第 五 章
第 一 节 胚 培 养
植 物 胚 培 养 概 况 植 物 胚 胎 培 养 (Embryo Culture): 指 对 植 物 的 胚 子 房 胚 珠 和 胚 乳 进 行 离 体 培 养, 使 其 发 育 成 完 整 植 物 的 技 术 胚 培 养 ( 成 熟 胚 培 养 幼 胚 培 养 ) 胚 珠 培 养 子 房 培 养 胚 乳 培 养 试 管 受 精 等 1904 年,Hanning, 萝 卜 和 辣 根 的 胚
单 子 叶 和 双 子 叶 植 物 的 种 子 及 种 子 的 萌 发
一 植 物 胚 胎 培 养 1 成 熟 胚 培 养 成 熟 胚 为 子 叶 期 以 后 的 胚, 其 在 简 单 的 培 养 基 上 即 可 萌 发 生 长, 对 营 养 条 件 要 求 不 严 格 主 要 用 来 繁 殖 不 易 萌 发 植 物, 或 研 究 胚 和 胚 乳 及 子 叶 的 关 系 等
台 湾 红 豆 杉 成 熟 胚 培 养
牡 丹 成 熟 胚 的 离 体 培 养 与 快 速 繁 殖 Mature embryo culture and rapid propagation of tree peony
2 幼 胚 培 养 对 发 育 早 期 的 胚 进 行 培 养 培 养 技 术 和 条 件 要 求 较 高 幼 胚 可 以 两 种 方 式 生 长 : 继 续 进 行 胚 性 生 长 ; 早 熟 萌 发
3 胚 培 养 的 应 用 克 服 远 缘 杂 交 不 亲 和 性 如 利 用 胚 胎 拯 救 ( Embryo rescue) 技 术 获 得 远 缘 杂 种 打 破 种 子 休 眠, 缩 短 育 种 周 期 提 高 种 子 萌 发 率 特 别 是 对 于 一 些 长 期 营 养 繁 殖 的 植 物 种 子
4 幼 胚 培 养 方 法 1 材 料 的 选 择 与 灭 菌 确 定 授 粉 后 天 数 与 胚 胎 发 育 的 相 应 关 系, 对 于 远 缘 杂 种 胚, 要 在 其 夭 折 前 培 养 2 幼 胚 的 分 离 及 培 养 分 离 : 先 取 出 胚 珠, 剥 离 珠 被, 取 出 完 整 的 幼 胚, 后 培 养 培 养 : 胚 离 体 培 养 发 育 时 期 分 为 异 养 期 和 自 养 期 在 心 形 期 转 入 自 养 生 长 对 于 难 培 养 的 幼 胚, 可 利 用 胚 乳 看 护 培 养
植 物 胚 胎 发 生 过 程 : 原 胚 - 球 形 胚 - 心 型 胚 - 鱼 雷 胚 - 子 叶 胚 球 形 胚 前 期 心 型 胚 前 期 球 形 胚 鱼 雷 胚
黄 瓜 远 缘 杂 种 幼 胎 培 养
5 影 响 胚 培 养 的 因 素 培 养 基 : 无 机 盐 : 成 熟 胚 培 养 基 相 对 简 单, 如 White 幼 胚 培 养 有 MS B5 等, 可 使 K + Ca 2+ 水 平 稍 高 碳 水 化 合 物 : 糖 可 调 节 渗 透 压 ; 碳 源 ; 防 止 幼 胚 早 萌 渗 透 压 的 保 持 对 于 幼 胚 培 养 相 当 重 要 最 适 蔗 糖 浓 度 随 着 胚 的 发 育 时 期 而 降 低
植 物 激 素 成 熟 胚 一 般 不 需 要 外 源 激 素 即 可 萌 发 但 激 素 能 促 进 休 眠 胚 的 萌 发 幼 胚 需 要 外 源 激 素, 应 保 持 外 源 激 素 与 内 源 激 素 的 平 衡 过 低 不 能 促 进 生 长, 过 高 则 易 导 致 幼 胚 脱 分 化 形 成 愈 伤
天 然 提 取 物 及 某 些 蛋 白 制 品 银 杏 幼 胚 培 养 中 添 加 银 杏 胚 乳 有 促 进 作 用 (1934); 曼 佗 罗 幼 胚 培 养 中 发 现 添 加 椰 子 乳 能 很 好 的 促 进 幼 胚 的 发 育 (200-500um 的 幼 胚 ) (1941) 此 外, 大 麦 胚 乳 麦 芽 提 取 物 酵 母 提 取 物 水 解 酪 蛋 白 等 都 能 促 进 幼 胚 的 发 育
