中 国 病 理 生 理 杂 志, ( ): - [ 文 章 编 号 ] - ( ) - - 阿 托 伐 他 汀 对 脑 缺 血 再 灌 注 大 鼠 血 脑 屏 障 的 保 护 作 用 贺 涓 涓, 洪 华, 杨 世 亮 ( 中 山 大 学 附 属 第 三 医 院 康 复 医 学 科, 广 东 广 州 ; 中 山 大 学 附 属 第 一 医 院 神 经 内 科, 广 东 广 州 ) [ 摘 要 ] 目 的 : 研 究 在 脑 缺 血 再 灌 注 ( -, ) 损 伤 中 阿 托 伐 他 汀 对 血 脑 屏 障 的 保 护 作 用 及 相 关 机 制 方 法 : 大 鼠 只 随 机 分 为 组 : 假 手 术 组 组 和 阿 托 伐 他 汀 组 阿 托 伐 他 汀 组 大 鼠 术 后 予 以 阿 托 伐 他 汀 ( ) 灌 胃 治 疗, 每 天 次, 连 续 利 用 线 栓 法 制 作 脑 模 型, 缺 血 后 再 灌 注, 对 各 组 大 鼠 的 神 经 功 能 进 行 评 分, 并 检 测 梗 死 侧 大 脑 半 球 脑 组 织 含 水 量 伊 文 思 蓝 (, ) 渗 出 量 紧 密 连 接 相 关 蛋 白 和 炎 症 因 子 磷 脂 酰 肌 醇 - 激 酶 γ( - γ) 的 表 达 水 平 结 果 : 与 假 手 术 组 相 比, 组 大 鼠 脑 组 织 含 水 量 的 渗 出 量 及 神 经 功 能 评 分 均 增 加 ( <. ), 同 时 表 达 下 降 ( <. ), - γ 表 达 增 加 ( <. ); 而 阿 托 伐 他 汀 治 疗 组 大 鼠 脑 水 肿 程 度 减 轻 ( <. ), 渗 出 量 减 少 ( <. ), - 表 达 增 加 ( <. ), - γ 表 达 减 少 ( <. ), 神 经 功 能 评 分 下 降, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 ( >. ) 结 论 : 阿 托 伐 他 汀 可 以 减 轻 脑 损 伤, 可 能 与 抑 制 炎 症 反 应 增 加 紧 密 连 接 蛋 白 表 达 从 而 维 持 血 脑 屏 障 稳 定 性 有 关 [ 关 键 词 ] 脑 缺 血 再 灌 注 ; 阿 托 伐 他 汀 ; 血 脑 屏 障 [ 中 图 分 类 号 ] [ 文 献 标 志 码 ] : - - -,, - (, -,, ;, -,, - : - @ ) [ ] : ( ) - - ( ) :,, - ( ), -,, ( ), ( )- - - ( - γ) :, ( <. ), ( <. ) ( <. ), - - ( <. ) - - γ( <. ), ( <. ) ( <. ), ( <. ) - γ ( <. ), :, - - - [ ] - ; ; [ 收 稿 日 期 ] - - [ 修 回 日 期 ] - - [ 基 金 项 目 ] 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ); 广 东 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ) 通 讯 作 者 : - ; - : @
