 量 PCR 实 验 d. 引 物 和 探 针 稀 释 e. 制 备 标 准 曲 线 样 品 取 一 个 客 户 的 样 品 做 至 少 5 个 梯 度 稀 释, 用 于 做 标 准 曲 线 如 果 需 要 做 绝 对 定 量, 则 先 要 用 客 户 样 品 进 行 扩 增, 把 扩 增 片 段 连 入 质 粒, 通 过 大 肠 杆 菌 扩 增 质 粒, 抽 提 出 质 粒 测 定 浓 度, 换 算 成 目 的 片 段 的 拷 贝 数 或 纳 克 数, 在 将 质 粒 DNA 进 行 至 少 5 个 梯 度 稀 释 用 于 做 标 准 曲 线 ; 如 果 用 看 家 基 因 进 行 相 对 定 量, 则 无 需 制 备 目 的 片 段 的 克 隆 样 品 目 的 基 因 的 荧 光 定 量 PCR ( 每 样 品 每 基 因 都 进 行 三 孔 平 行 实 验, 保 证 实 验 结 果 的 准 确 性 ) 荧 光 定 量 PCR 的 应 用 范 围 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 是 DNA 定 量 技 术 的 一 次 飞 跃 运 用 该 项 技 术, 我 们 可 以 对 DNA RNA 样 品 进 行 定 量 和 定 性 分 析 定 量 分 析 包 括 绝 对 定 量 分 析 和 相 对 定 是 量 分 析 前 者 可 以 得 到 某 个 样 本 中 基 因 的 拷 贝 数 和 浓 度 ; 后 者 可 以 对 不 同 方 式 处 理 的 两 个 样 本 中 的 基 因 表 达 水 平 进 行 比 较 除 此 之 外 我 们 不 定 期 可 以 对 PCR 产 物 或 样 品 进 行 定 性 分 析 : 例 如 利 用 熔 解 曲 线 分 析 识 别 扩 增 产 物 和 引 物 二 聚 体 以 区 分 非 特 异 扩 增 ; 利 用 特 异 性 探 针 进 行 基 因 型 分 析 及 SNP 检 测 等 目 前 实 时 荧 光 PCR 技 术 已 经 被 广 泛 应 用 于 基 础 科 学 研 究 临 床 诊 断 疾 病 研 究 及 药 物 研 发 等 领 域 其 中 最 主 要 的 应 用 集 中 在 以 下 几 个 方 面 : a. 研 究 各 种 处 理 对 细 胞 mrna 表 达 量 变 化 的 影 响 b. 比 较 病 理 组 织 与 正 常 组 织 中 各 种 mrna 表 达 量 差 异 c.dna 或 RNA 的 转 染 量 与 实 验 结 果 关 系 的 研 究
d. 基 因 整 合 拷 贝 数 的 研 究 e. 疾 病 药 物 及 医 疗 方 面 : f. 新 药 开 发 药 物 疗 效 研 究 g. 个 人 基 因 型 与 药 物 疗 效 之 间 的 关 系 h. 药 物 治 疗 前 后 相 关 基 因 表 达 量 的 变 化 I. 疾 病 的 发 病 监 控 建 立 病 原 体 病 分 子 诊 断 标 准 技 术 服 务 内 容 和 价 格 : a. 引 物 探 针 的 设 计 合 成 和 荧 光 标 记 ; b. 样 品 的 处 理 ( 如 DNA 和 RNA 抽 提 逆 转 录 标 准 品 的 制 备 等 ); c. PCR 条 件 的 摸 索, 产 物 的 鉴 定 ; d. 提 供 配 套 的 内 外 参 照 ; e. 定 量 PCR 实 验 及 结 果 数 据 的 处 理 和 分 析 方 法 样 本 数 收 费 标 准 工 作 日 Taqman 探 针 1-10 个 2000 元 / 条 探 针 设 计 合 成 300 元 / 基 因 样 品 分 析 费 用 300 元 /home 基 因 样 品 分 析 费 用 10-30 个 2000 元 / 条 探 针 设 计 合 成 250 元 / 基 因 样 品 分 析 费 用 15 个 工 作 日 20 个 工 作 日 250 元 / home 基 因 样 品 分 析 费 用 30 个 以 上 2000 元 / 条 探 针 设 计 合 成 230 元 / 基 因 样 品 分 析 费 用 30 个 工 作 日
230 元 / home 基 因 样 品 分 析 费 用 SYBR Green 1-10 个 400 元 / 基 因 样 品 分 析 费 用 15 个 工 作 日 1 250 元 / home 基 因 样 品 分 析 费 用 10 个 以 上 350 元 / 基 因 样 品 分 析 费 用 15 个 工 作 日 250 元 / home 基 因 样 品 分 析 费 用 实 验 案 例 : 实 时 荧 光 定 量 PCR 实 验 报 告 范 例 实 验 目 的 : 肿 瘤 细 胞 分 别 进 行 2 种 不 同 情 况 的 药 物 处 理 后, 测 定 其 Caspase3 基 因 的 mrna 表 达 量 变 化 3 种 样 品 分 别 为 : 对 照 ( 肿 瘤 细 胞 ) ; 药 物 处 理 1 ( 加 入 第 一 种 药 物 进 行 培 养 的 肿 瘤 细 胞 ); 药 物 处 理 2( 加 入 第 二 种 药 物 进 行 培 养 的 肿 瘤 细 胞 ) 结 果 分 析 使 用 双 标 准 曲 线 法 进 行 相 对 定 量 实 验 报 告 内 容 包 括 : RNA 抽 提 :( Trizol RNA 抽 提 及 质 量 检 测 方 法 ) cdna 合 成 :( cdna 合 成 方 法 ) 实 时 定 量 PCR : 实 时 定 量 PCR 方 法 介 绍 实 时 定 量 PCR 反 应 的 详 细 过 程 实 时 定 量 PCR 使 用 引 物 的 列 表 梯 度 稀 释 的 标 准 品 及 3 个 待 测 样 品 的 待 测 基 因 实 时 定 量 PCR 结 果 梯 度 稀 释 的 标 准 品 及 3 个 待 测 样 品 的 管 家 基 因 ( 内 参 ) 实 时 定 量 PCR 结 果 各 样 品 目 的 基 因 量 以 内 参 校 正 的 计 算 表 格 3 种 样 品 所 抽 提 的 RNA 紫 外 吸 收 值 及 浓 度 : 样 品 OD 260 OD 280 OD 260 /OD 浓 度 (ug/ul)