环 境 条 件 温 度 : 多 数 为 25-30, 因 植 物 种 类 有 所 差 别 光 照 : 一 般 认 为 黑 暗 或 弱 光 条 件 较 为 合 适 胚 柄 在 幼 胚 培 养 中, 带 有 胚 柄 结 构 有 利 于 幼 胚 的 生 长 但 一 般 较 难 与 胚 一 起 分 离 出 来
二 植 物 胚 乳 培 养 胚 乳 培 养 (Endosperm culture): 指 将 胚 乳 组 织 从 母 体 上 分 离 出 来, 通 过 离 体 培 养, 使 其 发 育 成 完 整 植 株 的 技 术 被 子 植 物 胚 乳 是 双 受 精 的 产 物, 由 极 核 和 雄 配 子 结 合 成 的 三 倍 体 组 织 裸 子 植 物 胚 乳 在 受 精 前 形 成, 为 单 倍 体 目 前, 仅 40 多 种 植 物 进 行 胚 乳 培 养 研 究,20 种 获 得 再 生 植 株, 如 猕 猴 桃 等 多 存 在 混 倍 现 象
胚 乳 培 养 的 应 用 获 得 三 倍 体 植 株, 用 于 育 种 利 用 三 倍 体 植 株 具 有 营 养 体 大, 无 籽 等 特 点 如 无 籽 西 瓜 胚 乳 培 养 也 会 产 生 较 多 的 混 倍 体, 影 响 育 种 利 用 但 可 用 于 染 色 体 工 程 研 究
三 胚 珠 培 养 胚 珠 培 养 : 在 人 工 控 制 的 条 件 下, 对 胚 珠 进 行 离 体 培 养 使 其 生 长 发 育 形 成 幼 苗 的 技 术 1942 首 次 在 兰 花 中 尝 试 成 功, 缩 短 了 从 授 粉 到 种 子 成 熟 的 时 间 1980 年 成 功 培 养 了 未 授 粉 的 非 洲 菊 烟 草 的 胚 珠, 获 得 了 单 倍 体 植 株
由 于 幼 胚 分 离 难 度 大, 而 胚 珠 分 离 则 相 对 容 易, 在 幼 胚 培 养 时 常 采 用 胚 珠 培 养 受 精 胚 珠 培 养 未 受 精 胚 珠 培 养
Ovule 胚 珠 植 物 花 的 结 构 图 示
植 物 胚 珠 结 构 图 示
1 胚 珠 培 养 的 意 义 防 止 杂 种 胚 早 期 败 育, 获 得 杂 种 植 株 ; 受 精 前 胚 珠 培 养, 可 作 为 试 管 受 精 的 基 础 ; 未 受 精 胚 珠 培 养, 能 培 养 获 得 单 倍 体 植 株, 用 于 单 倍 体 育 种
2 胚 珠 培 养 方 法 材 料 的 选 择 : 未 授 粉 胚 珠 : 开 花 前 1-6 天 ; 授 粉 胚 珠 : 授 粉 后 1-120 天 不 等 ; 较 晚 时 期 有 利 于 胚 的 发 育 灭 菌 : 先 对 子 房 或 外 表 组 织 消 毒 灭 菌 后, 后 取 出 胚 珠 培 养
3 影 响 因 素 培 养 基 植 物 激 素 : 细 胞 分 裂 素 对 授 粉 胚 珠 发 育 常 有 促 进 作 用 有 机 物 : 添 加 有 机 附 加 物 可 促 进 授 粉 胚 珠 的 发 育 蔗 糖 浓 度 :3-12%, 通 常 5%, 高 浓 度 利 于 孤 雌 生 殖
胎 座 和 子 房 对 胚 珠 培 养 的 影 响 : 带 有 胎 座 或 子 房 组 织 的 胚 珠 相 对 较 易 培 养 胚 发 育 时 期 的 影 响 : 一 般 来 说, 合 子 或 早 期 原 胚 期 的 胚 珠 较 难 剖 取 和 培 养, 对 培 养 基 的 成 分 要 求 也 较 严 格
四 子 房 培 养 1949 年 和 1951 年 最 早 在 黄 瓜 番 茄 菜 豆 草 莓 烟 草 等 植 物 上 获 得 成 功 授 粉 子 房 培 养 : 形 成 成 熟 果 实 和 种 子 未 授 粉 子 房 培 养 : 形 成 小 的 无 籽 果 实
