328 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology http://journals.im.ac.cn/cjbcn DOI: 10.13345/j.cjb.140300 朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 March 25, 2015, 31(3): 328 337 2015 Chin J Biotech, All rights reserved 综 述 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 朱 莉, 许 超 艳, 李 晶 晶, 田 俊, 冯 昭 中, 彭 学 江 苏 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院, 江 苏 徐 州 221116 朱 莉, 许 超 艳, 李 晶 晶, 等. 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展. 生 物 工 程 学 报, 2015, 31(3): 328 337. Zhu L, Xu CY, Li JJ, et al. Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 328 337. 摘 要 : 对 羟 基 苯 甲 酸 (4-Hydroxybenzoate,4HBA) 是 用 途 广 泛 的 有 机 原 料, 现 行 的 生 产 工 艺 是 以 石 油 成 分 合 成 而 得, 在 环 境 污 染 不 断 恶 化 人 类 生 存 已 经 面 临 威 胁 之 际, 开 发 利 用 可 再 生 资 源 的 生 产 工 艺 已 成 为 全 球 当 务 之 急 本 综 述 在 简 要 介 绍 从 石 油 成 分 合 成 4HBA 之 后, 主 要 阐 述 利 用 植 物 和 微 生 物 从 可 再 生 资 源 合 成 4HBA 的 研 究 进 展 莽 草 酸 途 径 是 生 物 合 成 芳 香 族 化 合 物 的 重 要 途 径, 从 该 途 径 的 最 终 产 物 分 支 酸 到 4HBA 有 两 条 途 径 一 条 是 分 支 酸 裂 解 酶 直 接 催 化 分 支 酸 生 成 4HBA ( 莽 草 酸 - 分 支 酸 路 线 ) 另 外 一 条 途 径 是 在 植 物 细 胞 内 引 入 荧 光 假 单 胞 菌 Pseudomonas fluorescens 的 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 裂 解 酶 打 通 从 苯 丙 素 合 成 4HBA 的 通 路 ( 植 物 苯 丙 素 路 线 ) 最 后 介 绍 了 一 个 天 然 合 成 积 累 4HBA 的 微 泡 菌 Microbulbifer, 并 对 其 深 入 研 究 进 行 了 展 望 关 键 词 : 对 羟 基 苯 甲 酸, 合 成 生 物 学, 莽 草 酸 途 径 Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote Li Zhu, Chaoyan Xu, Jingjing Li, Jun Tian, Zhaozhong Feng, and Xue Peng School of Life Sciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, Jiangsu, China Abstract: 4-Hydroxybenzoate (4HBA) is an important chemical compound used for synthesis of liquid crystal. Production of 4HBA from renewable resources is an effective mean to solve problems such as environmental pollution and petroleum shortage. This review briefly introduces the chemical synthesis of 4HBA from oil compounds, and mainly describes the progress in 4HBA biosynthesis from renewable resources by plants and microorganisms. In most intriguing aspect of plant-based synthesis of 4HBA is the appeal of directly synthesizing a chemical from