280 1. 对 照 0.782 0.392 1.99 3.13 2. 药 物 处 理 1 0.659 0.335 1.97 2.64 3. 药 物 处 理 2 0.845 0.437 1.93 3.38 待 测 基 因 ( Caspase 3 ) 实 时 定 量 PCR 结 果 Raw Data For Cycling B.FAM/Sybr Quantitation data for Cycling B.FAM/Sybr Standard Curve 内 参 基 因 ( Beta-actin ) 实 时 定 量 PCR 结 果 Raw Data For Cycling B.FAM/Sybr Quantitation data for Cycling B.FAM/Sybr Standard Curve 结 果 校 正 3 种 样 品 待 测 基 因 (Caspase 3) 实 时 定 量 PCR 后 由 标 准 曲 线 图 所 得 测 量 值 为 : 1.36E-04, 3.06E-04 和 3.35E-03 ; 3 种 样 品 内 参 基 因 (beta-actin) 实 时 定 量 PCR 后 由 标 准 曲 线 图 所 得 测 量 值 为 : 1.09E-02,1.16E-02 和 1.33E-02 ; 实 时 定 量 PCR 时 3 种 样 品 上 样 量 均 为 1ul, 然 而 由 于 受 RNA 浓 度 定 量 误 差 和 RNA 逆 转 录 效 率 误 差 等 的 影 响, 每 个 样 品 的 1ul 体 积 的 cdna 其 含 量 并 不
完 全 相 同, 为 校 正 此 差 异, 我 们 使 用 管 家 基 因 beta-actin( 不 同 样 品 间 表 达 量 基 本 恒 定 ) 作 为 内 参, 以 样 品 待 测 基 因 得 值 除 以 此 样 品 内 参 得 值, 最 终 得 到 的 比 值 为 样 品 的 待 测 基 因 相 对 含 量 内 参 校 正 列 表 : 样 品 名 称 对 照 药 物 处 理 1 药 物 处 理 2 样 品 编 号 1 2 3 ( 内 参 )beta-actin 1.09E-02 1.16E-02 1.33E-02 ( 待 测 基 因 )Caspase 3 1.36E-04 3.06E-04 3.35E-03 待 测 基 因 以 内 参 校 正 值 Caspase 3/beta-actin 1.25E-02 2.64E-02 2.52E-01 疑 难 解 答 : 请 问 : 在 做 Real-time PCR 时, 对 于 Taqman 探 针 法 和 SYBR Green 染 料 法, 有 什 么 区 别? 选 择 时 有 什 么 不 同 的 要 求 吗? 答 : 目 前 荧 光 实 时 定 量 PCR 所 使 用 的 荧 光 化 学 方 法 主 要 有 五 种, 分 别 是 : 内 嵌 染 料 ( SYBR GreenⅠ) 双 标 记 探 针 FRET 探 针 分 子 信 标 和 Ampliflor SYBR Green Ⅰ 是 一 种 结 合 于 小 沟 中 的 双 链 DNA 结 合 染 料, 与 双 链 DNA 结 合 后, 其 荧 光 大 大 增 强 这 一 性 质 使 其 用 于 扩 增 产 物 的 检 测 非 常 理 想, SYBR Green Ⅰ 的 最 大 吸 收 波 长 约 为 497nm, 发 射 波 长 最 大 约 为 520nm 在 PCR 反 应 体 系 中, 加 入 过 量 SYBR 荧 光 染 料,SYBR 荧 光 染 料 特 异 性 地 掺 入 DNA 双 链 后, 发 射 强 荧 光 信 号, 而 不 掺 入 链 中 的 SYBR 染 料 分 子 仅 有 微 弱 荧 光 信 号 背 景, 从 而 保 证 荧 光 信 号 的 增 加 与 PCR 产 物 的 增 加 同 步 SYBR Green Ⅰ 在 核 酸 的 实 时 检 测 方 面 有 很 多 优 点
由 于 它 与 所 有 的 双 链 DNA 相 结 合, 不 必 因 为 模 板 不 同 而 特 别 定 制, 因 此 通 用 性 好, 且 价 格 相 对 较 低 利 用 荧 光 染 料 可 以 指 示 双 链 DNA 熔 点 的 性 质, 通 过 熔 点 曲 线 分 析 可 以 识 别 扩 增 产 物 和 引 物 二 聚 体, 因 而 可 以 区 分 非 特 异 扩 增 此 外, 由 于 一 个 PCR 产 物 可 以 与 多 个 分 子 的 染 料 结 合, 因 此 SYBR Green Ⅰ 的 检 测 灵 敏 度 很 高 但 是, 由 于 SYBR Green Ⅰ 与 所 有 的 双 链 DNA 相 结 合, 因 此 由 引 物 二 聚 体 单 链 二 级 结 构 以 及 错 误 的 扩 增 产 物 引 起 的 假 阳 性 会 影 响 定 量 的 精 确 性 TaqMan 探 针 是 一 种 寡 核 苷 酸 探 针, 荧 光 基 团 连 接 在 探 针 的 5' 末 端, 而 淬 灭 剂 则 在 3' 末 端 当 探 针 与 靶 序 列 配 对 时, 荧 光 基 团 发 射 的 荧 光 因 与 3' 端 的 淬 灭 剂 接 近 而 被 淬 灭 在 进 行 延 伸 反 应 时, 聚 合 酶 的 5' 外 切 酶 活 性 将 探 针 切 断, 使 得 荧 光 基 团 与 淬 灭 剂 分 离, 发 射 荧 光 一 分 子 的 产 物 生 成 就 伴 随 着 一 分 子 的 荧 光 信 号 的 产 生 随 着 扩 增 循 环 数 的 增 加, 释 放 出 来 的 荧 光 基 团 不 断 积 累 因 此 Taqman 探 针 检 测 的 是 积 累 荧 光 常 用 的 荧 光 基 团 是 FAM, TET, VIC, HEX 具 体 原 理 如 下 图 所 示 相 对 于 荧 光 染 料 的 方 法, 探 针 的 方 法 更 准 确, 可 信 度 也 相 对 较 高, 实 验 本 身 的 影 响 因 素 比 较 少, 因 而, 实 验 的 可 操 作 性, 科 重 复 性 也 好, 但 是, 探 针 的 方 法, 相 对 于 染 料 的 方 法 来 说, 价 格 相 对 较 高, 成 本 也 高 如 果 实 验 资 金 允 许 的 话, 还 是 选 用 探 针 的 方 法 更 好 一 些 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 原 理 与 应 用 http://www.bioon.com 生 物 谷 网 站 聚 合 酶 链 式 反 应 ( PCR) 可 对 特 定 核 苷 酸 片 断 进 行 指 数 级 的 扩 增 在 扩 增 反 应 结 束 之 后, 我 们 可 以 通 过 凝 胶 电 泳 的 方 法 对 扩 增 产 物 进 行 定 性 的 分 析, 也 可 以 通 过 放 射 性 核 素 掺 入 标 记 后 的 光 密 度 扫 描 来 进 行 定 量 的 分 析 无 论 定 性 还 是 定 量 分 析, 分 析 的 都 是 PCR 终 产 物 但 是 在 许 多 情 况 下, 我 们 所 感 兴 趣 的 是 未 经 PCR 信 号 放 大 之 前 的 起 始 模 板 量 例 如 我 们 想 知 道 某 一 转 基 因 动 植 物 转 基 因 的 拷 贝 数 或 者 某 一 特 定 基 因 在 特 定 组 织 中 的 表 达 量 在 这 种 需 求 下 荧 光 定 量 PCR 技 术 应 运 而 生 所 谓 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 就 是 通 过 对 PCR 扩 增 反 应 中 每 一 个 循 环 产 物 荧 光 信 号 的 实 时 检 测 从 而 实 现 对 起 始 模 板 定 量 及 定 性 的 分 析 在 实 时 荧