1 培 养 意 义 获 得 杂 种 植 株 ; 未 授 精 子 房 培 养 为 试 管 受 精 提 供 技 术 基 础 ; 未 受 精 子 房 培 养 能 获 得 获 得 单 倍 体 植 株, 用 于 单 倍 体 育 种
2 未 授 粉 子 房 培 养 材 料 的 选 择 : 发 育 时 期 ( 接 近 成 熟 胚 囊 易 于 成 功 ) 培 养 基 : 基 本 培 养 基 (MS N6 B5 等 ) 植 物 激 素 ( 配 合 使 用 ) 蔗 糖 浓 度 (3-10%) 培 养 方 式 : 直 插 优 于 平 放 单 倍 体 胚 有 多 种, 可 以 是 卵 细 胞 助 细 胞 或 反 足 细 胞 等
五 植 物 离 体 授 粉 指 将 未 授 粉 的 胚 珠 或 子 房 从 母 体 上 分 离 下 来, 进 行 无 菌 培 养, 并 以 一 定 的 方 式 授 以 无 菌 花 粉, 使 之 在 试 管 内 实 现 受 精 的 技 术 可 以 克 服 远 缘 杂 交 中 的 不 亲 和 性, 特 别 是 离 体 子 房 授 粉 和 离 体 胚 珠 授 粉, 能 消 除 柱 头 和 花 柱 所 造 成 的 受 精 前 障 碍
离 体 柱 头 授 粉 离 体 子 房 授 粉 离 体 胚 珠 授 粉 1 离 体 授 粉 类 型
2 离 体 授 粉 方 法 试 验 材 料 的 选 择 : 以 子 房 较 大 胚 珠 较 多 的 植 物 较 易 成 功 离 体 授 粉 的 程 序 : (1) 确 定 开 花 花 药 开 裂 及 授 粉 时 间 (2) 去 雄 后 将 花 蕾 套 袋 隔 离 (3) 制 备 无 菌 子 房 或 胚 珠 (4) 制 备 无 菌 花 粉 (5) 胚 珠 或 子 房 的 试 管 内 授 粉
3 影 响 因 素 外 植 体 培 养 基 培 养 条 件
思 考 题 : 1 为 什 么 幼 胚 培 养 比 成 熟 胚 培 养 要 求 的 培 养 基 和 培 养 条 件 更 为 严 格? 2 比 较 胚 培 养 胚 珠 培 养 和 子 房 培 养 的 异 同 3 胚 胎 培 养 在 育 种 工 作 中 有 哪 些 应 用? 4 离 体 授 粉 的 意 义 主 要 表 现 在 哪 些 方 面?
第 二 节
植 物 单 倍 体 培 养 方 法 花 药 培 养 花 粉 培 养 胚 珠 或 子 房 培 养 ( 未 受 精 ) Ovule
一 植 物 花 药 / 花 粉 培 养 概 述 Guha 和 Maheshwari (1964) 曼 陀 罗 花 药 培 养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟 草 花 粉 培 养 ( 游 离 小 孢 子 培 养 ) Chu(1973) 小 麦 花 粉 培 养 ( 早 期 花 药 培 养 主 要 依 靠 小 孢 子 的 自 然 胚 胎 发 生 产 生 单 倍 体, 能 自 发 形 成 胚 胎 发 生 的 基 因 频 率 较 低, 效 率 极 低 ) 80 年 代 后 期 到 90 年 代 期 间, 花 培 技 术 迅 速 发 展 许 多 作 物 小 孢 子 培 养 已 经 成 功 十 字 花 科 麦 类 水 稻 玉 米 等 90 年 代, 一 些 先 前 被 认 为 是 不 易 进 行 小 孢 子 培 养 的 基 因 型 也 相 续 成 功 Konzak (1999)
1 花 粉 / 花 药 培 养 的 概 念 花 药 和 花 粉 培 养 : 指 在 合 成 培 养 基 上, 改 变 花 粉 的 发 育 途 径, 使 其 不 形 成 配 子, 而 像 体 细 胞 一 样 进 行 分 裂 分 化 最 终 发 育 成 完 整 植 株 该 发 育 途 径 被 称 为 花 粉 孢 子 体 发 育 途 径 或 雄 核 发 育 两 者 的 异 同 点 培 养 目 的 相 同, 均 获 得 小 孢 子 植 株 花 药 培 养 属 于 器 官 培 养 ; 而 花 粉 培 养 属 于 细 胞 培 养 花 粉 培 养 没 有 药 壁 组 织 干 扰 ; 可 计 数 小 孢 子 产 胚 率 ; 可 观 察 雄 核 发 育 的 全 过 程 ; 单 倍 体 产 量 高 但 技 术 更 复 杂