溶 栓 是 缺 血 性 脑 卒 中 急 性 期 治 疗 最 有 效 的 方 法, 但 堵 塞 的 血 管 再 通 后 会 引 发 再 灌 注 损 伤, 表 现 为 加 重 脑 水 肿 引 起 脑 出 血 损 伤 神 经 元 等 脑 缺 血 再 灌 注 ( -, ) 损 伤 机 制 复 杂, 最 主 要 是 由 于 血 脑 屏 障 (, ) 破 坏, 通 透 性 增 加, 血 管 内 的 大 分 子 物 质 及 有 害 成 分 渗 出 到 脑 组 织 内 微 血 管 内 皮 细 胞 及 细 胞 间 的 紧 密 连 接 (, ) 构 成 的 主 要 结 构, 尤 其 是 可 反 映 通 透 性 的 改 变 目 前 对 减 轻 脑 损 伤 的 药 物 研 究 较 多, 其 中 他 汀 类 药 物 对 缺 血 性 脑 卒 中 有 比 较 明 确 的 保 护 作 用, 作 用 机 制 涉 及 调 节 内 皮 型 一 氧 化 氮 合 酶 (, ) 表 达, 减 少 自 由 基 产 生, 减 轻 炎 症 反 应 等, 但 是 他 汀 类 药 物 对 脑 损 伤 中 保 护 作 用 的 研 究 尚 未 见 报 道 本 文 利 用 局 灶 性 脑 模 型 研 究 阿 托 伐 他 汀 对 的 保 护 作 用, 并 对 再 灌 注 损 伤 中 相 关 蛋 白 和 炎 症 介 质 磷 脂 酰 肌 醇 - 激 酶 γ ( - - γ, - γ) 的 变 化 进 行 研 究 实 验 分 组 与 给 药 材 料 和 方 法 由 中 山 大 学 北 校 区 实 验 动 物 中 心 提 供 的 体 重 约 ~ 的 健 康 雄 性 大 鼠 只, 随 机 分 为 组, 每 组 只, 分 别 为 假 手 术 (, ) 组 脑 缺 血 再 灌 注 ( ) 组 阿 托 伐 他 汀 (, ) 组 阿 托 伐 他 汀 组 给 药 方 法 : 阿 托 伐 他 汀 钙 片 ( 辉 瑞 制 药 ) 溶 于 生 理 盐 水, 配 成 浓 度 为 的 混 悬 液, 按 的 量 于 再 灌 注 后 开 始 灌 胃 给 药, 每 天 次, 连 续 组 建 立 模 型, 予 以 相 同 体 积 的 生 理 盐 水 主 要 试 剂 兔 抗 大 鼠 抗 体 ( ); 小 鼠 抗 大 鼠 - γ 抗 体 ( ); 标 记 的 山 羊 抗 兔 Ⅱ 抗 ( ); 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 兔 Ⅱ 抗 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 小 鼠 Ⅱ 抗 光 化 学 显 色 试 验 盒 ( ) 蛋 白 定 量 试 验 盒 ( ) 主 要 方 法 造 模 方 法 采 用 改 良 的 线 栓 法 制 备 大 鼠 脑 模 型, 缺 血 后 再 灌 注 大 鼠 用 % 水 合 氯 醛 腹 腔 麻 醉, 分 离 并 结 扎 左 侧 颈 外 动 脉 以 防 术 中 出 血, 分 离 左 侧 颈 总 动 脉 (, ) 和 颈 内 动 脉 (, ), 并 在 的 近 心 端 和 远 心 端 分 别 挂 线 以 备 用 用 微 动 脉 夹 暂 时 夹 闭, 结 扎 近 心 端 并 在 近 心 端 剪 开 一 小 口, 将 线 头 直 径 为 (. ±. ) 的 尼 龙 线 栓 ( 北 京 沙 东 生 物 技 术 有 限 公 司 ) 从 剪 口 处 顺 着 方 向 插 入, 松 开 动 脉 夹 前 先 将 远 心 端 的 挂 线 打 一 活 结 以 防 出 血, 继 续 往 前 插 入 线 栓, 确 认 线 栓 成 功 插 入 至 大 脑 中 