光 定 量 PCR 反 应 中, 引 入 了 一 种 荧 光 化 学 物 质, 随 着 PCR 反 应 的 进 行, PCR 反 应 产 物 不 断 累 计, 荧 光 信 号 强 度 也 等 比 例 增 加 每 经 过 一 个 循 环, 收 集 一 个 荧 光 强 度 信 号, 这 样 我 们 就 可 以 通 过 荧 光 强 度 变 化 监 测 产 物 量 的 变 化, 从 而 得 到 一 条 荧 光 扩 增 曲 线 图 ( 如 图 1) 图 1 实 时 荧 光 扩 增 曲 线 图 一 般 而 言, 荧 光 扩 增 曲 线 扩 增 曲 线 可 以 分 成 三 个 阶 段 : 荧 光 背 景 信 号 阶 段, 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 和 平 台 期 在 荧 光 背 景 信 号 阶 段, 扩 增 的 荧 光 信 号 被 荧 光 背 景 信 号 所 掩 盖, 我 们 无 法 判 断 产 物 量 的 变 化 而 在 平 台 期, 扩 增 产 物 已 不 再 呈 指 数 级 的 增 加 PCR 的 终 产 物 量 与 起 始 模 板 量 之 间 没 有 线 性 关 系, 所 以 根 据 最 终 的 PCR 产 物 量 不 能 计 算 出 起 始 DNA 拷 贝 数 只 有 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段,PCR 产 物 量 的 对 数 值 与 起 始 模 板 量 之 间 存 在 线 性 关 系, 我 们 可 以 选 择 在 这 个 阶 段 进 行 定 量 分 析 为 了 定 量 和 比 较 的 方 便, 在 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 中 引 入 了 两 个 非 常 重 要 的 概 念 : 荧 光 阈 值 和 CT 值 荧 光 阈 值 是 在 荧 光 扩 增 曲 线 上 人 为 设 定 的 一 个 值, 它 可 以 设 定 在 荧 光 信 号 指 数 扩 增 阶 段 任 意 位 置 上, 但 一 般 我 们 将 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3-15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 到 达 设 定 的 域 值 时 所 经 历 的 循 环 数 被 称 为 CT 值 ( threshold value )( 如 图 2 所 示 )
图 2. 荧 光 定 量 标 准 曲 线 CT 值 与 起 始 模 板 的 关 系 研 究 表 明, 每 个 模 板 的 CT 值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关 系, 起 始 拷 贝 数 越 多, CT 值 越 小 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线, 其 中 横 坐 标 代 表 起 始 拷 贝 数 的 对 数, 纵 坐 标 代 表 Ct 值 ( 如 图 3 所 示 ) 因 此, 只 要 获 得 未 知 样 品 的 Ct 值, 即 可 从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品 的 起 始 拷 贝 数 图 3 阈 值 线 和 CT 值 荧 光 探 针 和 荧 光 染 料 实 时 荧 光 定 量 PCR 的 化 学 原 理 包 括 探 针 类 和 非 探 针 类 两 种, 探 针 类 是 利 用 与 靶 序 列 特 异 杂 交 的 探 针 来 指 示 扩 增 产 物 的 增 加, 非 探 针 类 则 是 利 用 荧 光 染 料 或 者 特 殊 设 计 的 引 物 来 指 示 扩 增 的 增 加 前 者 由 于 增 加 了 探 针 的 识 别 步 骤, 特 异 性 更 高, 但 后 者 则 简 便 易 行 1.SYBR Green I
图 4 SYBR GREEN I 工 作 原 理 SYBR Green I 是 一 种 结 合 于 小 沟 中 的 双 链 DNA 结 合 染 料 与 双 链 DNA 结 合 后, 其 荧 光 大 大 增 强 这 一 性 质 使 其 用 于 扩 增 产 物 的 检 测 非 常 理 想 SYBR Green I 的 最 大 吸 收 波 长 约 为 497nm, 发 射 波 长 最 大 约 为 520nm 在 PCR 反 应 体 系 中, 加 入 过 量 SYBR 荧 光 染 料, SYBR 荧 光 染 料 特 异 性 地 掺 入 DNA 双 链 后, 发 射 荧 光 信 号, 而 不 掺 入 链 中 的 SYBR 染 料 分 子 不 会 发 射 任 何 荧 光 信 号, 从 而 保 证 荧 光 信 号 的 增 加 与 PCR 产 物 的 增 加 完 全 同 步 图 4. SYBR GREEN I 工 作 原 理 SYBR Green I 在 核 酸 的 实 时 检 测 方 面 有 很 多 优 点, 由 于 它 与 所 有 的 双 链 DNA 相 结 合, 不 必 因 为 模 板 不 同 而 特 别 定 制, 因 此 设 计 的 程 序 通 用 性 好, 且 价 格 相 对 较 低 利 用 荧 光 染 料 可 以 指 示 双 链 DNA 熔 点 的 性 质, 通 过 熔 点 曲 线 分 析 可 以 识 别 扩 增 产 物 和 引 物 二 聚 体, 因 而 可 以 区 分 非 特 异 扩 增, 进 一 步 地 还 可 以 实 现 单 色 多 重 测 定 此 外, 由 于 一 个 PCR 产 物 可 以 与 多 分 子 的 染 料 结 合, 因 此 SYBR Green I 的 灵 敏 度 很 高 但 是, 由 于 SYBR Green I 与 所 有 的 双 链 DNA 相 结 合, 因 此 由 引 物 二 聚 体 单 链 二 级 结 构 以 及 错 误 的 扩 增 产 物 引 起 的 假 阳 性 会 影 响 定 量 的 精 确 性 通 过 测 量 升 高 温 度 后 荧 光 的 变 化 可 以 帮 助 降 低 非 特 异 产 物 的 影 响 1 由 解 链 曲 线 来 分 析 产 物 的 均 一 性 有 助 于 分 析 由 SYBR Green I 得 到 定 量 结 果
