608 中 国 药 事 2013 年 第 27 卷 第 6 期 HPLC 法 测 定 匹 伐 他 汀 钙 中 6 种 有 关 物 质 1,2,3 1,2,3 1,2,3 梁 敏, 宋 倩 男, 郑 利 刚, 刘 亚 英 1,2,3 ( 1 河 北 省 制 剂 工 程 技 术 研 究 中 心, 石 家 2 3 庄 050035; 石 药 集 团 中 奇 制 药 技 术 ( 石 家 庄 ) 有 限 公 司 ; 新 型 药 物 制 剂 与 辅 料 国 家 重 点 实 验 室 ) 摘 要 : 目 的 建 立 了 高 效 液 相 色 谱 梯 度 洗 脱 法 测 定 匹 伐 他 汀 钙 中 有 关 物 质 的 方 法. 方 法 采 用 C18 (4 6mm 250mm,5μm) 色 谱 柱, 以 醋 酸 盐 缓 冲 液 ( 取 醋 酸 钠 0 15g, 冰 醋 酸 0 5 ml, 加 水 稀 释 至 1000mL) 为 流 动 相 A, 乙 腈 为 流 动 相 B, 梯 度 洗 脱 条 件 :0~20min,A 为 56%;20~40min,A 为 56% 30%;40~60min,A 为 30%; 以 1 0mL min G1 的 流 速 进 行 梯 度 洗 脱 ; 检 测 波 长 为 245nm. 结 果 匹 伐 他 汀 钙 与 各 有 关 物 质 的 分 离 度 良 好, 匹 伐 他 汀 钙 及 杂 质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ Ⅵ 的 检 测 限 均 为 0 04μg ml G1. 结 论 所 建 立 的 方 法 简 便 灵 敏 准 确, 可 用 于 匹 伐 他 汀 钙 有 关 物 质 的 测 定. 关 键 词 : 匹 伐 他 汀 钙 ; 有 关 物 质 测 定 ; 高 效 液 相 色 谱 法 中 图 分 类 号 :R927 11 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1002G7777 (2013)06G0608G05 DeterminationofSixRelatedSubstancesinPitavastatinCalciumbyHPLC Liang Min 1,2,3,Song Qiannan 1,2,3,Zheng Ligang 1,2,3 and Liu Yaying 1,2,3 ( 1 Hebei Pharmaceutical Technologyand Engineering Research Center,Shijiazhuang050035; 2 CSPC ZhongqiPharmaceutical Technology (Shijiazhuang)Co.,Ltd; 3 State Key Lab of Novel Pharmaceutical Preparationsand Excipients) ABSTRACT: ObjectiveToestablishan HPLC gradientelution methodforthedeterminationofthe relatedsubstancesinpitavastatincalcium.methodsthec18column(4 6mm 250mm,5μm)wasused. Themobilephase A consisted ofacetatebufersolutionandthe mobilephase B ofacetonitrile.the gradientelution wasperformedasfolows:0g20 min,a:56%;20g40 min,a:56% 30%;40G60 min,a:30%.thegradientelutionwasperformedwithaflowrateof1 0 ml min G1 andthedetective wavelengthwassetat245nm.resultsgoodseparationofpitavastatincalcium anditsrelatedsubstances wasobtained.thedetectionlimitsofpitavastatincalcium andimpurity Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅴ and Ⅵ wereal 0 04μg ml G1.Conclusion Theestablished methodissimple,sensitiveandpracticable,whichcanbe usedtodeterminatetherelatedsubstancesofpitavastatincalcium. KEY WORDS: pitavastatincalcium;determinationofrelatedsubstance;hplc 匹 伐 他 汀 钙 (Pitavastatin Calcium) 是 选 择 性 竞 争 性 3G 羟 基 G3G 甲 基 戊 二 酰 辅 酶 A (HMGG CoA) 还 原 酶 抑 制 剂 [1], 由 日 产 化 学 工 业 株 式 会 社 和 日 本 兴 和 株 式 会 社 共 同 研 制, 于 2003 年 在 日 本 上 市. 