动 脉 近 端 后 再 扎 紧 远 心 端 活 结, 缝 合 切 口 线 栓 头 端 距 颈 总 动 脉 分 叉 处 约 ~ 缺 血 后 将 线 栓 缓 慢 拨 出 约, 使 头 端 撤 回 至 颈 内 动 脉, 实 现 再 灌 注 假 手 术 组 仅 分 离 动 脉, 不 行 结 扎 缺 血 操 作 神 经 行 为 学 评 分 参 照 经 典 的 法 进 行 评 分 分 : 无 神 经 功 能 缺 损 ; 分 : 对 侧 前 肢 不 能 完 全 伸 展 ; 分 : 向 对 侧 转 圈 ; 分 : 向 对 侧 倾 倒 ; 分 : 不 能 活 动, 意 识 障 碍 ~ 分 者 纳 为 实 验 对 象 经 解 剖 发 现 蛛 网 膜 下 腔 出 血 者 不 纳 入 实 验 脑 组 织 含 水 量 测 定 在 大 鼠 脑 缺 血 再 灌 注 后 处 死, 取 出 梗 死 侧 大 脑 半 球, 先 称 湿 重, 再 置 于 烤 箱 内 烤 至 恒 重, 称 其 干 重, 根 据 下 列 公 式 计 算 脑 组 织 含 水 量 : 脑 组 织 含 水 量 =( 湿 重 干 重 ) 湿 重 % 伊 文 思 蓝 (, ) 渗 出 量 测 定 生 理 盐 水 配 制. %, 按 的 量 于 大 鼠 处 死 前 经 股 静 脉 给 药, 后 经 左 心 室 灌 注 生 理 盐 水 ( ), 然 后 断 头 取 脑, 取 出 梗 死 侧 大 脑 半 球 后 先 称 重, 而 后 放 入 甲 酰 胺 溶 液 (. ) 于 孵 育 在 分 光 光 度 计 上 测 定 处 已 知 不 同 浓 度 的 吸 光 值 ( ), 根 据 标 准 曲 线 计 算 各 组 大 鼠 脑 组 织 中 含 量 免 疫 荧 光 法 测 定 梗 死 灶 周 围 阳 性 血 管 计 数 脑 缺 血 再 灌 注 后 将 各 组 大 鼠 断 头 取 脑, 在 视 交 叉 前 后 处 冠 状 取 材, 包 埋, 冰 冻 切 片 机 连 续 冠 状 切 片, 厚 度 为 μ 加 入 兔 抗 大 鼠 抗 体 ( ), 过 夜, 第 天 用. 的 冲 洗 遍, 并 滴 加 标 记 的 山 羊 抗 兔 的 Ⅱ 抗, 室 温 下 孵 育, 冲 洗 遍 每 个 脑 取 张 切 片, 每 张 切 片 取 个 视 野, 荧 光 显 微 镜 下 放 大 倍 观 察 梗 死 灶 周 围 皮 层 中 - 阳 性 血 管 并 计 数, 求 其 平 均 值 和 - γ 蛋 白 表 达 的 定 量 分 析 脑 缺 血 再 灌 注 后 将 各 组 大 鼠 断 头 取 脑, 冰 上 分 离 梗 死 侧 大 脑 半 球 额 顶 区 梗 死 灶 皮 质 约, 加 入 组 织 裂 解 液 和 蛋 白 酶 抑 制 剂, 研 磨 匀 浆 后 离 心, 取 上 清 液, 测 总 蛋 白 浓 度, 并 保 存 于 用
试 剂 盒 测 定 总 蛋 白 含 量, 每 孔 加 样 品 总 蛋 白 量 μ, - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳, 并 将 蛋 白 转 至 膜 上, % 的 脱 脂 牛 奶 封 闭, 分 别 加 入 兔 抗 大 鼠 ( ) 和 小 鼠 抗 大 鼠 - γ ( ) 的 Ⅰ 抗, 孵 育 过 夜, 第 天 加 入 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 兔 Ⅱ 抗 和 抗 小 鼠 Ⅱ 抗, 室 温 孵 育, 光 化 学 显 色, 拍 片 以 β - 作 为 内 参 照, 胶 片 经 扫 描 仪 扫 描 后 获 得 图 像 测 量 分 析 并 进 行 统 计 学 处 理 统 计 学 处 理 采 用. 