2. 分 子 信 标 (molecular beacon) 分 子 信 标 是 一 种 在 靶 DNA 不 存 在 时 形 成 茎 环 结 构 的 双 标 记 寡 核 苷 酸 探 针 在 此 发 夹 结 构 中, 位 于 分 子 一 端 的 荧 光 基 团 与 分 子 另 一 端 的 淬 灭 基 团 紧 紧 靠 近 在 此 结 构 中, 荧 光 基 团 被 激 发 后 不 是 产 生 光 子, 而 是 将 能 量 传 递 给 淬 灭 剂, 这 一 过 程 称 为 荧 光 谐 振 能 量 传 递 ( FRE T ) 由 于 " 黑 色 " 淬 灭 剂 的 存 在, 由 荧 光 基 团 产 生 的 能 量 以 红 外 而 不 是 可 见 光 形 式 释 放 出 来 如 果 第 二 个 荧 光 基 团 是 淬 灭 剂, 其 释 放 能 量 的 波 长 与 荧 光 基 团 的 性 质 有 关 分 子 信 标 的 茎 环 结 构 中, 环 一 般 为 15-30 个 核 苷 酸 长, 并 与 目 标 序 列 互 补 ; 茎 一 般 5-7 个 核 苷 酸 长, 并 相 互 配 对 形 成 茎 的 结 构 荧 光 基 团 连 接 在 茎 臂 的 一 端, 而 淬 灭 剂 则 连 接 于 另 一 端 分 子 信 标 必 须 非 常 仔 细 的 设 计, 以 致 于 在 复 性 温 度 下, 模 板 不 存 在 时 形 成 茎 环 结 构, 模 板 存 在 时 则 与 模 板 配 对 与 模 板 配 对 后, 分 子 信 标 的 构 象 改 变 使 得 荧 光 基 团 与 淬 灭 剂 分 开 当 荧 光 基 团 被 激 发 时, 它 发 出 自 身 波 长 的 光 子 ( 图 5 )
图 5. 分 子 信 标 工 作 原 理 3.TaqMan 探 针 TaqMan 探 针 是 多 人 拥 有 的 专 利 技 术 TaqMan 探 针 是 一 种 寡 核 苷 酸 探 针, 它 的 荧 光 与 目 的 序 列 的 扩 增 相 关 它 设 计 为 与 目 标 序 列 上 游 引 物 和 下 游 引 物 之 间 的 序 列 配 对 荧 光 基 团 连 接 在 探 针 的 5 末 端, 而 淬 灭 剂 则 在 3 末 端 当 完 整 的 探 针 与 目 标 序 列 配 对 时, 荧 光 基 团 发 射 的 荧 光 因 与 3 端 的 淬 灭 剂 接 近 而 被 淬 灭 但 在 进 行 延 伸 反 应 时, 聚 合 酶 的 5 外 切 酶
活 性 将 探 针 进 行 酶 切, 使 得 荧 光 基 团 与 淬 灭 剂 分 离 TaqMan 探 针 适 合 于 各 种 耐 热 的 聚 合 酶, 如 DyNAzymeTM II DNA 聚 合 酶 ( MJ Research 公 司 有 售 ) 随 着 扩 增 循 环 数 的 增 加, 释 放 出 来 的 荧 光 基 团 不 断 积 累 因 此 荧 光 强 度 与 扩 增 产 物 的 数 量 呈 正 比 关 系 图 6. Taqman 探 针 工 作 原 理 4. LUX Primers LUX (light upon extention) 引 物 是 利 用 荧 光 标 记 的 引 物 实 现 定 量 的 一 项 新 技 术 目 标 特 异 的 引 物 对 中 的 一 个 引 物 3 端 用 荧 光 报 告 基 团 标 记 在 没 有 单 链 模 板 的 情 况 下, 该 引 物 自 身 配 对, 形 成 发 夹 结 构, 使 荧 光 淬 灭 在 没 有 目 标 片 断 的 时 候, 引 物 与 模 板 配 对, 发 夹 结 构 打 开, 产 生 特 异 的 荧 光 信 号 ( 如 图 7 ) 图 7.LUX 引 物 工 作 原 理 与 Taqman 探 针 和 分 子 信 标 相 比, LUX 引 物 通 过 二 级 结 构 实 现 淬 灭, 不 需 要 荧 光 淬 灭 基 团, 也 不 需 要 设 计 特 异 的 探 针 序 列 因 为 LUX 引 物 是 一 个 相 对 较 新 的 技 术, 所 以 其 应 用 还 有 待 实 践 的 检 验 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 的 应 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 是 DNA 定 量 技 术 的 一 次 飞 跃 运 用 该 项 技 术, 我 们 可 以 对 DNA RNA 样 品 进 行 定 量 和 定 性 分 析 定 量 分 析 包 括 绝 对 定 量 分 析 和 相 对 定 量 分 析 前 者 可 以 得 到 某 个 样 本 中 基 因 的 拷 贝 数 和 浓 度 ; 后 者 可 以 对 不 同 方 式 处 理 的 两 个 样 本 中 的 基 因 表 达 水 平 进 行 比 较 除 此 之 外 我 们 还 可 以 对 PCR 产 物 或 样 品 进 行 定 性 分 析 : 例 如 利 用 熔 解 曲