CO 2. However, the Received: May 28, 2014; Accepted: October 15, 2014 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31240088), Science and Technology Project of Xuzhou (No. XM12B105), Jiangsu Science and Technology Agency Project (No. BK20141148). Corresponding author: Xue Peng. Tel/Fax: +86-516-83500033; E-mail: pengxue@jsnu.edu.cn 国 家 自 然 科 学 基 金 (No. 31240088), 徐 州 市 科 技 项 目 (No. XM12B105), 江 苏 科 技 厅 项 目 (No. BK20141148) 资 助 网 络 出 版 时 间 :2014-12-03 网 络 出 版 地 址 :http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140300.html
朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 329 glucosylation system in plant cells converting 4HBA to glucose conjugates, causing the post treatment a problem. The recombinant microorganisms produce pure 4HBA, but less efficient. A new strain of Microbulbifer has ability to naturally accumulate 4HBA from glucose. Elucidation of the metabolic pathways and regulation systems would improve 4HBA synthesis efficiency. Keywords: 4 hydroxybenzoate, synthetic biology, shikimate pathway 对 羟 基 苯 甲 酸 (4-Hydroxybenzoate,4HBA) 是 用 途 广 泛 的 有 机 合 成 原 料, 主 要 应 用 于 食 品 化 妆 品 医 药 的 防 腐 和 防 霉 剂 杀 菌 剂 的 合 成 方 面 2002 年, 我 国 4HBA 的 生 产 量 为 6 000 t, 并 以 每 年 11.4% 的 速 度 递 增, 预 计 2014 年 的 生 产 量 可 达 20 000 t 以 上 [1] 4HBA 的 用 途 之 一 是 4HBA 酯 类 的 合 成, 该 酯 类 化 合 物 的 英 文 名 为 Paraben, 其 中 甲 酯 又 名 为 尼 泊 金 甲, 乙 酯 又 名 为 尼 泊 金 乙, 是 目 前 使 用 最 多 的 防 腐 剂 [2] 4HBA 的 另 外 一 个 重 要 用 途 是 合 成 液 晶 高 分 子 [3] 液 晶 是 在 1959 年 利 用 4HBA 的 乙 酸 酯 经 熔 融 和 固 相 聚 缩 合 后 首 次 获 得, 后 来 经 过 改 良 成 具 有 实 用 价 值 的 材 料 现 在 市 场 上 的 液 晶 商 品 Xydar 是 4HBA 对 苯 二 酚 和 酞 酸 的 聚 合 物 ; X-7G 是 4HBA 和 聚 对 苯 二 甲 酸 乙 二 酯 在 熔 融 状 态 下 的 聚 合 物 ; Vectra 是 4HBA 和 2- 羟 基 -6- 萘 甲 酸 熔 融 聚 合 物 ; Tian 是 4HBA 和 2- 羟 基 -6- 萘 甲 酸 及 对 苯 二 酚 的 聚 合 物 随 着 电 子 信 息 化 社 会 的 不 断 发 展,4HBA 的 市 场 需 求 量 日 益 增 加, 现 行 的 4HBA 生 产 工 艺 是 从 石 油 成 分 合 成 而 得, 在 环 境 污 染 的 不 断 恶 化 人 类 的 生 存 已 经 面 临 威 胁 之 际, 利 用 可 再 生 资 源 代 替 以 石 油 为 原 料 的 生 产 工 艺 已 成 为 全 球 当 务 之 急 4HBA 的 化 学 结 构 类 似 于 芳 香 族 氨 基 酸, 在 理 论 上 利 用 生 物 的 芳 香 族 氨 基 酸 合 成 途 径, 即 莽 草 酸 途 径 (Shikimate pathway) 可 以 合 成 4HBA 这 篇 综 述 首 先 介 绍 现 行 的 4HBA 化 学 合 成 工 艺, 然 后 着 重 阐 述 利 用 植 物 和 