进 行 统 计 分 析, 所 有 资 料 均 用 均 数 ± 标 准 差 ( ± ) 表 示, 正 态 分 布 资 料 的 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 进 一 步 两 两 比 较 采 用 法 ; 非 正 态 分 布 资 料 的 组 间 比 较 采 用 秩 和 检 验 以 <. 为 差 异 有 统 计 学 意 义 结 果 脑 缺 血 再 灌 注 的 病 理 改 变 大 鼠 脑 缺 血 后 再 灌 注, 与 假 手 术 组 相 比 较, 组 的 神 经 功 能 评 分 脑 组 织 含 水 量 及 渗 出 量 明 显 增 加 ( <. ); 伴 有 梗 死 灶 周 围 阳 性 血 管 计 数 下 降 ( <. ) 梗 死 灶 皮 层 表 达 下 降 ( <. ) 及 - γ 表 达 增 加 ( <. ), 见 图 图 及 表 阿 托 伐 他 汀 治 疗 后 通 透 性 的 改 变 再 灌 注, 阿 托 伐 他 汀 治 疗 组 大 鼠 脑 组 织 含 水 量 及 渗 出 量 均 比 组 大 鼠 减 少 ( <. ), 梗 死 灶 周 围 阳 性 血 管 计 数 增 加 ( <. ), 而 组 神 经 功 能 评 分 相 比 无 统 计 学 差 异 ( >. ), 见 图 表 ( ) : ; : - - ; : = μ 图 各 组 大 鼠 脑 梗 死 灶 周 围 免 疫 荧 光 染 色 表 各 组 大 鼠 神 经 功 能 评 分 梗 死 侧 大 脑 半 球 脑 组 织 含 水 量 及 含 量 梗 死 灶 周 围 阳 性 血 管 计 数 的 比 较,, - ( ± ) (%) (μ ) - ( = ) ( = ) ( = ) ( = ) ± ± ± ± - ± ± ± ± ## <. ; ## <. - ± ± ± ## ± ## 各 组 大 鼠 梗 死 灶 皮 层 和 - γ 表 达 水 平 的 变 化 缺 血 再 灌 注, 组 大 鼠 蛋 白 的 表 达 量 下 降 为 假 手 术 组 的. %, - γ 的 表 达 量 增 加 为 假 手 术 组 的. 倍 ; 而 使 用 阿 托 伐 他 汀 治 疗 后, 蛋 白 的 表 达 量 较 组 增 加, - γ 的 表 达 量 较 组 下 降, 见 图 讨 由 多 种 相 关 蛋 白 组 成, 如 - 闭 锁 小 带 蛋 白 ( -, - ) 等, 论 大 量 研 究 表 明 脑 缺 血 时 相 关 蛋 白 表 达 下 降, 分 布 [ ] 改 变, 相 关 机 制 主 要 涉 及 蛋 白 磷 酸 化 钙 失 调 氧 化 损 伤 炎 症 反 应 等 是 很 重 要 的 一 类