2 花 药 或 花 粉 培 养 的 作 用 作 物 育 种 缩 短 育 种 周 期 : 常 规 育 种 需 4-6 年 获 得 纯 系, 而 小 孢 子 培 养 仅 需 一 年 供 体 植 株 小 孢 子 (n) 花 培 雄 核 发 育 花 粉 植 株 (n) 自 然 加 倍 人 工 加 倍 纯 合 植 株 DH (2n) 一 年 内 获 得 纯 系
提 高 了 目 标 基 因 型 的 选 择 效 率 例 : 二 倍 体 供 体 植 株 基 因 型 为 AaBb, 从 后 代 中 选 择 基 因 为 AAbb 的 纯 合 单 株 常 规 方 法 : AAbb 出 现 的 概 率 为 1/16, 并 且 不 能 将 AAbb 与 Aabb aabb 区 分 开 AB ab Ab ab AB AABB AaBB AABb AaBb ab aabb aabb aabb aabb Ab AabB AabB AAbb Aabb ab aabb aabb aabb aabb
单 倍 体 方 法 : AAbb 出 现 的 概 率 为 1/4 供 体 亲 本 AaBb 花 培 单 倍 体 二 倍 体 AB------ --------------------> AABB ab----------------------------> aabb Ab----------------------------> AAbb ab-- ----------------------> aabb
诱 变 育 种 中 的 作 用 植 株 不 受 显 隐 性 的 影 响, 在 诱 变 育 种 中 能 在 当 代 及 时 获 得 突 变 个 体, 加 倍 后 成 为 稳 定 的 纯 系
物 种 进 化 研 究 : 可 探 索 亲 本 染 色 体 组 的 构 成 分 析 单 倍 体 植 物 减 数 分 裂 时, 形 成 二 价 体 的 数 目 和 形 状, 能 确 定 染 色 体 组 内 是 否 存 在 同 源 染 色 体 遗 传 分 析 : 单 倍 体 植 株 中 基 因 不 受 显 隐 性 的 影 响, 每 一 个 基 因 的 作 用 均 能 表 现 出 来 能 用 来 研 究 基 因 的 性 质 及 其 作 用 还 可 用 于 基 因 的 剂 量 效 应 分 析 构 建 连 锁 图 谱 : 双 单 倍 体 (DH) 群 体 是 永 久 性 群 体, 能 有 效 地 用 于 遗 传 图 谱 的 构 建 用 于 遗 传 转 化 : 能 直 接 表 达 外 源 基 因, 不 受 显 隐 性 影 响
3 花 粉 孢 子 体 发 育 途 径 ( 雄 核 发 育 ) 花 粉 离 体 培 养 时, 雄 核 发 育 最 适 宜 的 时 期 一 般 是 第 一 次 有 分 裂 或 之 前
3.1 雄 核 发 育 途 径 A 途 径 小 孢 子 第 一 次 有 丝 分 裂 为 均 等 分 裂, 形 成 营 养 细 胞 和 生 殖 细 胞 (1)A-V 途 径 (2)A-G 途 径 由 营 养 细 胞 重 复 分 裂 形 成 单 倍 体 由 生 殖 细 胞 重 复 分 裂 形 成 单 倍 体 (3)A-VG 途 径 (E 途 径 ) 由 营 养 细 胞 和 生 殖 细 胞 各 自 独 立 分 裂, 共 同 形 成 单 倍 体 (4)C 途 径 营 养 细 胞 和 生 殖 细 胞 通 过 核 融 合, 形 成 多 倍 体 植 株 B 途 径 小 孢 子 第 一 次 有 丝 分 裂 为 均 等 分 裂, 形 成 大 小 相 近 的 两 个 细 胞 然 后 由 这 两 细 胞 边 续 分 裂 形 成 单 倍 体 植 株, 或 者 核 融 合 形 成 多 倍 体 植 株