线 分 析 识 别 扩 增 产 物 和 引 物 二 聚 体, 以 区 分 非 特 异 扩 增 ; 利 用 特 异 性 探 针 进 行 基 因 型 分 析 及 SNP 检 测 等 目 前 实 时 荧 光 PCR 技 术 已 经 被 广 泛 应 用 于 基 础 科 学 研 究 临 床 诊 断 疾 病 研 究 及 药 物 研 发 等 领 域 其 中 最 主 要 的 应 用 集 中 在 以 下 几 个 方 面 : 1. DNA 或 RNA 的 绝 对 定 量 分 析 包 括 病 原 微 生 物 或 病 毒 含 量 的 检 测, 转 基 因 动 植 物 转 基 因 拷 贝 数 的 检 测, RNAi 基 因 失 活 率 的 检 测 等 2. 基 因 表 达 差 异 分 析 例 如 比 较 经 过 不 同 处 理 样 本 之 间 特 定 基 因 的 表 达 差 异 ( 如 药 物 处 理 物 理 处 理 化 学 处 理 等 ), 特 定 基 因 在 不 同 时 相 的 表 达 差 异 以 及 cdna 芯 片 或 差 显 结 果 的 确 证 3. 基 因 分 型 例 如 SNP 检 测, 甲 基 化 检 测 等 随 着 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 的 推 广 和 普 及, 该 技 术 必 然 会 得 到 更 广 泛 的 应 用 生 物 谷 网 时 荧 光 定 量 PCR(real-time Q-PCR) 的 研 究 进 展 及 其 应 用 From: ibioo.com Update: 2008-08-03 多 聚 集 链 反 应 (polymerase chain reaction,pcr) 技 术 发 明 至 今 已 近 20 年 了, 在 这 期 间 技 术 得 到 了 不 断 的 发 展, 近 年 来 出 现 的 实 时 荧 光 定 量 PCR(real-time quantitative PCR) 技 术 实 现 了 PCR 从 定 性 到 定 量 的 飞 跃, 它 以 其 特 异 性 强 灵 敏 度 高 重 复 性 好 定 量 准 确 速 度 快 全 封 闭 反 应 等 优 点 成 为 了 分 子 生 物 学 研 究 中 的 重 要 工 具, 本 文 就 此 技 术 及 其 应 用 做 一 综 述 1 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 的 方 法 学 1.1 原 理 所 谓 real-time Q-PCR 技 术, 是 指 在 PCR 反 应 体 系 中 加 入 荧 光 基 团, 利 用 荧 光 信 号 累 积 实 时 监 测 整 个 PCR 进 程, 最 后 通 过 标 准 曲 线 对 未 知 模 板 进 行 定 量 分 析 的 方 法 在 realtime 技 术 的 发 展 过 程 中, 两 个 重 要 的 发 现 起 着 关 键 的 作 用 :(1) 在 90 年 代 早 期,Taq DN A 多 聚 酶 的 5 核 酸 外 切 酶 活 性 的 发 现, 它 能 降 解 特 异 性 荧 光 记 探 针, 因 此 使 得 间 接 的 检 测 PCR 产 物 成 为 可 能 (2) 此 后 荧 光 双 标 记 探 针 的 运 用 使 在 一 密 闭 的 反 应 管 中 能 实 时 地 监 测 反 应 全 过 程 这 两 个 发 现 的 结 合 以 及 相 应 的 仪 器 和 试 剂 的 商 品 化 发 展 导 致 real-time Q-PCR 方 法 在 研 究 工 作 中 的 运 用
PCR 反 应 过 程 中 产 生 的 DNA 拷 贝 数 是 呈 指 数 方 式 增 加 的, 随 着 反 应 循 环 数 的 增 加, 最 终 PCR 反 应 不 再 以 指 数 方 式 生 成 模 板, 从 而 进 入 平 台 期 在 传 统 的 PCR 中, 常 用 凝 胶 电 泳 分 离 并 用 荧 光 染 色 来 检 测 PCR 反 应 的 最 终 扩 增 产 物, 因 此 用 此 终 点 法 对 PCR 产 物 定 量 存 在 不 可 靠 之 处 在 real-time Q-PCR 中, 对 整 个 PCR 反 应 扩 增 过 程 进 行 了 实 时 的 监 测 和 连 续 地 分 析 扩 增 相 关 的 荧 光 信 号, 随 着 反 应 时 间 的 进 行, 监 测 到 的 荧 光 信 号 的 变 化 可 以 绘 制 成 一 条 曲 线 在 PCR 反 应 早 期, 产 生 荧 光 的 水 平 不 能 与 背 景 明 显 地 区 别, 而 后 荧 光 的 产 生 进 入 指 数 期 线 性 期 和 最 终 的 平 台 期, 因 此 可 以 在 PCR 反 应 处 于 指 数 期 的 某 一 点 上 来 检 测 PCR 产 物 的 量, 并 且 由 此 来 推 断 模 板 最 初 的 含 量 为 了 便 于 对 所 检 测 样 本 进 行 比 较, 在 real-time Q -PCR 反 应 的 指 数 期, 首 先 需 设 定 一 定 荧 光 信 号 的 域 值, 一 般 这 个 域 值 (threshold) 是 以 PC R 反 应 的 前 15 个 循 环 的 荧 光 信 号 作 为 荧 光 本 底 信 号 (baseline), 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3~15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 如 果 检 测 到 荧 光 信 号 超 过 域 值 被 认 为 是 真 正 的 信 号, 它 可 用 于 定 义 样 本 的 域 值 循 环 数 (Ct) Ct 值 的 含 义 是 : 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 域 值 时 所 经 历 的 循 环 数 研 究 表 明, 每 个 模 板 的 Ct 值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关 系, 起 始 拷 贝 数 越 多,Ct 值 越 小 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线, 因 此 只 要 获 得 未 知 样 品 的 Ct 值, 即 可 从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品 的 起 始 拷 贝 数 1.2 荧 光 化 学 目 前 real-time Q-PCR 所 使 用 的 荧 光 化 学 方 法 主 要 有 五 种, 分 别 是 :DNA 结 合 染 色, 水 解 探 针, 分 子 信 标, 荧 光 标 记 引 物, 杂 交 探 针 它 们 又 可 分 为 扩 增 序 列 特 异 和 非 特 异 的 检 测 两 大 类 扩 增 序 列 非 特 异 性 检 测 方 法 的 基 础 是 DNA 结 合 的 荧 光 分 子, 如 SYBR green 1 等 荧 光 染 料 Real-time Q-PCR 发 展 早 期 就 是 运 用 这 种 最 简 单 的 方 法, 在 PCR 反 应 体 系 中, 加 入 过 量 SY BR green 1 