吉 林 农 业 大 学 学 报 2011,09 Journal of Jilin Agricultural University http://xuebao.jlau.edu.cn E-mail:jlndxb@vip.sina.com 不 同 地 理 来 源 球 孢 白 僵 菌 的 生 物 学 特 性 1 刘 兴 磊, 2, 王 金 刚 1, 张 正 坤 2, 徐 文 静 2, 李 启 云 1. 东 北 农 业 大 学 园 艺 学 院, 哈 尔 滨 150030;2. 吉 林 省 农 业 科 学 研 究 院 植 物 保 护 研 究 所, 公 主 岭 136100 2 摘 要 : 采 集 并 分 离 来 源 于 吉 林 省 10 个 地 区 的 15 株 野 生 球 孢 白 僵 菌, 比 较 了 各 孢 子 萌 发 率 菌 落 直 径 产 孢 量 胞 外 蛋 白 酶 产 生 水 平 等 指 标 的 差 异 试 验 结 果 表 明, 孢 子 萌 发 率 高 的 类 型 为 孢 子 型, 菌 落 生 长 迅 速 的 类 型 为 菌 丝 型, 产 孢 量 高 的 类 型 为 混 合 型 而 胞 外 蛋 白 酶 产 生 水 平 与 菌 落 形 态 特 征 不 具 相 关 性 筛 选 出 菌 株 D4-2-1 CHL20 可 作 为 生 物 防 治 关 键 词 : 球 孢 白 僵 菌 ; 生 物 学 特 性 ; 菌 落 形 态 ; 胞 外 蛋 白 酶 产 生 水 平 ; 相 关 性 中 图 分 类 号 :S476.12 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :2011-5684(2011) DOI: 网 络 出 版 地 址 : Biological Characteristics and Morphological Characteristics of Different s of Beauveria bassiana LIU Xing-lei 1,2, WANG Jin-gang 1,Z HANG Zheng-kun 2, XU Wen-jing 2, LI Qi-yun 2 1. College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling 136100, China Abstract: Fifteen wild strains of Beauveria bassiana were collected and isolated from 10 regions of Jilin Province, compared their spore germination rate, colony diameter and sporulation. The results indicated that high spore germination rate strains were the conidia type, fast growing strains of colony type were the hyphae type, and strains characters between the conidia type and he hyphae type were the mixed type, respectively. While protease activity test showed that there was no correlation between the extracellular protease productio1n level and colony morphology. In conclusion, the strains of D4-2-1 and CHL20 were potential for biological control. Key words:beauveria bassiana ; biological characteristics ; colony morphology ;extracellular protease productive level ; correlation 球 孢 白 僵 菌 [Beauveria bassiana(ba1s.)vuill] 是 广 泛 用 于 生 物 防 治 的 虫 生 真 菌 之 一 尽 管 人 们 对 其 生 物 学 特 性 进 行 了 很 多 研 究, 但 许 多 研 究 结 果 表 明, 不 同 地 理 来 源 的 不 仅 具 有 不 同 的 寄 主 专 化 性, 其 生 物 学 特 性 也 存 在 一 定 差 异 [1] 因 此 在 具 体 实 践 工 作 中, 利 用 这 些 