3.2 雄 核 发 育 启 动 机 理 雄 核 发 育 与 P 花 粉 的 形 成 P- 花 粉 : 具 胚 胎 发 生 潜 能 的 花 粉 也 称 小 花 粉 (S- 花 粉 ) 或 不 染 色 花 粉 (NS- 花 粉 ) 雄 核 发 育 与 饥 饿 处 理 饥 饿 处 理 改 变 了 小 孢 子 的 配 子 体 发 育 方 向, 启 动 雄 核 发 育
二 花 粉 植 株 形 态 发 生 方 式 胚 状 体 发 育 途 径 : 小 孢 子 经 历 胚 发 生 的 各 个 阶 段, 最 后 子 叶 展 开, 形 成 花 粉 植 株 愈 伤 组 织 发 育 途 径 : 小 孢 子 分 裂 数 次 形 成 愈 伤, 再 分 化 形 成 花 粉 植 株 此 途 径 产 生 的 植 株 会 出 现 变 异 且 倍 性 复 杂
1 胚 状 体 发 育 途 径 烟 草 花 药 培 养 部 分 花 药 通 过 胚 状 体 途 径 形 成 小 植 株
烟 草 花 药 培 养 通 过 胚 状 体 途 径 形 成 小 植 株
芸 苔 属 小 孢 子 培 养 a) 球 形 胚 d) 鱼 雷 形 胚
2 愈 伤 组 织 发 育 途 径 水 稻 花 药 培 养 接 种 在 平 板 上 的 水 稻 花 药 部 分 花 药 产 生 愈 伤 组 织
水 稻 花 药 培 养 愈 伤 组 织 转 接 种 到 再 生 培 养 基 愈 伤 组 织 分 化 形 成 再 生 植 株
三 花 药 和 花 粉 培 养 方 法 取 材 消 毒 灭 菌 培 养
( 一 ) 花 药 培 养 取 材 镜 检, 根 据 花 粉 的 发 育 时 期, 选 取 大 小 适 宜 的 花 蕾 消 毒 70% 酒 精 擦 洗 花 蕾 表 面, 或 70% 酒 精 浸 泡 30-60s 后 在 1% 次 氯 酸 钠 溶 液 中 浸 泡 10-20min 或 在 0.1% 的 氯 化 汞 溶 液 中 消 毒 3-10min, 无 菌 水 冲 洗 3-5 次 培 养 固 体 或 液 体 培 养 基 均 可 先 进 行 脱 分 化 培 养, 至 小 孢 子 大 量 分 裂 形 成 胚 或 愈 伤, 并 突 破 花 药 壁 表 面, 形 成 突 出 物 (2-3 周 ); 之 后 转 入 分 化 培 养 基 培 养, 形 成 小 植 株
( 二 ) 花 粉 培 养 1 取 材 花 粉 的 分 离 与 纯 化 自 然 散 落 法 ( 漂 浮 培 养 散 落 小 孢 子 收 集 法 ) : 将 花 药 接 种 在 预 处 理 液 或 液 体 培 养 基 上, 待 花 粉 自 动 散 落 后, 收 集 培 养 挤 压 法 : 在 烧 杯 或 研 钵 中 挤 压 花 药, 将 花 粉 挤 出 后 收 集 培 养 机 械 游 离 磁 搅 拌 法 : 磁 力 搅 拌 器 搅 拌 培 养 液 中 的 花 药, 使 花 粉 游 离 出 来 ; 超 速 旋 切 法 : 通 过 搅 拌 器 中 的 高 速 旋 转 刀 具 破 碎 花 蕾 穗 子 花 药, 使 小 孢 子 游 离 出 来 ( 此 法 应 用 最 广 ) 小 孢 子 纯 化 : 对 上 述 方 法 获 得 的 小 孢 子 混 合 物 进 行 分 级 过 筛 梯 度 离 心 处 理 纯 化 小 孢 子
梯 度 离 心 前 ( 小 孢 子 形 态 活 力 不 一 致 ) 30% 蔗 糖 梯 度 离 心 后 ( 获 得 均 一 的 小 孢 子 群 体 )
2 花 粉 培 养 方 式 类 似 细 胞 培 养 平 板 培 养 : 花 粉 臵 琼 脂 固 化 培 养 基 上 培 养 看 护 培 养 : 利 用 花 药 或 花 药 愈 伤 组 织 释 放 出 的 活 性 物 质 促 进 花 粉 小 孢 子 发 育
花 粉 看 护 培 养 图 解
