体 外 三 维 组 织 模 型 模 拟 压 应 力 下 牙 周 膜 细 # 胞 破 骨 促 进 作 用 的 研 究 5 10 15 20 25 30 易 俭 如, 范 晓 枫, 李 美 乐, 王 羽, 李 宇, 赵 志 河 ** ( 口 腔 疾 病 研 究 国 家 重 点 实 验 室, 四 川 大 学 华 西 口 腔 医 院 正 畸 科, 成 都 (610041)) 摘 要 : 本 研 究 利 用 聚 乳 酸 - 羟 基 乙 酸 共 聚 物 (PLGA) 合 成 适 合 牙 周 膜 细 胞 (PDLC) 生 长 的 三 维 组 织 模 型, 并 通 过 重 物 法 研 究 该 模 型 内 PDLC 破 骨 促 进 作 用 的 最 适 压 应 力 在 最 适 压 力 下, 研 究 PDLC 破 骨 诱 导 因 子 表 达 的 改 变 结 果 : 1. 镜 下 观 察 显 示 PDLC 在 PLGA 模 型 中 生 长 状 况 良 好 ;2. 25g/cm2 为 该 模 型 模 拟 牙 周 膜 破 骨 促 进 作 用 的 最 适 力 值 ;3. 在 最 适 压 应 力 下,PDLC 内 破 骨 诱 导 因 子 表 达 明 显 提 高 结 论 : 以 该 PLGA 支 架 进 行 三 维 培 养 的 PDLC 可 以 在 体 外 模 拟 正 畸 过 程 中 牙 周 膜 的 破 骨 促 进 作 用, 证 明 该 模 型 能 成 为 探 索 正 畸 牙 移 动 中 生 物 力 学 反 应 的 有 效 工 具 关 键 词 : 牙 周 膜 细 胞 ; 三 维 培 养 ; 破 骨 形 成 中 图 分 类 号 :R782 The osteoclasogenic effect from PDLCs under pressure in a 3D PLGA tissue model Yi Jianru, Fan Xiaofeng, Li Meile, Wang Yu, Li Yu, Zhao Zhihe (Department of Orthodontics, State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Stomatology Hospital, Sichuan University, Chengdu (610041)) Abstract: The study employed a self-made poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) tissue model for 3D culture of periodontal ligament cells (PDLCs). The optimal pressure force magnitude for this tissue model was investigated, based on which, the osteoclastogenic factor from pressured PDLCs were studied. Results: 1. The PLGA tissue model is suitable for the 3D culture of PDLCS. 2. Compression of 25g/cm2 optimizes the osteoclastogenic effect of PDLCS in this model. 3. Under the optimal force, numerous osteoclastogenesis-related factors were enhanced. Conclusions: The 3D PDLC-PLGA complex could simulate the osteoclastogenesis effect at the pressure side during orthodontic tooth movement, indicating this model could be effective in the study regarding biomechanics during orthodontic treatment. Key words: periodontal ligament cell; 3D culture; osteoclastogenesis 0. 引 言 35 40 牙 周 膜 (periodontal ligament, PDL) 是 正 畸 治 疗 过 程 中 力 学 转 导 最 重 要 的 效 应 组 织 [1] 已 有 研 究 表 明, 骨 粘 连 牙 在 力 的 作 用 下 不 会 产 生 移 动, 证 明 在 正 畸 牙 移 动 过 程 中 牙 周 膜 是 不 可 或 缺 的 [2] 牙 周 膜 细 胞 (periodontal ligament cell, PDLC) 在 应 力 作 用 下 的 基 因 表 达 变 化 一 直 是 研 究 者 们 关 心 的 热 点 大 量 研 究 表 明, 二 维 培 养 的 PDLC 在 压 应 力 刺 激 下 RANKL 表 达 会 增 强, 进 而 促 进 破 骨 细 胞 形 成, 这 是 正 畸 压 力 侧 的 核 心 反 应 过 程 [3] 近 年 来, 随 着 材 料 学 的 进 步, 细 胞 三 维 培 养 得 到 