目 的 的 差 异 为 生 产 和 应 用 服 务, 筛 选 出 性 状 优 良 的 具 有 重 要 意 义 1 材 料 与 方 法 1.1 供 试 材 料 1.1.1 供 试 在 吉 林 省 未 施 用 白 僵 菌 进 行 玉 米 螟 (Ostrinia nubilalis) 生 物 防 治 的 不 同 地 区 采 集 玉 米 螟 僵 虫, 并 分 离 了 15 株 球 孢 白 僵 菌 ( 表 1), 保 存 于 吉 林 省 农 业 科 学 研 究 院 生 物 农 药 实 验 室 基 金 项 目 : 吉 林 省 科 技 支 撑 计 划 重 点 资 助 项 目 (20080249) 作 者 简 介 : 刘 兴 磊, 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 生 物 农 药 收 稿 日 期 :2011-02-19 网 络 出 版 时 间 : 通 讯 作 者
吉 林 农 业 大 学 学 报 2011 年 9 月 表 1 供 试 及 来 源 地 区 Table1. Original resource of the tested strains 编 号 No. 来 源 地 区 Region resource 编 号 No. 来 源 地 区 Region resource 1 S14-X-1 双 辽 9 JT1 九 台 2 S9-X-1 双 辽 10 TH9 通 化 3 L2-8 梨 树 11 YSH7 榆 树 4 T3-2-1 * 12 D1-5 德 惠 5 CHL11 长 岭 13 D6-2-1 德 惠 6 CHL20 长 岭 14 L1-1-1 梨 树 7 D4-2-1 德 惠 15 JH7 蛟 河 8 DA3 大 安 注 : * 为 吉 林 省 农 科 院 植 保 所 谭 云 峰 研 究 员 赠 予 Note:"*"was donated by Prof. Tan of Plant Protection Institute of Jlin Acadamy of Agriculture Sciences 1.1.2 培 养 基 萨 氏 培 养 基 (SDAY):4% 葡 萄 糖 1% 蛋 白 胨 1% 酵 母 粉 及 1.5%~2.0% 琼 脂 去 离 子 水 1000 ml, 自 然 ph 值 液 体 培 养 基 (SDY) 为 不 添 加 琼 脂 的 萨 氏 培 养 基 1.2 方 法 1.2.1 球 孢 白 僵 菌 不 同 的 培 养 将 沙 土 管 原 始 保 存 划 线 接 种 到 SDAY 培 养 基 上 (90 mm 培 养 皿, 每 皿 20 ml 培 养 基 ), 整 个 过 程 在 超 净 工 作 台 中 无 菌 操 作 接 种 后 放 入 生 化 培 养 箱 26 培 养, 每 个 菌 株 5 次 重 复, 培 养 30 d 后 观 察 其 菌 落 形 态 特 征 1.2.2 孢 子 萌 发 率 测 定 取 在 SDAY 培 养 基 上 培 养 10 d 后 的 球 孢 白 僵 菌, 分 别 用 无 菌 水 (0.01% 吐 温 -80) 收 集 分 生 孢 子 制 备 成 1 10 7 / ml 孢 子 悬 浮 液, 接 种 到 10 ml SDY 培 养 基 中,26 摇 床 恒 温 振 荡 培 养 后, 于 12,14,16,18,20 h 后 镜 检 ( 每 视 野 约 100 个 分 生 孢 子 ), 测 定 孢 子 萌 发 率, 每 个 重 复 3 次 1.2.3 菌 落 直 径 生 长 比 较 采 用 稀 释 法 进 行 单 孢 分 离 测 定 用 无 菌 水 配 制 孢 子 悬 浮 液, 稀 释 到 一 滴 孢 子 悬 浮 液 约 有 20~30 个 孢 子 时, 用 无 菌 枪 头 吸 取 一 滴 (10 μl) 滴 入 到 灭 菌 的 培 养 基 平 板 中 每 个 3 次 重 复, 待 菌 落 长 到 第 10 d 时 采 用 十 字 交 叉 法 测 量 并 记 录 菌 落 直 径 1.2.4 产 孢 量 测 定 待 菌 落 长 到 第 10 d 时, 测 量 1 g 孢 子 粉 的 产 孢 量 把 0.1 g 孢 子 粉 放 入 100 ml 无 菌 水 (0.01% 吐 温 -80) 中, 充 分 振 荡 分 散 后 配 制 成 孢 子 悬 浮 液, 滴 在 血 球 计 数 板 上, 镜 检 孢 子 数, 计 算 测 定 产 孢 量 每 个 计 数 3 次 1.2.5 胞 外 蛋 白 酶 测 定 参 照 Bidochka 等 人 的 明 胶 - 琼 脂 平 板 分 析 法 [2] 明 胶 - 琼 脂 平 板 含 10g/L 的 明 胶 和 15 g/l 的 琼 脂 将 待 测 1 10 8 / ml 浓 度 的 孢 子 悬 浮 液 10 μl(0.02% 吐 温 -80) 点 接 在 平 板 上, 26±1 培 养 5 d 后 用 15% 的 HgCl 2 溶 于 2 mol/l HCl 中 溶 液 处 理 平 板, 菌 落 周 围 即 显 示 出 清 晰 透 明 的 环 产 酶 量 的 大 小 以 透 明 环 直 径 与 该 环 的 菌 落 直 径 的 比 率 表 示 2 结 果 与 分 析 2.1 培 养 形 态 特 征 在 萨 氏 培 养 基 上, 不 同 外 观 形 态 差 异 较 大, 根 据 菌 落 形 态 和 直 径 大 致 可 以 分 为 3 种 类 型 ( 图 1, 表 2) 表 1 中, 1~10 号 分 别 为 S9-X-1 T3-2-1 CHL20 CHL11 JT1 S14-X-1 D4-2-1 TH9 DA3 L2-8, 菌 落 呈 白 色 略 带 灰 黄 色 灰 白 色 粉 末 状, 均 匀 分 布 于 培 养 基, 菌 丝 稀 短, 隐 约 可 见 一 层 层 同 心 轮 环, 产 孢 量 大, 按 林 华 峰 等 分 类 应 为 孢 子 型 [3] ; 11 号 菌 株 为 JH7, 菌 丝 长 势 旺 盛, 呈 气 生 状 向 空 间 扩 展 蔓 延, 菌 落 厚 实, 呈 绒 絮 状 纯 白 色, 菌 丝 生 长 过 程 中 伴 有 枯 黄 色 代 谢 水 珠, 产 孢 量 极 小, 为 菌 丝 型 [3] ; 12~15 号 为 D6-2-1 YSH7 D1-5 L1-1-1, 菌 丝 与 孢 子 粉 自 中 心 向 外 一 层 层 相 间 排 列, 形 成 凹 凸 不 平 的 菌 落, 菌 落 呈 粉 红 色 或 白 色, 夹 有 少 量 淡 黄 色 孢 子 粉, 有 的 出 现 几 圈 菌 丝 带, 产 孢 量 较 大, 为 混 合 型 [3] 图 1 培 养 30 d 的 菌 落 形 态 特 征 Fig.1. Colony morphology characters for 30 days Journal of Jilin Agricultural University 2011,September
刘 兴 磊 等 : 球 孢 白 僵 菌 不 同 生 物 学 特 性 与 其 菌 落 形 态 特 征 的 相 关 性 分 析 表 2 不 同 菌 落 直 径 Table. 2. Colony diameter of different strains 菌 种 名 称 JH7 S9-X-1 DA3 JT1 D4-2-1 菌 落 直 径 /mm Diameter 46.7±3.6 Aa 45.2±3.8 ABab 45.0±3.5 ABab 43.2±7.1 ABCabc 40.7±2.3 ABCDbcd L2-8 39.4±5.6 BCDcde CHL20 39.3±2.6 BCDcde D1-5 37.5±3.9 CDEde S14-X-1 T3-2-1 TH9 CHL11 D6-2-1 L1-1-1 YSH7 37.3±1.7 CDEde 37.3±6.0 CDEde 37.2±5.2 CDEde 37.1±1.6 CDEde 35.2±5.3 DEef 31.3±4.2 Ef 31.3±2.5 Ef 注 : 用 DPSV7.05 版 软 件 统 计 分 析, 表 中 大 小 写 字 母 表 示 根 据 LSD 多 重 比 较 极 显 著 水 平 (P<0.01) 和 显 著 水 平 (P<0.05) 下 同 Note: The result was analyzed by DPSV7.05 software system, the level of significance was at 0.01 and 0.05 respectively. The same below 2.2 不 同 孢 子 萌 发 率 比 较 供 试 各 球 孢 白 僵 菌 孢 子 萌 发 率 差 异 显 著 ( 表 3), 其 中 最 先 萌 发 且 萌 发 率 达 到 20% 以 上 的 为 S14-X-1 JT1 D4-2-1 CHL11 CHL20 D6-2-1 在 20 h 大 部 分 萌 发 率 已 经 达 到 84% 以 上, 其 中 L1-1-1 萌 发 率 达 到 90% 以 上 20 h JH7 萌 发 率 为 24%,TH9 萌 发 率 为 16%, 萌 发 率 较 低 该 结 果 表 明, 孢 子 型 萌 发 情 况 最 优, 次 之 为 混 合 型, 最 差 的 为 菌 丝 型 D4-2-1 D6-2-1 CHL20 S14-X-1 CHL11 YSH7 表 3 不 同 培 养 时 间 对 孢 子 萌 发 率 的 影 响 Table.3. Spore