- γ - : ; : - ; : ± = <. ; ## <. 图 检 测 各 组 大 鼠 梗 死 灶 皮 层 和 - γ 的 蛋 白 表 达 水 平 跨 膜 蛋 白, 在 脑 微 血 管 内 皮 上 高 度 表 达, 有 研 究 认 为 [ ] 的 变 化 可 反 映 的 完 整 性 赵 红 等 对 局 灶 性 脑 缺 血 ( ) 再 灌 注 大 鼠 蛋 白 表 达 变 化 的 研 究 发 现, 与 再 灌 注 相 比, 再 灌 注 和 蛋 白 表 达 显 著 降 低, 以 为 最 明 显 因 此 我 们 选 择 再 灌 注 作 为 观 察 时 点 我 们 发 现, 脑 可 导 致 上 表 达 下 降, 伴 随 有 炎 症 因 子 - γ 表 达 增 加 ; 而 使 用 阿 托 伐 他 汀 治 疗 后 表 达 增 加, - γ 表 达 下 降, 与 梗 死 侧 大 脑 半 球 的 脑 水 肿 程 度 减 轻 渗 出 减 少 一 致, 提 示 上 调 相 关 蛋 白 的 表 达 以 及 抑 制 炎 症 因 子 - γ 的 表 达 可 能 是 阿 托 伐 他 汀 保 护 减 轻 脑 水 肿 的 作 用 机 制 之 一 另 外 我 们 观 察 到 阿 托 伐 他 汀 不 仅 能 增 强 梗 死 灶 皮 层 蛋 白 的 表 达, 也 能 增 加 梗 死 灶 周 围 阳 性 血 管 计 数, 说 明 阿 托 伐 他 汀 对 的 保 护 作 用 不 仅 限 于 缺 血 核 心 区, 它 还 能 增 强 缺 血 半 暗 带 的 稳 定 性 羟 甲 基 戊 二 酰 辅 酶 还 原 酶 抑 制 剂 他 汀 类 药 物 具 有 调 节 内 皮 功 能 抗 炎 抗 氧 化 稳 定 斑 块 及 抑 制 血 小 板 等 多 效 作 用, 但 对 调 节 功 能 的 研 究 尚 少 在 原 代 培 养 的 大 鼠 脑 微 血 管 内 皮 细 胞, 研 究 者 发 现 匹 伐 他 汀 可 上 调 蛋 白 - 的 表 达, 增 强 内 皮 屏 障 的 完 整 性 ; 在 外 伤 性 颅 脑 损 伤 动 物 模 型, 研 究 者 发 现 辛 伐 他 汀 可 增 加 - 的 表 达 并 减 少 细 胞 间 黏 附 分 子 的 表 达, 减 少 白 细 胞 渗 出 和 脑 水 肿 [ ] 我 们 对 大 鼠 脑 模 型 的 研 究 发 现 阿 托 伐 他 汀 可 增 加 的 表 达, 并 降 低 - γ 的 表 达, 减 轻 脑 水 肿 程 度, 改 善 神 经 功 能 评 分, 是 对 他 汀 类 药 物 多 效 性 研 究 的 补 充 此 外, 目 前 对 他 汀 类 药 物 脑 保 护 作 用 的 研 究 多 在 术 前 或 开 始 予 以 他 汀 类 药 物 预 处 理, 我 们 的 研 究 选 择 在 大 鼠 脑 发 生 后 予 以 阿 托 伐 他 汀 灌 胃 治 疗, 每 天 次, 连 续, 更 接 近 临 床 治 疗 模 式, 并 且 与 现 有 临 床 研 究 结 论 一 致 : 他 汀 类 药 物 不 仅 对 缺 血 性 脑 卒 中 有 一 级 预 防 和 二 级 预 防 作 用, 对 急 性 脑 卒 中 也 有 显 著 的 神 经 保 [ - ] 护 作 用 γ 是 近 来 发 现 的 与 启 动 炎 症 反 应 改 变 通 透 性 密 切 相 关 的 一 个 因 子, 它 由 催 化 亚 基 和 调 节 亚 基 或 组 成, 正 常 情 况 下 脑 组 织 内 有 少 量 表 达, 在 脑 缺 血 后 表 达 量 明 显 增 [ ] 加 目 前 的 研 究 发 现 γ 在 介 导 炎 症 反 应 中 起 重 要 作 用, 与 动 脉 粥 样 硬 化 及 心 脑 血 管 事 件 密 切 [ ] 相 关 相 关 对 - γ 基 因 敲 除 小 鼠 的 研 究 发 现 γ 在 脑 缺 血 损 伤 中 发 