微 生 物 从 可 再 生 资 源 合 成 4HBA 的 实 例, 为 生 物 合 成 4HBA 提 供 理 论 依 据 1 从 石 油 成 分 合 成 4HBA 1.1 化 学 合 成 现 行 的 4HBA 生 产 工 艺 是 以 石 油 产 物 的 苯 (Benzene) 和 丙 烯 (Propylene) 出 发, 在 催 化 剂 氯 化 铝 的 存 在 下 高 温 高 压 合 成 异 丙 苯 (Cumene), 然 后 将 异 丙 苯 在 80 130 左 右 用 氧 气 氧 化 成 过 氧 化 氢 异 丙 苯 (Cumenehydroperoxide) ( 图 1A) 过 氧 化 氢 异 丙 苯 在 酸 性 和 60 100 条 件 下 生 成 苯 酚 (Phenol) [4] 从 苯 酚 到 4HBA 的 制 备 有 多 种 方 法 常 规 工 艺 是 利 用 Kolbe-Schmitt 反 应, 即 将 苯 酚 加 入 KOH 制 备 成 酚 钾 盐, 然 后 与 二 氧 化 碳 在 高 温 高 压 下 进 行 气 固 相 羧 基 化 反 应 生 成 4HBA 整 个 合 成 工 艺 必 须 在 高 温 高 压 下 进 行, 需 要 消 耗 大 量 能 源 导 致 生 产 效 率 低 成 本 高 特 别 是 合 成 途 径 中 有 环 境 污 染 物 质 苯 酚 的 生 成, 给 工 业 排 水 的 处 理 带 来 很 大 困 难 [5] 1.2 生 物 转 化 白 色 生 物 技 术 (White biotechnology) 是 近 年 来 提 出 的 新 概 念, 即 利 用 已 知 的 代 谢 调 节 机 理 对 各 种 微 生 物 进 行 改 造, 构 建 成 一 个 细 胞 工 厂, 使 其 更 好 地 服 务 于 人 类 甲 苯 (Toluene) 是 石 油 中 的 一 种 没 有 得 到 有 效 利 用 的 芳 香 族 成 分, 一 些 研 究 人 员 利 用 白 色 生 物 技 术 将 恶 臭 假 cjb@im.ac.cn
330 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.3 单 胞 菌 Pseudononas putida DOT-T1E 改 造 成 一 [6-9] 个 从 甲 苯 合 成 4HBA 的 细 胞 工 厂 ( 图 1B) DOT-T1E 菌 株 本 来 是 甲 苯 降 解 菌 株, 且 耐 有 机 溶 剂 DOT-T1E 菌 株 降 解 甲 苯 的 第 一 步 骤 是 由 甲 苯 双 加 氧 酶 催 化 将 甲 苯 氧 化 为 cis- 甲 苯 2,3- 二 氢 二 醇 (cis-toluene 2,3-dihydrodiol), 该 酶 由 todc1c2ba 基 因 编 码 todd 基 因 编 码 的 脱 氢 酶 将 cis- 甲 苯 2,3- 二 氢 二 醇 氧 化 成 3- 甲 基 苯 二 酚 (3-Methylcatechol), 然 后 开 环 后 进 入 三 羧 酸 循 环 [6] Ramos-González 等 将 编 码 甲 苯 双 加 氧 酶 基 因 中 的 todc 基 因 敲 除, 同 时 将 该 菌 株 的 poba 基 因 也 敲 除 掉 构 建 成 一 个 甲 苯 营 养 缺 陷 型 (DOT- todc poba),poba 编 码 的 是 4HBA-4- 羟 化 酶, 催 化 氧 化 4HBA 成 原 儿 茶 酸 (Protocatechuate) 的 反 应 DOT- todc poba 成 为 不 能 降 解 甲 苯 和 4HBA 的 菌 株 在 此 遗 传 背 景 下, 负 责 转 化 甲 苯 图 1 利 用 石 油 成 分 和 可 再 生 资 源 的 4 条 4HBA 合 成 途 径 Fig. 1 Four 4HBA synthetic routes from oil compounds and renewable source. (A) Chemical synthesis route with benzene as raw material. (B) Biocatalysis synthesis route with toluene as raw material. (C) Shikimate-chorismate pathway. (D) Plant phenylpropanoids pathway. http://journals.im.ac.cn/cjbcn
朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 331 至 4HBA 的 一 系 列 基 因 从 门 多 萨 假 单 胞 菌 Pseudomonas mendocina KR1 菌 株 引 入 到 该 菌 株 的 染 色 体 中, 构 建 成 DOT-T1E-24 菌 株 这 一 系 列 基 因 包 括 :tmoabcdef, 编 码 甲 苯 单 加 氧 酶, 催 化 的 反 应 是 在 甲 苯 的 4 位 引 入 一 个 羟 基 生 成 甲 酚 (p-cresol);pcubxa 编 码 甲 酚 单 加 氧 酶, 催 化 将 甲 酚 氧 化 为 4- 羟 基 苯 醇 (4-Hydroxybenzyl alcohol) 和 进 一 步 氧 化 为 4- 羟 基 苯 醛 (4-Hydroxybenzyl aldehyde) 的 两 步 反 应 ;pcuc 编 码 4- 羟 基 苯 醛 脱 氢 酶, 催 化 生 成 4HBA 的 反 应 在 摇 瓶 分 批 培 养 条 件 下 DOT-T1E-24 菌 株 成 功 将 甲 苯 转 化 成 4HBA, 并 得 到 12 mmol/l 的 积 累 记 录 从 石 油 成 分 甲 苯 出 发, 理 论 上 一 个 甲 苯 可 以 合 成 一 个 4HBA 2 利 用 植 物 的 生 物 合 成 2.1 利 用 莽 草 酸 途 径 的 4HBA 合 成 莽 草 酸 途 径 由 7 步 反 应 合 成 分 支 酸 (Chorismate), 是 普 遍 存 在 于 植 物 真 菌 和 细 菌 中 的 一 条 重 要 芳 香 族 氨 基 酸 合 成 代 谢 途 径 第 一 步 是 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 和 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 缩 合 成 一 个 七 碳 酮 糖 开 环 磷 酸 化 合 物,3- 脱 氧 -β- 阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 (DAHP) [10] 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 和 赤 藓 糖 4- 磷 酸 分 别 是 糖 酵 解 途 径 和 磷 酸 戊 糖 途 径 上 的 重 要 中 间 代 谢 产 物 分 支 酸 是 合 成 酪 氨 酸 色 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 的 分 支 点, 从 分 支 酸 到 4HBA 的 合 成 途 径 有 3 条 第 一 条 是 分 支 酸 裂 解 酶 (Chorismate lyase, UbiC) 直 接 催 化 分 支 酸 生 成 4HBA ( 分 支 酸 裂 解 酶 途 径 ) [11-12] ( 图 1C) 第 二 条 是 利 用 合 成 苯 丙 素 (Phenylpropanoids) 的 途 径 ( 苯 丙 素 途 径 ) ( 图 1D) 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 催 化 脱 掉 芳 香 族 氨 基 酸 上 的 氨 基 生 成 相 应 的 苯 丙 素, 然 后 和 CoA 链 接 成 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA (4-Hydroxycinnamoyl-CoA) 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 裂 解 酶 (4-Hydroxycinnamoyl-CoA lyase,hchl), 催 化 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 的 侧 链 生 成 对 羟 基 苯 甲 醛 (4-Hydroxybenzaldehyde), 然 后 该 产 物 被 氧 化 成 4HBA [13] HCHL 基 因 在 植 物 中 不 存 在, 从 外 源 引 入 后 能 打 通 从 苯 丙 素 合 成 4HBA 的 通 路 第 三 条 在 胡 萝 卜 Daucuscarota 中 被 发 现, 属 于 对 羟 基 肉 桂 酸 -CoA 非 依 赖 途 径 [14-16] 苯 丙 氨 酸 在 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 的 催 化 下 生 成 肉 桂 酸 (Cinnamate), 肉 桂 酸 羟 化 酶 在 4 位 引 入 一 个 羟 基, 生 成 对 羟 基 肉 桂 酸, 再 通 过 非 氧 化 途 径 (Non-β-oxidative route) 合 成 4HBA 植 物 细 胞 是 从 CO 2 合 成 的, 无 论 哪 条 途 径, 其 理 论 得 率 是 4HBA/7CO 2 2.2 重 组 植 物 利 用 重 组 烟 草 作 为 4HBA 的 生 产 宿 主 有 两 [17] 个 报 道 一 是 Mayer 等 在 烟 草 