germination rate of different strains % 培 养 时 间 t/d 12h 14h 16h 18h 20h TH9 0 0 4 11 16 JH7 1 6 9 11 24 S9-X-1 3 10 23 35 50 D1-5 3 27 36 56 86 L2-8 6 13 26 37 51 T3-2-1 6 20 47 64 78 L1-1-1 12 40 54 76 91 DA3 13 23 33 65 84 YSH7 17 25 54 78 92 D6-2-1 20 56 77 85 96 CHL20 29 68 87 91 95 CHL11 34 73 79 88 91 D4-2-1 37 61 74 93 98 JT1 39 64 76 85 86 S14-X-1 39 76 85 88 92 2.3 不 同 菌 落 直 径 产 孢 量 比 较 特 性 ; D4-2-1 T3-2-1 L2-8 YSH7 CHL20 由 表 2 和 图 2 分 析 可 知,15 株 供 试 菌 落 直 径 产 孢 量 均 在 2.45 10 10 / ml 以 上 菌 落 生 长 迅 速 菌 产 孢 量 存 在 着 明 显 差 异 JH7 S9-X-1 DA3 丝 生 长 特 别 旺 盛 的, 反 而 产 孢 量 都 不 大 或 者 不 产 JT1 D4-2-1 菌 落 直 径 40.7cm, 表 现 出 良 好 的 生 长 孢, 分 析 其 原 因 为 营 养 生 长 过 剩, 生 殖 生 长 反 而 衰 退 吉 林 农 业 大 学 学 报 Journal of Jilin Agricultural University
吉 林 农 业 大 学 学 报 2011 年 9 月 [4] 综 合 2 项 指 标 及 菌 落 形 态, 孢 子 型 菌 落 生 长 迅 速 且 产 孢 量 高 为 最 优, 菌 丝 型 菌 落 生 长 速 度 最 快 但 产 孢 量 低 次 之, 混 合 型 菌 落 生 长 速 度 慢 且 产 孢 量 低 为 最 差 2.4 不 同 胞 外 蛋 白 产 酶 产 生 水 平 比 较 表 4 为 供 试 胞 外 蛋 白 酶 产 量 经 Duncan 检 验 (P=0.196), 各 胞 外 蛋 白 酶 产 生 水 平 差 异 不 显 著, 因 此 胞 外 蛋 白 酶 产 生 水 平 与 类 型 没 有 相 关 性 图 2 不 同 产 孢 量 Table 2. Sporulation of different strains 表 4 供 试 在 明 胶 平 板 上 胞 外 蛋 白 产 酶 水 平 Fig. 4. Extracellular protease productive level of different strains on gelatin-agar s 透 明 环 /mm transparent ring 菌 落 直 径 /mm Diameter of clony 透 明 环 / 菌 落 直 径 Transparent ring/ Diameter YSH7 24.5~25.0 6.0~7.0 3.70±0.37 a CHL20 22.0~29.5 7.0~7.0 3.57±0.57 ab L1-1-1 24.0~26.5 7.0~7.0 3.57±0.19 ab T3-2-1 23.5~26.5 7.0~7.0 3.55±0.22 abc CHL11 20.5~27.0 7.0~7.0 3.45±0.48 abc L2-8 22.0~29.5 6.0~8.0 3.44±0.74 abc JH7 23.0~28.0 7.0~8.0 3.40±0.11 abc S9-x-1 20.0~24.5 6.0~7.0 3.37±0.11 abc D4-2-1 20.5~27.0 7.0~7.0 3.31±0.49 abc D1-5 22.0~25.5 7.0~8.0 3.30±0.24 abc TH9 21.0~23.5 7.0~7.0 3.17±0.18 abc S14-x-1 19.5~22.5 6.0~7.0 3.14±0.32 abc JT1 21.0~21.5 7.0~7.0 3.07±0.07 abc D6-2-1 20.0~21.5 7.0~7.0 2.98±0.11 bc DA3 17.5~22.5 7.0~7.0 2.86±0.36 c 3 讨 论 野 生 白 僵 菌 的 筛 选 是 优 良 白 僵 菌 发 掘 的 主 要 手 段, 由 于 野 生 采 集 量 大, 如 果 进 行 所 有 的 生 物 测 定, 投 入 的 成 本 大, 时 间 长 有 研 究 结 果 表 明, 不 同 球 孢 白 僵 菌 在 培 养 条 件 相 同 时, 