荧 光 染 料,SYBR green 1 荧 光 染 料 特 异 性 地 掺 入 DNA 双 链 后, 发 射 荧 光 信 号 荧 光 染 料 的 优 势 在 于 它 能 监 测 任 何 dsdna 序 列 的 扩 增, 不 需 要 探 针 的 设 计, 使 检 测 方 法 变 得 简 便, 同 时 也 降 低 了 检 测 的 成 本 然 而 正 是 由 于 荧 光 染 料 能 和 任 何 dsdna 结 合, 因 此 它 也 能 与 非 特 异 的 dsdna( 如 引 物 二 聚 体 ) 结 合, 使 实 验 容 易 产 生 假 阳 性 信 号 引 物 二 聚 体 的 问 题 目 前 可 以 用 带 有 熔 解 曲 线 (melting curve) 分 析 的 软 件 加 以 解 决 扩 增 序 列 特 异 性 检 测 方 法 是 在 PCR 反 应 中 利 用 标 记 荧 光 染 料 的 基 因 特 异 寡 核 苷 酸 探 针 来 检 测 产 物, 它 又 可 分 为 直 接 法 和 间 接 法 间 接 的 方 法 就 是 利 用 水 解 探 针 的 策 略 目 前 在 rea
l-time Q-PCR 中 最 广 泛 使 用 的 TaqMan 系 统 就 是 运 用 了 这 个 原 理 PCR 扩 增 时 在 加 入 一 对 引 物 的 同 时 加 入 一 个 特 异 性 的 荧 光 探 针, 该 探 针 为 一 寡 核 苷 酸, 两 端 分 别 标 记 一 个 报 告 荧 光 基 团 和 一 个 淬 灭 荧 光 基 团, 此 时 5 端 荧 光 基 团 吸 收 能 量 后 将 能 量 转 移 给 临 近 的 3 端 荧 光 淬 灭 基 团 ( 发 生 荧 光 共 振 能 量 转 移,FRET), 因 此 探 针 完 整 时, 检 测 不 到 该 探 针 5 端 荧 光 基 团 发 出 的 荧 光 但 在 PCR 扩 增 中, 溶 液 中 的 模 板 变 性 后 低 温 退 火 时, 引 物 与 探 针 同 时 与 模 板 结 合 在 引 物 的 介 导 下, 沿 模 板 向 前 延 伸 至 探 针 结 合 处, 发 生 链 的 置 换,Taq 酶 的 5-3 外 切 酶 活 性 ( 此 活 性 是 双 链 特 异 性 的, 游 离 的 单 链 探 针 不 受 影 响 ) 将 探 针 5 端 连 接 的 荧 光 基 团 从 探 针 上 切 割 下 来, 游 离 于 反 应 体 系 中, 从 而 脱 离 3 端 荧 光 淬 灭 基 团 的 屏 蔽, 接 受 光 刺 激 发 出 荧 光 信 号, 即 每 扩 增 一 条 DNA 链, 就 有 一 个 荧 光 分 子 形 成, 实 现 了 荧 光 信 号 的 累 积 与 PCR 产 物 形 成 完 全 同 步 直 接 的 方 法 指 的 是 标 记 荧 光 的 探 针 与 扩 增 产 物 结 合 后 即 直 接 产 生 荧 光, 分 子 信 标 (molecular beacon) 就 属 于 这 一 类, 它 本 质 上 是 一 种 标 记 荧 光 的 发 夹 探 针, 当 探 针 分 子 呈 发 夹 结 构 时, 结 合 在 其 两 端 的 荧 光 基 团 距 离 上 接 近, 使 得 产 生 能 量 转 移 效 应, 而 不 发 生 荧 光 当 互 补 序 列 出 现 时, 探 针 与 DNA 杂 交, 探 针 转 变 成 一 个 开 放 的 结 构, 呈 线 性, 报 告 荧 光 基 团 与 淬 灭 荧 光 基 团 彼 此 在 空 间 上 产 生 足 够 的 分 离, 荧 光 基 团 脱 离 了 淬 灭 基 团 的 影 响, 从 而 产 生 可 被 检 测 到 的 荧 光 荧 光 标 记 引 物 是 从 分 子 信 标 的 概 念 变 化 而 产 生 的 一 种 联 合 分 子 探 针 系 统, 它 把 荧 光 基 团 标 记 的 发 夹 结 构 的 序 列 直 接 与 PCR 引 物 相 结 合, 从 而 使 荧 光 标 记 基 团 直 接 掺 入 PCR 扩 增 产 物 中 目 前 主 要 有 两 种 : 日 出 引 物 (sunrise primes) 和 蝎 子 引 物 (scorpion primes) 杂 交 探 针 (hybridization probe) 使 用 两 个 特 异 的 探 针, 其 中 上 游 的 探 针 的 3 端 标 记 有 供 体 荧 光 素 (donor), 而 下 游 的 探 针 的 5 端 标 记 有 受 体 荧 光 素 (acceptor) 在 PCR 中 模 板 退 火 阶 段, 两 探 针 同 时 与 扩 增 产 物 杂 交, 并 形 成 头 尾 结 合 的 形 式, 使 供 体 和 受 体 荧 光 素 距 离 非 常 接 近, 两 者 产 生 荧 光 共 振 能 量 转 移 (FRET, 此 作 用 与 上 述 水 解 探 针 的 方 式 相 反 ), 使 得 受 体 荧 光 基 团 发 出 荧 光 ; 当 两 探 针 处 于 游 离 状 态 时, 无 荧 光 产 生 由 于 反 应 中 运 用 了 两 个 探 针, 因 此 增 加 了 方 法 的 特 异 性, 另 外 也 可 利 用 荧 光 寡 核 苷 酸 熔 解 曲 线 (melting curve) 对 与 寡 核 苷 酸 探 针 结 合 的 序 列 进 行 分 析, 从 中 获 取 有 用 的 信 息 1.3 定 量 方 法 在 real-time Q-PCR 中, 模 板 定 量 有 两 种 策 略 ; 相 对 定 量 和 绝 对 定 量 相 对 定 量 指 的 是 在 一 定 样 本 中 靶 序 列 相 对 于 另 一 参 照 样 本 的 量 的 变 化 绝 对 定 量 指 的 是 用 已 知 的 标 准 曲 线 来 推 算 未 知 的 样 本 的 量 1.3.1 标 准 曲 线 的 法 的 相 对 定 量 由 于 在 此 方 法 中 量 的 表 达 是 相 对 于 某 个 参 照 物 的 量 而 言 的, 因 此 相 对 定 量 的 标 准 曲 线 就 比 较 容 易 制 备, 对 于 所 用 的 标 准 品 只 要 知 道 其 相 对 稀 释 度 即 可 在 整 个 实 验 中 样 本 的 靶 序 列 的 量 来 自 于 标 准 曲 线, 最 终 必 须 除 以 参 照 物 的 量, 即 参 照 物 是 1* 的 样 本, 其 它 的 样 本 为 参 照 物 量 的 n 倍 在 实 验 中 为 了 标 准 化 加 入 反 应 体 系 的 RNA 或 DNA 的 量, 往 往 在 反 应 中 同 时 扩 增 一 内 源 控 制 物, 如 在 基 因 表 达 研 究 中, 内 源 控 制 物 常 为 一 些 管 家 基 因 ( 如 beta- actin,3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 GAPDH 等 ) 1.3.2 比 较 CT 法 的 相 对 定 量 比 较 CT 法 与 标 准 曲 线 法 的 相 对 定 量 的 不 同 之 处 于 在 于 其 运 用 了 数 学 公 式 来 计 算 相 对 量, 前 提 是 假 设 每 个 循 环 增 加 一 倍 的 产 物 数 量, 在 PCR 反 应 的 指 数 期 得 到 CT 值 来 反 应 起 始 模 板 的 量, 一 个 循 环 (CT=1) 的 不 同 相 当 于 起 始 模 板 数 2 倍 的 差