目 前 国 内 有 双 鹤 药 业 和 江 苏 万 邦 公 司 取 得 了 该 产 品 的 生 产 批 件. [2] 文 献 以 0 01 mol L G1 磷 酸 二 氢 钾 溶 液 ( 醋 酸 调 ph 至 3 2)G 乙 腈 (63 37) 为 流 动 相, 梯 度 洗 脱 程 序, 用 内 标 法, 以 荧 光 检 测 器 检 测 匹 伐 他 汀 [3] 钙 及 其 代 谢 物. 文 献 用 RPGHPLC 法, 乙 腈 G 0 1% 三 乙 胺 溶 液 ( 用 乙 酸 调 ph 至 3 2) (44 56) 为 流 动 相, 采 用 DAD 检 测 器, 等 度 洗 脱, 测 定 匹 伐 他 汀 钙 的 有 关 物 质 ; 但 其 文 中 测 定 的 有 关 物 质 只 是 各 步 反 应 的 中 间 体, 对 于 匹 伐 他 汀 钙 因 手 性 中 心 引 入 的 非 对 映 异 构 体 顺 式 异 构 体 反 应 副 产 物 和 降 解 产 物 并 没 有 体 现. 本 文 参 考 匹 伐 他 汀 钙 和 辛 伐 作 者 简 介 : 梁 敏, 高 级 工 程 师, 从 事 新 药 研 发 工 作 ;Tel:(0311)67808868;EGmail:sjzlmin@126 com
中 国 药 事 2013 年 第 27 卷 第 6 期 609 他 汀 含 量 有 关 物 质 对 映 异 构 体 等 的 测 定 方 [4G8] 法, 采 用 高 效 液 相 色 谱 梯 度 洗 脱 法 同 时 测 定 匹 伐 他 汀 钙 中 的 6 种 有 关 物 质, 其 中 包 括 非 对 映 异 构 体 顺 式 异 构 体 反 应 副 产 物 降 解 产 物 和 中 间 体, 方 法 简 便, 专 属 性 强, 灵 敏 度 高, 可 用 于 匹 伐 他 汀 钙 有 关 物 质 的 测 定. 1 仪 器 与 试 药 美 国 Aglient 公 司 1200 型 液 相 色 谱 仪, 二 极 管 阵 列 检 测 器,ChemStation 色 谱 工 作 站. 匹 伐 他 汀 钙 ( 批 号 :20080801,20080802, 20080803), 杂 质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ Ⅵ( 批 号 分 别 为 ZZDZG 080701 ZZDZG080602 ZZDZG080601 ZZDZG080601 ZZDZG080601; 纯 度 分 别 为 99 5% 95 4% 98 5 % 98 4 % 98 5%; 杂 质 Ⅰ 为 反 应 副 产 物, 杂 质 Ⅱ 为 匹 伐 他 汀 钙 的 非 对 映 异 构 体, 杂 质 Ⅲ 为 匹 伐 他 汀 钙 的 顺 式 异 构 体, 杂 质 Ⅴ 为 降 解 产 物, 杂 质 Ⅵ 为 中 间 体 ), [9G11] 均 为 本 公 司 自 制 ; 杂 质 Ⅳ 为 降 解 产 物 ( 通 过 强 制 降 解 方 式 获 得 ); 乙 腈 为 色 谱 纯, 醋 酸 及 醋 酸 钠 均 为 分 析 纯, 水 为 实 验 室 自 制 超 纯 水. 杂 质 名 称 及 其 结 构 式 见 图 1. 图 1 杂 质 名 称 和 结 构 式 2 方 法 与 结 果 2 1 色 谱 条 件 色 谱 柱 WatersSymmetryC18 柱 (4 6 mm 250mm,5 μm); 以 醋 酸 盐 缓 冲 液 ( 取 醋 酸 钠 0 15g, 冰 醋 酸 0 5 ml, 加 水 稀 释 至 1000 ml) 为 流 动 相 A, 乙 腈 为 流 动 相 B, 梯 度 洗 脱 条 件 : 0~20min,A 为 56%;20~40min,A 为 56% 30%;40~60min,A 为 30%; 以 1 0mL min G1 的 流 速 进 行 梯 度 洗 脱 ; 检 测 波 长 为 245nm; 进 样 量 为 20μL; 柱 温 为 30. 2 2 溶 液 配 制 系 统 适 用 性 溶 液 1 的 配 制 : 精 密 称 取 匹 伐 他 汀 钙 及 杂 质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ Ⅵ 对 照 品 适 量, 加 50% 的 乙 腈 水 溶 液 溶 解 并 稀 释 成 每 1 ml 中 均 约 含 0 02mg 的 混 合 溶 液, 即 得. 系 统 适 用 性 溶 液 2 的 配 制 : 取 于 60 条 件 下 加 热 5d 的 匹 伐 他 汀 钙 对 照 品 约 10 mg, 置 25 ml 量 瓶 中, 加 50% 乙 腈 水 溶 液 溶 解 并 稀 释 成 约 含 杂 质 Ⅳ1% 的 混 合 溶 液, 即 得. 供 试 品 溶 液 的 配 制 : 称 取 匹 伐 他 汀 钙 约