的 细 胞 质 内 表 达 荧 光 假 单 胞 菌 Pseudomonas fluorescence AN103 的 HCHL 基 因, 使 酪 氨 酸 能 够 生 成 4HBA 获 得 的 4HBA 产 量 为 烟 草 总 量 的 2.9%, 但 是 得 到 的 4HBA 都 是 葡 糖 基 化 产 物, 而 且 重 组 烟 草 的 [18] 生 长 受 到 影 响 二 是 杜 邦 公 司 的 Viitanen 等 [19-20] 和 Sommer 等 把 大 肠 杆 菌 的 ubic 基 因 转 化 到 烟 草 的 叶 绿 体 染 色 体 上, 并 在 其 上 游 插 入 在 叶 绿 体 中 特 异 转 录 的 启 动 子 ubic 基 因 在 烟 草 的 叶 绿 体 内 表 达 成 功, 并 合 成 了 4HBA, 产 量 为 烟 草 总 量 的 13%, 但 得 到 的 4HBA 也 都 是 葡 糖 基 化 产 物 另 外 利 用 植 物 作 为 4HBA 生 产 宿 主 的 还 有 [21] Rahman 等 把 HCHL 基 因 重 组 到 甜 菜 Beta vulgaris 染 色 体 中 合 成 了 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA, 产 量 为 cjb@im.ac.cn
332 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.3 [22] 甜 菜 总 重 的 14% Mitra 等 把 荧 光 假 单 胞 菌 P. fluorescence AN103 的 HCHL 基 因 重 组 到 曼 陀 罗 甜 菜 Daturastramonium 染 色 体 中 合 成 了 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA, 产 量 为 曼 陀 罗 甜 菜 总 重 的 [23] 0.5% McQualter 等 向 甘 蔗 Sugarcane 内 分 别 导 入 了 HCHL 基 因 和 ubic 基 因, 比 较 了 4HBA 的 产 量, 发 现 HCHL 基 因 重 组 株 的 产 量 高 于 ubic 基 因 重 组 株 从 HCHL 基 因 重 组 株 的 叶 子 里 得 到 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA, 产 量 为 叶 子 总 重 的 7.3% 利 用 0.1 mol/l 的 NaCl 水 解 葡 糖 基 化 和 酯 化 4HBA 可 以 获 得 4HBA 利 用 光 合 作 用 的 植 物 合 成 4HBA 的 最 大 优 点 是 直 接 利 用 二 氧 化 碳, 省 去 了 繁 琐 的 木 质 纤 维 素 的 糖 化 过 程 但 是 植 物 细 胞 中 含 有 葡 糖 基 转 移 酶, 将 4HBA 葡 糖 基 化 或 酯 化, 给 下 游 提 纯 工 程 带 来 困 难 另 外 利 用 胡 萝 卜 甜 菜 和 甘 蔗 等 食 物 资 源 生 产 工 业 原 料 会 造 成 粮 食 价 格 的 上 涨, 给 社 会 带 来 不 安 定 因 素 3 利 用 微 生 物 的 生 物 合 成 3.1 大 肠 杆 菌 Escherichia coli 利 用 微 生 物 生 产 4HBA 的 研 究 和 植 物 相 比 比 较 少 美 国 密 歇 根 州 立 大 学 的 Frost 教 授 课 题 [24] 组 对 大 肠 杆 菌 进 行 了 一 系 列 的 重 组 转 化, 构 建 了 一 株 重 组 菌 从 葡 萄 糖 生 物 合 成 了 4HBA 在 大 肠 杆 菌 中 生 物 合 成 的 4HBA 没 有 被 糖 基 化 或 酯 化 该 课 题 组 利 用 的 菌 株 是 E. coli D2704 [pheatyratrpe-c], 合 成 酪 氨 酸 苯 丙 氨 酸 和 色 氨 酸 的 3 个 基 因 (phea tyra 和 trpe) 均 被 敲 除 因 此 培 养 E. coli D2704 时 必 须 在 培 养 基 中 加 入 3 种 芳 香 族 氨 基 酸 在 E. coli D2704 的 染 色 体 上 引 入 了 3 个 外 源 基 因 : 一 个 是 经 过 诱 变 的 DAHP 合 成 酶 基 因 arof FRB, 其 酶 活 性 不 受 中 间 代 谢 产 物 的 反 馈 抑 制 ; 二 是 分 支 酸 裂 解 酶 ubic 基 因, 负 责 将 分 支 酸 转 化 成 4HBA; 三 是 转 酮 醇 酶 tklt 基 因, 用 来 大 量 提 供 莽 草 酸 途 径 的 中 间 体 赤 藓 糖 4- 磷 酸 最 后 向 该 重 组 菌 中 转 化 了 一 个 在 tac 启 动 子 下 高 效 表 达 一 系 