微 室 培 养 : 利 用 小 的 盖 玻 片 和 凹 穴 载 玻 片 形 成 微 室 进 行 花 粉 培 养 条 件 培 养 : 利 用 培 养 过 花 药 的 液 体 培 养 基 或 含 失 活 花 药 提 取 物 的 培 养 基 上 培 养 花 药 条 件 培 养 基 子 房 条 件 培 养 等 液 体 培 养 : 花 粉 悬 浮 在 液 体 培 养 基 中 培 养, 需 震 荡, 以 利 通 气 双 层 培 养 : 花 粉 臵 固 体 - 液 体 双 层 培 养 基 上 培 养 培 养 基 制 作 方 法 : 先 铺 一 层 琼 脂 固 体 培 养 基, 凝 固 后, 在 表 面 加 入 少 量 液 体 培 养 基
3 白 化 苗 现 象
内 因 : 供 体 植 株 基 因 型 ( 如 籼 稻 比 粳 稻 白 苗 率 高 ) 花 粉 发 育 时 期 外 因 : 预 处 理 培 养 基 成 分 激 素 水 平 与 种 类 培 养 条 件 和 方 法 愈 伤 组 织 转 分 化 时 间 等 机 理 : 核 基 因 起 关 键 作 用, 导 致 质 体 DNA 缺 失, 产 生 白 苗 无 性 系 变 异 也 可 能 是 原 因 之 一 控 制 : 通 过 对 花 粉 发 育 时 期 预 处 理 培 养 基 成 分 等 因 素 进 行 调 控
四 影 响 花 粉 花 药 培 养 的 因 素 1 基 因 型 植 物 基 因 型 是 影 响 雄 核 发 育 的 最 重 要 的 因 素 之 一 同 一 物 种 中 的 不 同 基 因 型 对 小 孢 子 离 体 诱 导 反 应 差 异 很 大 如 在 水 稻 中, 籼 稻 花 粉 培 养 力 远 低 于 糯 稻
油 菜 不 同 基 因 型 的 小 孢 子 产 胚 率 比 较 基 因 型 胚 状 体 数 量 /106 小 孢 子 成 苗 率 (%) Topas 10,000-200,000 1-20 Westar 1000-10,000 0.1-1 Delta 100-10,000 0.01-1 Bounty 10-100 0.001-0.01
2 供 体 植 株 生 长 条 件 和 生 理 状 态 植 株 生 长 条 件 : 光 温 等 因 素 均 能 影 响 花 药 培 养 力 一 般 处 于 适 宜 生 长 条 件 ( 如 温 室 中 ) 较 好 但 物 种 间 存 在 差 异 植 株 生 长 时 期 : 一 般 是 开 花 始 期 优 于 开 花 末 期 P 花 粉 的 频 率 : 不 同 温 度 日 照 时 数 氮 饥 饿 及 生 长 物 质 处 理 提 高 P 花 粉 的 数 量
3 花 粉 发 育 时 期 小 孢 子 发 育 时 期 对 诱 导 雄 核 发 育 非 常 重 要 一 般 而 言, 单 核 期 ( 第 一 次 有 丝 分 裂 前 ) 对 诱 导 反 应 最 敏 感, 为 最 佳 培 养 期 形 成 双 核 后, 在 合 适 的 条 件, 主 要 由 营 养 细 胞 分 裂 产 生 胚 状 体
处 于 不 同 发 育 时 期 的 烟 草 小 孢 子 四 分 体 : 醋 酸 洋 红 染 色 单 核 期 双 核 期 四 分 体 : Alexander s 染 色 成 熟 花 粉 粒
液 泡 单 核 晚 期 第 一 次 有 丝 分 裂 后 期 营 养 核 生 殖 核 生 殖 核 双 核 早 期 双 核 中 期
不 同 物 种 诱 导 胚 胎 发 生 的 最 佳 小 孢 子 发 育 时 期 发 育 时 期 减 数 分 裂 期 四 分 孢 子 期 单 核 早 中 期 单 核 晚 期 单 核 早 期 至 晚 期 单 核 早 期 至 双 核 期 四 分 孢 子 期 至 双 核 期 物 种 草 莓 番 茄 葡 萄 石 刁 柏 油 菜 大 麦 天 仙 子 马 铃 薯 荔 枝 茄 子 青 椒 小 麦 烟 草 梨 水 稻 甘 蓝 玉 米
花 粉 发 育 时 期 的 确 定 对 不 同 发 育 阶 段 的 花 药 进 行 培 养 测 试 确 定 最 佳 小 孢 子 发 育 时 期 的 形 态 特 征 处 于 不 同 发 育 阶 段 的 烟 草 花 芽 注 意 形 态 特 征 会 因 品 种 发 育 状 态 环 境 条 件 的 变 化 而 发 生 变 化