挥 重 要 作 用, 与 野 生 型 小 鼠 相 比, - γ 基 因 敲 除 小 鼠 的 脑 梗 死 体 积 和 渗 出 明 显 减 轻, 紧 密 连 接 蛋 白 - 和 基 底 膜 蛋 白 的 表 达 增 多, 同 时 炎 症 因 子 基 质 金 属 蛋 白 酶 ( -, - ) 表 达 减 [ ] 少 这 提 示 γ 对 的 通 透 性 和 的 调 节 起 重 要 作 用, 可 能 成 为 卒 中 治 疗 的 新 靶 点 但 - 与 γ 表 达 的 变 化 是 否 存 在 因 果 关 系 有 待 进 一 步 研 究 综 上 所 述, 在 脑 损 伤 模 型 我 们 发 现 阿 托 伐 他 汀 干 预 后, 通 透 性 下 降 脑 水 肿 程 度 减 轻 - 蛋 白 表 达 增 加 而 - γ 表 达 减 少, 提 示 对 于 临 床 上 有 溶 栓 指 针 的 患 者, 服 用 阿 托 伐 他 汀 可 保 护 减 轻 脑 水 肿 另 外 我 们 发 现 脑 损 伤 导 致 大 鼠 神 经 功 能 评 分 增 加, 但 使 用 阿 托 伐 他 汀 治 疗 组 大 鼠 神 经 功 能 评 分 下 降 无 统 计 学 意 义, 可 能 与 本 研 究 样 本 量 较 小, 仅 选 择 评 分 入 实 验 作 为 观 察 对 象 有 关 ~ 分 者 纳
[ 参 考 文 献 ] [ ] 贾 增 强, 王 来, 刘 丽 冰, 等 对 脑 缺 血 再 灌 注 大 鼠 脑 水 肿 和 水 通 道 蛋 白 表 达 的 影 响 [ ] 中 国 病 理 生 理 杂 志,, ( ): - [ ], - [ ],, ( ): - [ ] 洪 华, 曾 进 胜, 王 莹, 等 阿 托 伐 他 汀 对 大 鼠 缺 血 再 灌 注 脑 组 织 中 氧 化 酶 源 性 超 氧 阴 离 子 的 抑 制 作 用 [ ] 中 国 病 理 生 理 杂 志,, ( ): - [ ],,, - -,, - - [ ],, ( ): - [ ], - - :, [ ],, ( ): - [ ] 孙 伟, 杨 鲲 鹏, 盛 利, 等 大 鼠 局 灶 性 脑 缺 血 再 灌 注 血 脑 屏 障 超 微 结 构 及 紧 密 连 接 蛋 白 变 化 的 研 究 [ ] 中 风 与 神 经 疾 病 杂 志,, ( ): - [ ] 赵 红, 张 倩 茹, 卢 晓 梅 高 压 氧 对 局 灶 性 脑 缺 血 再 灌 注 大 鼠 紧 密 连 接 蛋 白 及 血 脑 屏 障 通 透 性 的 影 响 [ ] 中 华 航 海 医 学 与 高 气 压 医 学 杂 志,, ( ): - [ ] 张 利 军, 白 宇 他 汀 类 药 对 脑 梗 死 的 临 床 疗 效 和 作 用 机 制 [ ] 中 国 临 床 神 经 科 学,, ( ): - [ ],,, [ ],, ( ): - [ ],,, : [ ],, ( ): - [ ] -,, - [ ],, ( ): - [ ] 杨 勇 填, 林 仪, 林 绍 鹏, 等 疏 血 通 联 合 阿 托 伐 他 汀 对 短 暂 性 脑 缺 血 发 作 患 者 血 脂 及 颈 动 脉 内 膜 厚 度 的 影 响 [ ] 中 国 病 理 生 理 杂 志,, ( ): - [ ],,, - - - - [ ] -,, ( ): - [ ],,, - - - - [ ],, ( ): - [ ],,, - - - - [ ],, ( ): -