列 莽 草 酸 途 径 基 因 的 质 粒, 包 括 3- 磷 酸 莽 草 酸 1- 羧 乙 烯 基 转 移 酶 基 因 aroa 莽 草 酸 激 酶 基 因 arol 分 支 酸 合 成 酶 基 因 aroc 和 3- 脱 氢 奎 尼 酸 基 因 arob 最 终 构 建 的 菌 株 名 为 E. coli JB161 [pjb2.274] 在 实 验 室 规 模 上 生 产 了 12.0 g/l 4HBA (98.4 mmol/l), 对 葡 [24] 萄 糖 的 收 率 为 13% 另 外 Barker 等 还 调 查 了 4HBA 对 大 肠 杆 菌 的 毒 性 实 验 证 明 10 g/l 的 4HBA 会 抑 制 大 肠 杆 菌 的 生 长 繁 殖, 同 时 抑 制 了 莽 草 酸 的 中 间 体 3- 脱 氢 莽 草 酸 的 产 量 以 上 实 验 说 明 利 用 重 组 大 肠 杆 菌 生 产 的 4HBA 虽 然 没 有 被 糖 基 化 或 酯 化, 但 是 4HBA 对 大 肠 杆 菌 表 现 出 了 毒 性, 提 高 产 量 比 较 困 难 另 外 培 养 基 中 需 要 添 加 芳 香 族 氨 基 酸, 使 培 养 基 的 制 备 复 杂 化 而 且 生 产 成 本 提 高 3.2 恶 臭 假 单 胞 菌 Pseudomonas putida 恶 臭 假 单 胞 菌 P. putida S12 是 一 个 耐 有 机 [25-26] 溶 剂 菌 株,Verhoef 等 将 其 4HBA 羟 化 酶 (4HBA hydroxylase) 基 因 poba 敲 除 后, 转 化 了 一 个 载 有 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 (Phenyalanine ammonia lyase, Pal) 基 因 的 质 粒, 构 建 成 S12palB1 菌 株, 该 菌 株 失 去 了 降 解 4HBA 的 能 力 S12palB1 菌 株 能 将 酪 氨 酸 通 过 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 转 化 为 对 羟 基 肉 桂 酸, 然 后 利 用 对 羟 基 肉 桂 酸 降 解 途 径 合 成 4HBA 以 葡 萄 糖 为 初 始 基 质 在 摇 瓶 中 培 养 S12palB1 菌 株 得 到 11% 4HBA/ 葡 萄 糖 (Cmol%) 为 了 提 高 莽 草 酸 途 径 的 前 体 http://journals.im.ac.cn/cjbcn
朱 莉 等 / 生 物 合 成 对 羟 基 苯 甲 酸 的 研 究 进 展 333 [27] 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 供 应,Meijnen 等 将 大 肠 杆 菌 的 木 糖 降 解 基 因 xylab 引 入 到 S12palB1 菌 株 的 染 色 体 上 构 建 成 S12xylB7 菌 株, 使 该 菌 株 获 得 了 利 用 木 糖 的 功 能 xylab 基 因 分 别 编 码 木 糖 异 构 酶 和 木 酮 糖 激 酶, 催 化 木 糖 转 化 为 木 酮 糖 -5- 磷 酸 的 反 应, 构 建 了 从 木 糖 到 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 途 径 在 同 时 提 供 甘 油 和 木 糖 的 培 养 基 中, 合 成 出 来 的 4HBA 对 基 质 的 收 率 为 16.3% (Cmol%) 4HBA 是 从 葡 萄 糖 合 成 而 得, 如 果 葡 萄 糖 的 6 个 碳 在 发 酵 过 程 中 没 有 生 成 CO 2 释 放 出 去, 全 部 用 于 4HBA 的 合 成, 那 么 碳 的 理 论 收 率 (Cmol%) 应 该 为 100%, 而 质 量 的 理 论 收 率 (W/W) 为 65.6% [28] 从 这 个 数 字 来 看, 开 发 改 造 的 潜 力 非 常 大 3.3 酿 酒 酵 母 Saccharomyces cerevisiae [29] Krömer 等 将 酿 酒 酵 母 S. cerevisiae 的 编 码 分 支 酸 变 位 酶 (Chorismate mutase) 基 因 aro7 敲 除 掉 构 建 成 aro7 菌 株, 因 此 该 菌 株 是 酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 的 营 养 缺 陷 型 然 后 把 载 有 大 肠 杆 菌 ubic 基 因 的 质 粒 转 化 进 aro7 菌 株 中 构 建 成 aro7pcv3-ubic 菌 株 该 菌 株 从 83.3 mmol/l 葡 萄 糖 合 成 了 650 