中国药事 ０１３ 年第 ７ 卷第 ６ 期 ６１０ ０ mg,置５０ ml 量瓶中,加 ５０ 乙腈水溶液溶解 并定容,制 得 匹 伐 他 汀 钙 浓 度 为 ０ ４ mg mlｇ１ 的 供试品溶液. 对照溶液的配制:精密量取供试品溶液 １mL, 置 １００mL 量瓶中,加 ５０ 乙腈水溶液溶解并稀释 至刻度,摇匀,即得. ３ 专属性试验 ３ １ 与已知杂质的分离情况 精密量取系统适用性溶液 １ 和 各 ０μL 注入 液相色谱仪,色谱 图 见 图 和 图 ３.由 图 和 ３ 可 １ 杂质 Ⅰ ; 匹伐他汀钙;３ 杂质 Ⅱ ; 知,匹伐他汀钙与各已知杂质的分离度均大于 １ ５. ４ 杂质 Ⅲ ;５ 杂质 Ⅴ ;６ 杂质 Ⅵ. 图 系统适用性溶液 １ 色谱图 ３ 与未知杂质的分离情况 取匹伐他汀钙约 ０ mg,精密称定,置 ５０ ml 量瓶中,共 ５ 份.其中 ３ 份分别加入 １ mo l LＧ１ 盐 酸 ml １mo l LＧ１ 氢氧化钠溶液 ml 和双氧水 １ ml,放置 ８h 后, 调 节 ph 值 至 ７. 另 外 份, 分别在 ８０ 水 浴 上 加 热 ６h 和 ４５００Lx 条 件 下 暴 露 d.各破坏性试验溶液用 ５０ 乙腈水溶液稀释 定容后进样测定.色谱图 见 图 ４.由 图 ４ 可 见,各 杂质峰与主峰分离度良好. 匹伐他汀钙;７ 杂质 Ⅳ. 图 ３ 系统适用性溶液 色谱图 A 酸破坏;B 碱破坏;C 高温破坏;D 光照破坏;E 氧化破坏. 图 ４ 强制降解试验液相色谱图
中 国 药 事 2013 年 第 27 卷 第 6 期 2 4 线 性 关 系 考 察 精 密 称 取 匹 伐 他 汀 钙 及 杂 质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ Ⅵ 适 量, 加 50% 乙 腈 水 溶 液 溶 解 并 稀 释 制 成 含 匹 伐 他 汀 钙 及 杂 质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ Ⅵ 分 别 为 182 8 174 1 162 2 170 3 167 6 169 7 μg ml G1 611 的 溶 液, 将 溶 液 逐 级 稀 释, 得 到 不 同 浓 度 的 溶 液, 精 密 量 取 20μL 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图, 以 浓 度 ( μ g ml G1 ) 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线, 计 算 回 归 方 程, 结 果 见 表 1. 表 1 线 性 关 系 测 定 结 果 名 称 线 性 范 围 ( μg ml G1 ) 线 性 方 程 相 关 系 数 (r) 匹 伐 他 汀 钙 0 1828~182 8 Y=1 0729 10 2 X-3 483 10 G1 1 杂 质 Ⅰ 0 1741~174 1 Y=1 0272 10 2 X-1 2495 0 9999 杂 质 Ⅱ 0 1622~162 2 Y=9 963 10X+1 7382 1 杂 质 Ⅲ 0 1703~170 3 Y=1 0057 10 2 X+2 555 10 G1 1 杂 质 Ⅴ 0 1676~167 6 Y=1 1202 10 2 X-9 088 10 G1 0 9998 杂 质 Ⅵ 0 1697~169 7 Y=9 824 10X-1 1387 1 2 5 检 测 限 取 线 性 关 系 考 察 项 下 溶 液, 逐 级 稀 释 成 系 列 溶 液, 分 别 进 样 20μL, 按 峰 高 为 基 线 噪 声 的 3 倍 (S/N =3) 计 算, 各 成 分 的 检 测 限 均 为 0 04μg ml G1. 