菌 株 间 性 状 有 较 大 差 异, 并 且 与 杀 虫 效 果 存 在 相 关 性, 对 定 向 筛 选 目 的 具 有 重 要 意 义 [3] 以 培 养 的 菌 落 形 态 特 征 作 为 白 僵 菌 优 良 初 步 筛 选 的 依 据, 可 以 节 约 成 本 和 时 间, 再 对 筛 选 好 的 进 行 生 物 测 定, 最 终 筛 选 到 优 良 的 目 的 当 以 外 源 蛋 白 质 明 胶 作 为 主 要 碳 源 和 氮 源 时, 球 孢 白 僵 菌 能 合 成 胞 外 蛋 白 酶 并 分 泌 到 培 养 基 中 [1] 有 研 究 发 现 该 蛋 白 酶 产 生 水 平 与 的 侵 染 力 有 密 切 关 系 [5-6] 因 此 在 对 吉 林 省 D4-2-1 CHL20 的 生 防 应 用 还 需 进 一 步 探 索 的 孢 子 萌 发 率 菌 落 生 长 速 度 产 孢 量 等 指 标 在 筛 选 时 并 没 有 统 一 的 标 准, 胞 外 蛋 白 酶 产 生 水 平 虽 然 与 毒 力 相 关, 但 是 并 不 能 作 为 评 价 的 唯 一 手 段, 因 此 筛 选 时 必 须 综 合 评 价 考 虑 在 具 体 实 践 中 还 应 该 结 合 寄 主 的 专 化 性, 选 择 昆 虫 做 生 物 测 定, 得 出 毒 力 评 价 的 指 标 作 为 依 据 吉 林 省 多 年 来 施 用 和 推 广 球 孢 白 僵 菌 进 行 玉 米 螟 的 生 物 防 治 取 得 了 良 好 的 效 果, 本 研 究 从 吉 林 省 未 使 用 过 白 僵 菌 的 地 区 采 集 并 分 离 野 生, 进 行 生 物 学 特 性 的 分 析, 发 现 孢 子 型 白 僵 菌 具 有 良 好 的 生 物 学 特 性, 此 类 与 林 华 锋 等 的 研 究 结 果 一 致 孢 子 型 产 孢 量 大, 对 寄 主 毒 性 强, 具 有 良 好 的 物 理 性 能, 开 发 应 用 价 值 较 大 [3] 其 中 D4-2-1 CHL20 产 孢 量 高, 孢 子 萌 发 早, 且 萌 发 率 高, 菌 落 生 长 速 度 较 快, 胞 外 蛋 白 酶 产 量 与 其 他 无 明 显 差 异, 综 合 各 项 指 标 优 于 其 他, 具 有 较 好 的 应 用 前 景, 在 今 后 的 工 作 中 将 进 一 步 验 证 其 生 物 学 功 能, 为 筛 选 到 优 良 的 白 僵 菌 奠 定 基 础 参 考 文 献 : [1] 王 成 树, 黄 勃, 樊 美 珍, 等. 球 孢 白 僵 菌 数 量 性 状 的 典 型 相 关 分 析 [J]. 菌 物 系 统,1999,18 (4) :385-391. [2] Bidochka M J,Khachatourians G G. Purification and properties of an Journal of Jilin Agricultural University 2011,September
刘 兴 磊 等 : 球 孢 白 僵 菌 不 同 生 物 学 特 性 与 其 菌 落 形 态 特 征 的 相 关 性 分 析 extracellular protease produced by Beauveria bassiana[j].appl [5] Kucera M.Protease from the fungus Metarhizium anisopliae toxic for Environ Microbiol.1987,53:1679-1684. Galleria mellonella larvae[j]. J Invertebr Pathol,1980,35:304-310. [3] 林 华 峰, 李 增 智, 类 美 珍. 白 僵 菌 特 征 的 研 究 及 宣 州 林 区 类 [6] St Leger R L,Durrands PK,Charnley AK.et al. The role of extracellular 型 的 确 定 [J]. 安 徽 农 业 科 学,1996,24:46-52. chymoelastase in virulence of Metarhizium anisopliae.for Mandea [4] 孙 继 美, 汤 坚, 丁 贵 银. 球 孢 白 僵 菌 不 同 生 物 学 特 性 的 研 究 [J]. 安 sexta [J]. J Invertebr Pathol, 1988, 52:285-293. 徽 农 业 大 学 学 报,1996,23(3):297-302. 吉 林 农 业 大 学 学 报 Journal of Jilin Agricultural University