μmol/l 的 4HBA, 相 当 于 0.6% 4HBA/ 葡 萄 糖 产 量 不 是 很 理 想, 这 是 由 于 大 肠 杆 菌 的 ubic 基 因 的 密 码 子 偏 好 性 和 酿 酒 酵 母 的 差 异 很 大,ubiC 基 因 没 有 得 到 有 效 表 达 迄 今 为 止 没 有 发 现 酿 酒 酵 母 的 ubic 基 因, 今 后 只 能 通 过 人 工 改 良 大 肠 杆 菌 的 ubic 基 因 来 提 高 4HBA 的 产 量 另 外 酿 酒 酵 母 也 不 存 在 对 羟 基 肉 桂 酸 降 解 途 径, 从 酪 氨 酸 合 成 4HBA 的 难 度 很 大 利 用 酿 酒 酵 母 作 为 4HBA 合 成 宿 主 的 最 大 优 点 是 糖 利 用 效 率 高, 而 且 高 浓 度 的 糖 不 抑 制 菌 株 的 生 长 繁 殖 4 微 泡 菌 Microbulbifer 的 次 级 代 谢 产 物 4.1 微 泡 菌 Microbulbifer 微 泡 菌 Microbulbifer 又 称 溶 藻 细 菌, 属 于 变 形 菌 纲, 广 泛 分 布 于 海 洋 环 境 中, 它 生 产 的 生 理 活 性 物 质 以 及 海 藻 成 分 降 解 酶 等 越 来 越 受 到 人 们 的 重 视 [30-32] 2006 年, 本 课 题 组 首 次 发 现 从 海 洋 环 境 中 分 离 出 的 微 泡 菌 Microbulbifer 菌 株 有 合 成 4HBA 和 4HBA 酯 类 的 功 能, 在 我 们 的 调 查 范 围 内 A4B-17 菌 株 所 合 成 的 量 最 多 [33] [34] 后 来 Quévrain 等 在 2009 年 也 报 道 了 他 们 分 离 的 微 泡 菌 Microbulbifer 菌 株 也 合 成 了 4HBA 合 成 积 累 4HBA 和 酯 类 是 微 泡 菌 Microbulbifer 的 一 个 特 征 4HBA 是 芳 香 族 高 分 子 木 质 素 的 降 解 产 物, 在 土 壤 环 境 中 很 多 微 生 物 拥 有 降 解 4HBA 基 因,4HBA 不 会 在 体 内 外 积 累 [35-37] 微 泡 菌 Microbulbifer 是 在 海 洋 环 境 中 生 存 的 微 生 物, 表 现 出 和 土 壤 环 境 不 同 的 面 目, 不 但 不 降 解 而 且 还 合 成 积 累 4HBA 4.2 微 泡 菌 Microbulbifer sp. A4B-17 菌 株 微 泡 菌 Microbulbifer sp. A4B-17 菌 株 在 含 有 葡 萄 糖 的 培 养 基 中 培 养 时 有 合 成 积 累 4HBA 和 其 酯 化 物 的 功 能, 当 细 胞 进 入 稳 定 期 后 在 培 养 基 里 积 累 了 10 mg/l 的 4HBA 和 各 种 酯 化 物, 总 量 约 30 mg/l 虽 然 4HBA 的 量 不 是 很 高, 但 是 野 生 菌 株 合 成 积 累 4HBA 的 能 力 是 首 次 发 现 如 果 适 当 发 挥 其 天 然 潜 力, 对 A4B-17 菌 株 的 4HBA 合 成 基 因 进 行 改 造, 有 希 望 合 成 更 多 的 4HBA, 以 满 足 工 业 生 产 的 需 求 4HBA 和 相 应 醇 类 酯 化 后 的 产 物 叫 4HBA 酯 类 (Parabens) 1920 年, 人 工 合 成 并 发 现 4HBA 酯 类 有 抑 菌 作 用 后, 由 于 4HBA 酯 类 具 有 价 格 便 宜 无 色 无 毒 较 为 广 泛 的 抑 菌 谱 且 抑 cjb@im.ac.cn
334 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.3 菌 作 用 不 受 ph 影 响 等 特 点, 现 在 作 为 防 腐 剂 广 泛 应 用 于 食 品 和 化 妆 品 的 保 存 方 面 [38-40] 以 前 认 为 4HBA 酯 类 是 人 工 化 合 物, 我 们 的 发 现 阐 明 微 泡 菌 Microbulbifer 早 已 经 把 它 们 当 作 抑 菌 剂, 遏 制 周 围 微 生 物 的 生 长 繁 殖 扩 大 自 己 的 生 存 空 间 通 过 A4B-17 菌 株 的 次 级 代 谢 产 物 的 研 究 也 会 使 我 们 了 解 海 洋 环 境 中 微 生 物 与 微 生 物 之 间 的 拮 抗 作 用 研 究 还 发 现,A4B-17 菌 株 的 次 级 代 谢 产 物 中 含 有 4HBA 丁 酯 4HBA 壬 酯 和 4HBA 庚 酯, 而 且 是 按 照 梯 度 4HBA 丁 酯 >4HBA 壬 酯 >4HBA 庚 酯 合 成 出 来 的 而 这 个 梯 度 具 有 生 理 意 义, 是 有 效 抑 制 微 生 物 生 长 的 合 理 梯 度 是 什 么 调 控 机 制 使 A4B-17 菌 株 按 照 这 个 梯 度 合 成 4HBA 酯 类, 这 个 梯 度 是 否 受 到 环 境 因 素 的 影 响? 