异 但 是 此 方 法 是 以 靶 基 因 和 内 源 控 制 物 的 扩 增 效 率 基 本 一 致 为 前 提 的, 效 率 的 偏 移 将 影 响 实 际 拷 贝 数 的 估 计 1.3.3 标 准 曲 线 法 的 绝 对 定 量 此 方 法 与 标 准 曲 线 法 的 相 对 定 量 的 不 同 之 处 在 于 其 标 准 品 的 量 是 预 先 可 知 的 质 粒 DNA 和 体 外 转 入 的 RNA 常 作 为 绝 对 定 量 标 准 品 的 制 备 之 用 标 准 品 的 量 可 根 据 260nm 的 吸 光 度 值 并 用 DNA 或 RNA 的 分 子 量 来 转 换 成 其 拷 贝 数 来 确 定 2 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 的 应 用 Real- time Q-PCR 的 应 用 范 围 很 广 泛, 包 括 mrna 表 达 的 研 究 DNA 拷 贝 数 的 检 测 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNPs) 的 测 定 等 以 下 就 目 前 real- time Q-PCR 在 易 位 基 因 的 检 测, 细 胞 因 子 的 表 达 分 析, 肿 瘤 耐 药 基 因 表 达 的 研 究 以 及 病 毒 感 染 的 定 量 监 测 中 的 应 用 作 一 概 述 2.1 微 小 残 留 病 变 的 检 测 肿 瘤 疾 病 尤 其 是 血 液 的 恶 性 肿 瘤 常 伴 有 特 异 性 基 因 的 易 位, 这 种 易 位 往 往 可 以 作 为 监 测 临 床 治 疗 效 果 的 一 种 肿 瘤 标 志 虽 然 在 过 去 的 几 十 年 里 治 疗 方 案 的 改 进 已 大 大 地 延 长 了 病 人 的 生 存 期, 但 是 缓 解 期 的 病 人 仍 存 在 复 发 的 危 险 性 因 此 微 小 残 留 病 变 (MRD) 的 检 测 对 于 进 一 步 调 整 治 疗 方 案 是 至 关 重 要 的 Real-time Q-PCR 的 应 用 正 成 为 检 测 肿 瘤 微 小 残 留 分 子 标 志 的 一 种 必 备 的 研 究 工 具 通 过 对 肿 瘤 融 合 基 因 的 定 量 测 定 能 指 导 临 床 对 病 人 实 行 个 体 化 的 治 疗 急 性 粒 细 胞 性 白 血 病 (AML) 最 常 见 的 染 色 体 异 常 是 交 互 易 位 t(8;21) (q 22;q22), 在 这 易 位 中,AML-1 转 录 因 子 基 因 和 8 号 染 色 体 的 MTG8 基 因 发 生 融 合, 致 使 正 常 的 AML-1 转 录 调 控 受 到 影 响, 这 可 能 是 白 血 病 的 病 因 目 前 的 研 究 证 明 用 real-time Q-PCR 来 检 测 融 合 基 因 有 助 于 对 这 些 病 人 的 MRD 进 行 定 量, 其 作 为 预 后 的 指 标 或 对 治 疗 方 案 的 评 估 是 有 价 值 的 同 样 的 方 法 也 被 用 于 定 量 其 它 的 易 位 融 合 基 因 水 平, 如 慢 性 粒 细 胞 性 白 血 病 (CML) 的 BCR-ABL 融 合 基 因 ; 急 性 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 (ALL) 的 白 血 病 特 异 的 TEL-AML1 融 合 基 因 ; 滤 泡 状 淋 巴 瘤 (FL) 的 染 色 体 易 位 t(14;18)(q32;q21) 和 bcl-2 重 排 等 许 多 研 究 都 在 很 大 程 度 上 受 益 于 real-time Q-PCR 方 法 的 应 用, 随 着 技 术 的 发 展,Real-time Q-PCR 的 运 用 将 不 断 地 扩 大 2.2 细 胞 因 子 的 表 达 分 析 细 胞 因 子 是 调 节 蛋 白, 它 通 过 调 节 免 疫 反 应 ( 包 括 淋 巴 细 胞 活 化 增 殖 分 化 生 存 和 凋 亡 ) 在 免 疫 系 统 中 起 着 核 心 作 用 许 多 不 同 类 型 的 细 胞 都 能 分 泌 这 种 低 分 子 量 的 蛋 白 质, 其 中 包 括 淋 巴 细 胞 抗 原 递 呈 细 胞 单 核 细 胞 内 皮 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 细 胞 因 子 可 被 分 为 不 同 的 组 ; 白 介 素 (IL-1~IL-23), 干 扰 素 (IFN-α,IFN-γ 等 ), 集 落 刺 激 因 子 (CSF), 肿 瘤 坏 死 因 子 (TNF), 肿 瘤 生 长 因 子 (TGF-β 等 ) 和 化 学 因 子 (MCP-1,MIP-1 等 ) 为 了 阐 明 在 许 多 炎 症 反 应, 自 身 免 疫 性 疾 病 和 器 官 移 植 排 异 中 的 免 疫 致 病 途 径, 细 胞 因 子 mrna 表 达 谱 的 可 靠 定 量 是 很 重 要 的 尽 管 被 检 样 本 中 细 胞 因 子 含 量 往 往 极 低, 然 而 real-time 反 转 灵 PCR(RT-PCR) 以 其 高 敏 感 性 和 准 确 性 在 细 胞 因 子 的 定 量 中 越 来 越 受 到 青 睐 2.3 肿 瘤 耐 药 基 因 表 达 的 研 究 对 化 疗 药 物 的 耐 药 是 治 疗 肿 瘤 病 人 的 主 要 障 碍 由 于 