2 6 稳 定 性 试 验 将 对 照 溶 液 与 供 试 品 溶 液 室 温 条 件 下 密 闭 放 置, 在 6h 内 每 隔 1h 进 样 测 定, 采 用 不 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 法, 计 算 单 个 杂 质 含 量 与 杂 质 总 量, 结 果 显 示, 杂 质 Ⅴ 呈 上 升 趋 势, 杂 质 总 量 的 RSD (n=6) 为 30%, 故 供 试 品 溶 液 需 临 用 新 配. 2 7 耐 用 性 试 验 取 2 2 中 系 统 适 用 性 溶 液 1, 以 匹 伐 他 汀 钙 与 杂 质 Ⅱ 的 分 离 度 及 主 峰 保 留 时 间 和 理 论 板 数 为 指 标, 考 察 了 不 同 厂 家 色 谱 柱 不 同 流 动 相 比 例 不 同 柱 温 与 不 同 流 速 条 件 对 检 测 结 果 的 影 响, 结 果 见 表 2. 表 2 耐 用 性 考 察 结 果 考 察 项 目 主 峰 保 留 时 间 (min) 匹 伐 他 汀 钙 与 杂 质 Ⅱ 分 离 度 主 峰 理 论 板 数 总 有 关 物 质 (%) 柱 温 (25 ) 23 3 2 82 12341 0 17 柱 温 (30 ) 23 2 2 79 12936 0 18 柱 温 (35 ) 23 3 2 71 13651 0 18 流 速 (0 9mL min G1 ) 25 6 2 73 24735 0 18 流 速 (1 0mL min G1 ) 23 2 2 79 12936 0 18 流 速 (1 1mL min G1 ) 21 3 2 82 12669 0 18 梯 度 洗 脱 时 流 动 相 初 始 比 例 : 乙 腈 G 缓 冲 盐 (30 70) 34 7 2 21 277367 0 16 (39 61) 24 2 2 66 15609 0 18 (40 60) 22 9 2 78 20964 0 18 (41 59) 20 5 2 60 12505 0 18 (50 50) 9 4 1 63 10844 0 17 AgilentC18( 新 ) 23 2 2 41 14120 0 18 WatersC18 23 2 2 79 12936 0 18 Kromasil 21 5 1 96 10533 0 18 AgilentC18( 旧 ) 18 3 1 12 3306 0 15 2 8 样 品 测 定 结 果 照 以 上 方 法 测 定 本 公 司 3 批 样 品, 其 液 相 色 谱 图 见 图 5, 结 果 见 表 3. 3 讨 论 3 1 检 测 波 长 的 选 择 分 别 称 取 匹 伐 他 汀 钙, 杂 质 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ
612 中 国 药 事 2013 年 第 27 卷 第 6 期 总 量 的 改 变 10% 的 范 围 内 变 化, 分 离 度 均 能 满 足 试 验 要 求 ; 不 同 厂 家 色 谱 柱, 只 要 主 峰 的 理 论 板 数 达 10000 以 上, 匹 伐 他 汀 钙 与 杂 质 Ⅱ 的 分 离 度 均 符 合 规 定, 说 明 本 方 法 的 耐 用 性 良 好. 原 料 药 的 杂 质 可 分 为 有 机 杂 质 无 机 杂 质 和 残 留 溶 剂. 有 机 杂 质 主 要 与 工 艺 和 药 物 本 身 有 关, 因 此 应 重 点 关 注 产 品 在 合 成 精 制 和 贮 存 过 程 中 最 可 能 产 生 的 和 潜 在 的 杂 质. 本 方 法 重 点 对 匹 伐 他 汀 钙 中 存 在 的 及 贮 存 过 程 中 的 降 解 产 物 进 行 了 测 定, 主 峰 及 各 杂 质 各 杂 质 间 分 离 度 均 大 于 1 5, 专 属 性 和 耐 用 性 良 好, 可 以 很 好 地 控 制 产 品 的 质 量. 参 考 文 献 : [1] KojimaJ,Fujino H,Abe H,etal.IdentificationofmeG a. 批 号 20080801 样 品 ;b. 批 号 20080802 样 品 ;c. 批 号 20080803 样 品 ; 1. 杂 质 Ⅰ;2. 匹 伐 他 汀 钙 ;5. 杂 质 Ⅴ;7. 杂 质 Ⅳ. 图 5 液 相 色 谱 图 表 3 3 批 样 品 的 有 关 物 质 测 定 结 果 批 号 20080801 20080802 20080803 杂 质 Ⅰ(%) 0 12 0 12 0 12 杂 质 Ⅱ(%) 未 检 出 未 检 出 未 检 出 杂 质 Ⅲ(%) 未 检 出 未 检 出 未 检 出 杂 质 Ⅳ(%) 0 03 0 02 0 03 杂 质 Ⅴ(%) 0 03 0 03 0 03 杂 质 Ⅵ(%) 未 检 出 未 检 出 未 检 出 其 它 杂 质 未 检 出 未 检 出 未 检 出 总 杂 质 (%) 0 18 0 17 0 18 Ⅵ 适 量, 加 50% 乙 腈 水 溶 液 溶 解 并 稀 释 成 每 1 ml 中 均 约 含 4μg 的 溶 液 ; 取 以 上 各 溶 液 在 200~900nm 下 进 行 全 波 长 紫 外 扫 描, 同 时 提 取 系 统 适 用 性 溶 液 的 液 相 色 谱 图 中 的 光 谱 图. 