4 预 处 理 预 处 理 是 小 孢 子 培 养 成 功 的 前 提 条 件 预 处 理 目 的 : 是 改 变 小 孢 子 的 发 育 方 向, 使 尽 可 能 多 的 小 孢 子 从 配 子 体 发 育 途 径 转 向 孢 子 体 发 育 途 径 ( 即 成 为 具 胚 胎 发 生 潜 力 的 小 孢 子 ) 适 当 的 预 处 理 能 使 绿 苗 产 量 大 量 增 加 预 处 理 方 法 : 主 要 是 对 花 药 进 行 适 度 的 逆 境 处 理, 包 括 低 温 高 温 化 学 物 质 离 心 射 线 等
预 处 理 方 法 : 1 高 低 温 处 理 低 温 预 处 理 : 指 在 接 种 之 前 将 材 料 用 0 以 上 低 温 处 理 一 段 时 间 后 再 接 种 应 用 较 多 处 理 温 度 一 般 在 1-14, 时 间 从 几 小 时 至 几 十 天 不 等 不 同 作 物 所 用 的 预 处 理 温 度 及 时 间 差 异 较 大 不 同 的 处 理 温 度 需 要 不 同 的 时 间 例 子 : 小 麦 穗 子 培 养 前 4 预 处 理 几 天, 花 药 培 养 效 率 显 著 提 高 十 字 花 科 未 经 低 温 预 处 理 的 花 蕾, 每 花 药 产 胚 数 为 4.39 个,6-9 处 理 1 天, 产 胚 数 提 高 到 61.4 个, 预 处 理 4 天 后, 胚 状 体 产 量 降 为 10.47 个
高 温 处 理 ( 热 击 处 理 ): 指 花 药 接 种 后, 先 在 较 高 温 度 下 (30-35 ) 培 养 数 天, 然 后 再 移 至 正 常 温 度 下 继 续 培 养 例 子 : 如 烟 草,32 高 温 ; 小 麦,33 高 温 预 处 理 显 著 地 提 高 了 小 孢 子 胚 胎 发 生 能 力 (Touraev,1996)
2 化 学 物 质 处 理 包 括 高 糖 甘 露 醇 秋 水 仙 素 乙 烯 利 等 进 行 处 理 甘 露 醇 仅 能 维 持 渗 透 压, 不 能 提 供 碳 源, 其 主 要 原 理 是 造 成 小 孢 子 营 养 饥 饿, 从 而 使 小 孢 子 去 分 化 3 其 它 包 括 γ 射 线 离 心 磁 场 等
( 五 ) 培 养 基 1. 基 本 培 养 基 主 要 为 N6 和 MS 培 养 基 在 此 基 础 上 发 展 出 一 些 其 它 的 培 养 基 如 H 培 养 基 ( 适 于 烟 草 ) C17 培 养 基 ( 适 于 小 麦 ) 马 铃 署 -Ⅱ 培 养 基 ( 适 于 马 铃 署 )
2. 碳 源 包 括 蔗 糖 麦 芽 糖 纤 维 二 糖 葡 萄 糖 果 糖 海 藻 糖 等 不 同 作 物 所 需 最 适 的 碳 源 种 类 及 浓 度 的 所 差 异 一 般 认 为 单 子 叶 植 物 比 双 子 叶 植 物 需 糖 的 浓 度 要 高 玉 米 中 蔗 糖 效 果 最 好 ; 而 麦 类 作 物 中, 麦 芽 糖 似 乎 为 最 好 的 碳 源
3 激 素 4 氨 基 酸 5 活 性 碳 6 ph
( 六 ) 培 养 条 件 1 温 度 物 种 间 有 差 异 2 光 照 3 植 板 密 度 植 板 密 度 与 花 培 效 率 有 很 大 的 相 关 性 5 10 3 到 2 10 4 /ml 密 度 均 能 有 效 培 养 一 般 来 说, 足 够 数 量 的 但 相 对 低 密 度 的 小 孢 子 浓 度 有 利 于 小 孢 子 竞 争 营 养 氧 气 细 胞 分 裂 的 空 间, 从 则 有 利 于 胚 状 体 发 生
( 七 ) 花 药 壁 因 素 花 药 组 织 的 存 在 对 小 孢 子 的 胚 性 分 裂 具 有 明 显 的 促 进 作 用 但 花 药 壁 损 伤 会 释 放 有 毒 物 质 影 响 小 雄 核 的 发 育