这 些 问 题 将 在 今 后 的 研 究 中 阐 明 本 课 题 组 完 成 了 A4B-17 菌 株 的 基 因 组 测 序 和 注 释 工 作 A4B-17 菌 株 不 含 有 质 粒, 只 有 一 个 染 色 体, 全 长 为 5 040 512 bp, 共 预 测 出 4 766 个 基 因 A4B-17 菌 株 有 3 条 葡 萄 糖 降 解 途 径 ( 糖 酵 解 途 径 磷 酸 戊 糖 途 径 和 Entner-Doudoroff (ED) 途 径 ) 而 且 还 预 测 出 一 些 酶 催 化 连 接 这 3 条 途 径 的 反 应, 因 此 从 葡 萄 糖 至 烯 醇 式 丙 酮 酸 和 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 途 径 非 常 通 畅 5 展 望 利 用 植 物 合 成 4HBA 的 缺 点 是 4HBA 在 植 物 中 是 以 葡 糖 基 化 或 酯 化 产 物 的 形 式 存 在, 给 下 游 提 纯 工 程 带 来 困 难, 特 别 是 苯 丙 素 (Phenylpropanoids) 合 成 途 径 中 的 一 些 步 骤 尚 不 明 了 利 用 细 菌 作 为 合 成 4HBA 的 细 胞 工 厂 有 以 下 优 点 :1) 细 菌 的 生 长 繁 殖 速 度 快, 代 谢 周 期 短 ;2) 4HBA 的 合 成 可 以 部 分 利 用 细 菌 的 芳 香 族 氨 基 酸 的 合 成 途 径 ;3) 4HBA 对 细 菌 的 毒 性 较 小, 可 以 高 浓 度 积 累 生 产 ;4) 没 有 对 环 境 和 人 类 有 害 的 中 间 产 物 生 成 ;5) 在 中 国, 苯 甲 苯 和 葡 萄 糖 的 价 格 分 别 为 每 吨 6 200 9 800 和 2 900 元, 而 4HBA 的 价 格 为 25 000 元 /t [41] 虽 然 从 苯 和 甲 苯 出 发 理 论 上 可 以 获 得 100% 的 4HBA 收 率, 而 葡 萄 糖 转 化 为 4HBA 的 理 论 收 率 也 为 65.6% (W/W), 葡 萄 糖 的 价 格 相 对 较 低, 经 过 计 算 理 论 上 可 以 获 得 4 421 元 /t 的 4HBA 无 论 从 环 境 角 度 还 是 经 济 角 度 利 用 微 生 物 从 可 再 生 资 源 的 葡 萄 糖 合 成 4HBA, 理 论 上 要 优 于 其 他 方 法 目 前 虽 然 利 用 重 组 微 生 物 合 成 4HBA 有 一 定 的 研 究 进 展, 但 是 这 些 微 生 物 都 是 本 身 不 合 成 积 累 4HBA 的 菌 株, 通 过 复 杂 的 改 造 代 谢 途 径 和 反 馈 调 控 机 制 会 给 4HBA 的 高 效 生 产 带 来 局 限 性 本 课 题 组 拟 采 取 以 下 策 略 研 究 开 发 A4B-17 菌 株 1) 合 成 基 因 研 究 通 过 基 因 敲 除 表 达 谱 分 析 等 手 段 验 证 4HBA 合 成 途 径 中 的 关 键 基 因 功 能, 如 葡 萄 糖 转 运 和 磷 酸 化 基 因 赤 藓 糖 -4- 磷 酸 的 合 成 基 因 DAHP 合 成 酶 基 因 和 分 支 酸 裂 解 酶 基 因 2) 阐 明 关 键 部 位 的 调 控 机 制 4HBA 和 酯 类 都 属 于 次 级 代 谢 产 物, 它 们 的 合 成 必 将 受 到 各 种 因 素 的 影 响 我 们 假 设 3 种 因 素 ( 内 在 因 素 物 化 因 素 和 抑 制 对 象 ) 对 代 谢 途 径 上 的 3 个 作 用 位 点 (PEP 位 点 4- 磷 酸 赤 藓 糖 位 点 分 支 酸 位 点 ) 有 一 定 影 响 PEP 位 点 包 括 PEP 激 酶 和 DAHP 合 成 酶 ;4- 磷 酸 赤 藓 糖 位 点 包 括 转 酮 酶 和 DAHP 合 成 酶 ; 分 支 酸 位 点 包 括 分 支 酸 裂 解 酶 邻 氨 基 苯 甲 酸 合 成 酶 (Anthranilate synthase) 和 分 支 酸 变 位 酶 本 课 题 组 将 利 用 天 然 合 成 积 累 4HBA 的 A4B-17 菌 株 作 为 宿 主, 在 深 入 研 究 代 谢 途 径 和 调 控 机 制 的 基 础 上 开 发 合 成 4HBA 的 工 业 微 生 物 http://journals.im.ac.cn/cjbcn
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