结 果 表 明, 匹 伐 他 汀 钙 与 各 杂 质 及 中 间 体 均 在 245±2nm [4G7,12] 波 长 处 有 较 大 吸 收, 参 考 相 关 文 献, 选 择 245nm 作 为 本 品 有 关 物 质 的 检 测 波 长. 3 2 测 定 方 法 的 选 择 由 线 性 关 系 考 察 结 果 可 知, 各 杂 质 相 对 于 主 成 分 的 响 应 因 子 均 在 0 9~1 1 范 围 内, 所 以 采 用 不 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 法 计 算 匹 伐 他 汀 钙 中 有 关 物 质 的 量. 3 3 方 法 耐 用 性 考 察 由 耐 用 性 考 察 结 果 可 知 : 柱 温 和 流 速 对 二 者 的 分 离 度 影 响 不 大, 故 将 流 速 定 为 1 0 ml min G1, 检 测 温 度 室 温 即 可 ; 在 流 动 相 比 例 较 低 组 分 相 对 于 tabolitesofnkg104,an HMGGCoA reductaseinhibitor,in rat,rabbitanddogbile [J].BiolPharm Bul,1999,22 (2):142G150. [2] OjhaA,GutikarS,VayedaC,etal.DeterminationofpiG tavastatinfromhumanplasmausinghighperformanceliquid chromatography with fluorescence detection [J].ChinJ Chromatogr,2007,25 (5):715G718. [3] 唐 开 勇, 周 庆 武, 郭 晓 静. 匹 伐 他 汀 钙 有 关 物 质 的 HPLC 法 测 定 [J]. 中 国 医 药 工 业 杂 志,2008,39 (11):846G848. [4] 金 承 怀, 谭 鸿 毅, 裴 奇, 等. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 人 血 浆 中 匹 伐 他 汀 浓 度 [J]. 药 物 分 析 杂 志,2009,29 (8):1270G 1272. [5] 曹 建 军, 郝 胜 先, 李 青 山. 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 和 测 定 匹 伐 他 汀 钙 对 映 体 及 其 含 量 [J]. 药 物 分 析 杂 志,2008,28 (8):1333G1335. [6] 郭 晓 静, 周 庆 武, 唐 开 勇.RPGHPLC 法 测 定 匹 伐 他 汀 钙 的 含 量 [J]. 药 物 分 析 杂 志,2008,28 (10):1741G1743. [7] 许 筱, 申 屠 建 中, 刘 健, 等. 单 剂 量 口 服 匹 伐 他 汀 钙 片 在 中 国 健 康 志 愿 者 的 药 代 动 力 学 和 安 全 性 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 杂 志,2010,26 (3):195G200. [8] 郑 金 琪, 郑 国 钢, 李 会 林, 等. 梯 度 洗 脱 HPLC 测 定 辛 伐 他 汀 片 的 含 量 和 有 关 物 质 [J]. 中 国 药 学 杂 志,2010,45 (9):702G705. [9] 张 志 敏, 方 正, 李 长 春. 匹 伐 他 汀 钙 的 合 成 方 法 研 究 进 展 [J]. 合 成 化 学,2007,15 (5):536G542. [10] 蔡 正 艳, 周 伟 成. 匹 伐 他 汀 钙 的 合 成 [J]. 中 国 医 药 工 业 杂 志,2007,38 (3):177G180. [11] 单 继 雷, 汤 旗, 李 志 裕, 等. 匹 伐 他 汀 钙 中 间 体 的 合 成 工 艺 改 进 [J]. 精 细 化 工 中 间 体,2008,38 (5):27G29. [12] N.H.VADIA,VANDANA PATEL,H.N.BHALARA. SpectrophotometricDeterminationofCefetametPivoxilHydroG chlorideandpitavastatincalciumintabletdosage[j].ing dianj.pharm.sci.,2008,70 (5):659G651. ( 本 文 编 辑 王 雅 雯 )