单 倍 体 植 株 鉴 定 和 染 色 体 加 倍
一 倍 性 鉴 定 ( 为 什 么 要 进 行 倍 性 鉴 定?) 1 染 色 体 直 接 计 数 法 通 常 取 根 尖 茎 尖 等 分 生 组 织 区 进 行 制 片, 直 接 计 数 染 色 体 数 目 2 间 接 鉴 定 (1) 扫 描 细 胞 光 度 仪 鉴 定 ( 流 式 细 胞 仪 ) 主 要 测 定 叶 片 单 个 细 胞 中 DNA 的 含 量 确 定 细 胞 的 倍 性, 材 料 的 使 用 量 可 少 到 1cm2 (2) 细 胞 形 态 学 鉴 定 法 叶 片 保 卫 细 胞 大 小 单 位 面 积 上 的 气 孔 数 及 保 卫 细 胞 中 叶 绿 体 的 大 小 和 数 目 与 倍 性 具 有 高 度 的 相 关 性 (3) 植 株 形 态 学 鉴 定 法 单 倍 体 植 株 瘦 弱, 叶 片 窄 小, 花 小 柱 头 长, 花 粉 粒 小, 不 结 实
(4) 杂 交 鉴 定 法 自 交 或 测 交 鉴 定, 看 后 代 分 离 情 况 确 定 二 倍 体 植 株 是 来 自 小 孢 子 还 是 体 细 胞 (5) 分 子 标 记 鉴 定 包 括 生 化 标 记 ( 如 同 工 酶 标 记 ) 和 分 子 标 记 ( 如 RFLP RAPD AFLP 等 )
二 染 色 体 加 倍 ( 为 什 么 要 进 行 加 倍?) ( 一 ) 茎 段 培 养 将 单 倍 体 植 株 的 茎 段 进 行 培 养, 诱 导 愈 伤 组 织 形 成 由 于 单 倍 体 愈 伤 组 织 在 培 养 过 程 中 会 有 一 定 频 率 的 核 内 有 丝 分 裂, 从 而 形 成 二 倍 体 细 胞, 分 化 出 纯 合 的 二 倍 体 植 株
二 染 色 体 加 倍 ( 为 什 么 要 进 行 加 倍?) ( 二 ) 化 学 试 剂 诱 变 有 秋 水 仙 素 Oryzalin trifluralin APM 等 1 秋 水 仙 素 诱 导 (1) 浸 泡 法 无 菌 条 件 下 以 一 定 浓 度 的 秋 水 仙 素 浸 泡 再 生 小 植 株, 再 转 移 至 新 鲜 培 养 基 中 培 养 (2) 生 长 锥 处 理 秋 水 仙 素 水 溶 液 直 接 涂 抹 生 长 点 ( 顶 芽 或 腋 芽 ) (3) 培 养 基 处 理 将 单 倍 体 植 株 和 任 何 一 部 分 作 为 外 植 体, 种 植 在 附 加 一 定 浓 度 和 秋 水 仙 素 的 培 养 基 中 培 养 一 段 时 间 后, 转 入 无 秋 水 仙 素 的 相 同 培 养 基 中 继 续 培 养 诱 导 胚 状 体 2 除 草 剂 诱 导 ( 毒 性 小, 引 起 植 株 的 变 异 几 率 小 )
花 药 和 花 粉 培 养 基 本 流 程 : 选 择 合 适 的 供 体 植 株 (F1?) 预 处 理 花 药 ( 物 理 或 生 理 逆 境 ) 收 集 具 胚 性 小 孢 子 的 花 药, 或 离 心 收 集 胚 性 小 孢 子 培 养 ( 充 足 的 营 养 合 适 的 温 光 或 条 件 培 养 ) 形 成 胚 状 体 胚 状 体 转 移 至 固 化 培 养 基 上 萌 发 形 成 小 植 株 倍 性 鉴 定 或 染 色 体 加 倍
花 药 和 花 粉 培 养 基 本 流 程 : 选 择 合 适 的 供 体 植 株 (F1?) 预 处 理 ( 物 理 或 生 理 逆 境 ) (pretreatments, media, etc.) REGENERATE MANY PLANTS RECOVER DIPLOIDS BY CHROMOSOME DOUBLING EVALUATE PLANTS/ PROGENY FOR DESIRED GENE COMBINATIONS? USE IN BREEDING PROGRAM?