耐 药 限 制 了 许 多 肿 瘤 的 成 功 治 疗, 因 此 研 究 肿 瘤 细 胞 对 耐 药 机 制 就 变 得 十 分 重 要 目 前 研 究 中 发 现 主 要 的 耐 药 机 制 有 :ATP 结 合 盒 基 因 超 家 族 (ATP-binding cassette superfamily) 的 膜 转 运 蛋 白 介 导 的 耐 药, 这 些 蛋 白 包 括 :MDR-1 基 因 编 码 的 P- 糖 蛋 白 (P- gp), 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 (MRP), 肺 耐 药 相 关 蛋 白 (LRP), 乳 腺 癌 耐 药 蛋 白 (BCRP) 等 ; 酶 介 导 的 耐 药, 包 括 拓 扑 导 构 酶 (Topo), 谷 胱 甘 肽 (GSH) 及 谷 胱 甘 肽 -S- 转 移 酶 (GST), 蛋 白 激 酶 C(PKC), 脱 氧 胞 嘧 啶 核 苷 激 酶 (deoxycytidine kinase) 等, 凋 亡 基 因 介 导 的 耐 药, 如 bcl-2 家 族,p53 基 因,c-myc 等 多 药 耐 药 (MDR) 是 多 因 素, 多 种 机 制 共 同 作 用 的 结 果 real- time 反 转
录 PCR(RT-PCR) 是 了 解 肿 瘤 耐 药, 指 导 临 床 治 疗 策 略 的 有 用 手 段, 它 能 观 测 用 药 前 后 及 复 发 时 肿 瘤 细 胞 的 耐 药 基 因 mrna 表 达 变 化, 从 而 及 时 调 整 治 疗 方 案 和 评 价 疾 病 的 预 后 2.4 病 毒 感 染 的 定 量 监 测 扩 增 技 术 的 发 展 使 得 对 病 毒 的 定 性 或 定 量 检 测 的 能 力 随 之 提 高, 也 使 研 究 病 毒 的 负 荷 和 疾 病 进 展 的 关 系 成 为 可 能 Real-time Q-PCR 是 主 要 被 运 用 于 科 研 和 诊 断 领 域 的 扩 增 技 术, 它 不 仅 能 对 病 毒 定 性, 而 且 由 于 其 实 验 的 批 间 和 批 内 差 异 小, 重 复 性 好, 因 此 能 方 便 快 速 灵 敏 准 确 地 定 量 病 毒 DNA 或 RNA 的 序 列, 更 重 要 的 是 从 中 可 以 动 态 地 研 究 在 整 个 病 程 中 潜 在 病 毒 的 复 活 或 持 续, 从 而 使 临 床 医 生 和 病 毒 学 家 能 检 测 临 床 的 变 化, 如 抗 病 毒 治 疗 的 效 果, 耐 药 变 异 的 出 现 等 目 前 运 用 较 多 的 是 在 器 官 移 值 中 对 使 用 免 疫 抑 制 剂 的 病 人 用 Real- time Q-PCR 来 定 量 测 定 CMV 感 染 研 究 表 明 在 骨 髓 移 植 的 病 人 中 用 Real-time Q-PCR 检 测 CMV 感 染 比 传 统 的 pp65 抗 原 试 验 更 敏 感, 抗 CMV 药 物 治 疗 能 使 血 中 的 病 毒 含 量 下 降,Real-time Q-PCR 对 于 快 速 定 量 骨 移 植 病 人 的 CMV 感 染 和 监 测 CMV 复 活 是 一 个 有 用 的 工 具 3 存 在 的 问 题 及 应 用 前 景 在 real-time Q-PCR 技 术 中, 无 论 是 相 对 定 量 还 是 标 准 曲 线 定 量 方 法 仍 存 在 一 些 PCR 定 量 方 法 均 有 的 问 题 有 待 解 决 在 标 准 曲 线 定 量 中, 标 准 品 的 制 备 是 一 个 必 不 可 少 的 过 程 目 前 由 于 无 一 统 一 标 准, 各 个 实 验 室 所 用 的 生 成 标 准 曲 线 的 样 品 各 不 相 同, 致 使 实 验 结 果 缺 乏 可 比 性 此 外, 用 real-time Q-PCR 来 研 究 mrna 时, 受 到 不 同 RNA 样 本 存 在 不 同 的 逆 转 录 (RT) 效 率 的 限 制 在 相 对 定 量 中, 其 前 提 是 假 设 内 源 控 制 物 不 受 实 验 条 件 的 影 响 的, 合 理 地 选 择 合 适 的 不 受 实 验 条 件 影 响 的 内 源 控 制 物 也 是 实 验 结 果 可 靠 与 否 的 关 键 另 外, 与 传 统 的 PCR 技 术 相 比,Real-time Q-PCR 的 不 足 之 处 是 :(1) 由 于 运 用 了 封 闭 的 检 测, 减 少 了 扩 增 后 电 泳 的 检 测 步 骤, 因 此 也 就 不 能 监 测 扩 增 产 物 的 大 小 ;(2) 因 为 荧 光 素 种 类 以 及 检 测 光 源 的 局 限 性, 从 而 相 对 地 限 制 了 real-time Q-PCR 的 复 合 式 (multiplex) 检 测 的 应 用 能 力 ;(3) 目 前 real-time Q-PCR 实 验 成 本 比 较 高, 从 而 也 限 制 了 其 广 泛 的 应 用 随 着 技 术 不 断 改 进 和 发 展 目 前 real-time Q-PCR 已 成 为 科 研 的 主 要 工 具, 该 技 术 未 来 的 应 用 前 景 是 令 人 鼓 舞 的, 一 方 面 real-time Q-PCR 技 术 与 其 它 分 子 生 物 学 技 术 相 结 合 使 定 量 极 微 量 的 基 因 表 达 或 DNA 拷 贝 数 成 为 可 能 另 一 方 面 荧 光 标 记 核 酸 化 学 技 术 和 寡 核 苷 酸 探 针 杂 交 技 术 的 发 展 以 及 real-time Q- PCR 技 术 的 应 用, 使 定 量 PCR 技 术 有 一 个 足 够 的 基 础 为 广 大 临 床 诊 断 实 验 室 所 接 受, 将 有 助 于 临 床 医 生 对 疾 病 的 诊 断 和 治 疗 4 结 语 Real- time Q-PCR 的 发 展 使 得 研 究 人 员 又 多 了 一 种 比 较 简 单 且 自 动 化 的 手 段 去 研 究 许 多 重 要 的 基 础 课 题 虽 然 此 技 术 仍 存 在 一 些 不 足 需 要 改 进, 但 是 它 为 real- time Q-PCR 在 常 规 诊 断 检 测 中 的 运 用 打 下 了 良 好 的 基 础 Real-time Q-PCR 将 成 为 未 来 分 子 生 物 学 实 验 室 必 备 的 研 究 工 具