了 快 速 发 展, 其 中 不 乏 学 者 尝 试 三 维 培 养 PDLC 然 而 现 有 尝 试 [4, 并 未 探 查 到 RANKL 表 达 的 上 调 5] 在 本 研 究 中, 我 们 以 聚 乳 酸 - 羟 基 乙 酸 共 聚 物 (PLGA) 作 为 支 架 材 料 建 立 了 一 种 PDLC 基 金 项 目 : 本 课 题 得 到 教 育 部 博 士 点 新 教 师 基 金 (20100181120051) 的 资 助 作 者 简 介 : 易 俭 如 (1991), 男, 研 究 生, 口 腔 正 畸 治 疗 及 其 相 关 生 物 力 学 通 信 联 系 人 : 李 宇 (1979), 男, 副 教 授, 口 腔 正 畸 治 疗 及 其 相 关 生 物 力 学. E-mail: yuli@scu.edu.cn - 1 -
三 维 培 养 模 型 及 压 应 力 加 载 方 法 在 适 当 力 值 的 压 应 力 作 用 下, 该 模 型 中 PLDC 内 RANKL 以 及 其 余 多 种 潜 在 破 骨 诱 导 因 子 的 基 因 表 达 上 调 本 研 究 证 明 以 该 模 型 培 养 PDLC 可 模 拟 体 外 正 畸 过 程 中 牙 周 膜 的 破 骨 促 进 作 用, 同 时 说 明 该 模 型 可 为 探 索 正 畸 牙 移 动 中 生 物 力 学 反 应 提 供 崭 新 而 有 效 的 途 径 45 1. 材 料 和 方 法 1.1 PDLC 的 原 代 培 养 50 55 在 签 署 知 情 同 意 书 后, 收 集 青 少 年 (10-14 岁 ) 患 者 拔 除 的 牙 齿, 采 用 改 良 消 化 加 组 织 块 法 进 行 牙 周 膜 细 胞 原 代 培 养 具 体 步 骤 如 下 : 将 拔 除 的 牙 齿 直 接 放 入 预 DMEM 培 养 基 (Hyclone,USA) 中 并 送 往 实 验 室 ; 大 量 PBS 液 反 复 冲 洗 牙 去 除 血 污 并 用 刀 片 去 除 残 余 的 牙 龈 组 织 及 骨 片 ; 双 抗 液 ( 青 霉 素 : 链 霉 素 =1:1) 浸 泡 牙 齿 3-5 分 钟, 用 刀 片 刮 取 牙 根 中 1/3 牙 周 膜 组 织, 剪 碎 后 放 入 刻 度 离 心 管, 在 胶 原 酶 作 用 下 室 温 振 荡 1 小 时 ; 离 心 后 弃 胶 原 酶 液, 滴 管 吸 取 原 代 培 养 液 (DMEM 高 糖 培 养 基,20% 胎 牛 血 清 (GIBCO,USA),1% 青 霉 素,1% 链 霉 素 ) 打 散 沉 淀, 吹 匀 后 分 装 入 两 个 中 号 培 养 瓶 中, 每 瓶 加 原 代 培 养 液 5ml, 于 37 5%CO 2 培 养 箱 环 境 内 培 养 ; 牙 周 膜 细 胞 爬 出 前 每 5 天 换 液, 待 细 胞 爬 出 后 则 每 3 天 换 液 1.2 PLGA 三 维 支 架 的 合 成 60 65 制 备 三 维 支 架 的 材 料 是 由 乳 酸 与 乙 醇 酸 按 摩 尔 比 75:25 构 成 的 多 聚 物 PLGA( 迪 康 中 [6] 科 生 物 医 学 材 料 有 限 公 司, 成 都 ), 按 本 课 题 组 之 前 报 道 的 方 法 制 备 具 体 步 骤 如 下 : 首 先 利 用 三 氯 甲 烷 溶 解 PLGA, 然 后 将 粒 径 为 200μm 的 致 孔 剂 按 体 积 比 85:15 与 PLGA 混 匀, 并 在 20mm 20mm 的 方 形 模 具 内 成 型 待 溶 剂 彻 底 挥 发 后, 将 材 料 和 模 具 分 离, 然 后 将 材 料 浸 泡 如 蒸 馏 水 中 沥 滤 致 孔 剂, 最 后 烘 干 至 恒 重 制 备 完 成 的 PLGA 支 架 呈 薄 膜 状, 平 均 孔 径 为 200μm, 孔 隙 率 为 85%, 尺 寸 为 20 20 0.3mm 将 PLGA 膜 封 装 消 毒 后 备 用 作 为 观 察 PDLC 在 PLGA 材 料 上 生 长 情 况 的 基 准, 使 用 荧 光 显 微 镜 以 及 扫 描 电 镜 (SEM) 观 察 接 种 空 白 PLGA 具 体 方 法 如 下 :1. 荧 光 显 微 镜, 先 以 PBS 冲 洗 PLGA 膜 2-3 次, 再 用 0.01% 吖 啶 橙 溶 液 对 材 料 进 行 染 色, 然 后 PBS 液 漂 洗 材 料, 最 后 在 荧 光 倒 置 显 微 镜 (inverted microscope,leica DMI6000B, Germany) 下 观 察 ;2. 扫 描 电 镜, 先 以 2.5% 戊 二 醛 固 定 PLGA 材 料 1h, 再 利 用 乙 醇 溶 液 以 梯 度 脱 水 法 完 成 脱 水, 常 规 干 燥 包 埋 镀 金 后 在 扫 描 电 镜 (scanning electron microscope,sem, Inspect F, FEI) 下 进 行 观 察 1.3 PDLC 的 三 维 培 养 70 75 将 消 毒 后 的 PLGA 膜 放 入 六 孔 板 (Falcon) 中, 每 孔 放 1 张 然 后 将 3-6 代 PDLC 常 规 消 化 后 制 备 成 细 胞 悬 液 ( 密 度 约 为 5 10 4 /ml), 在 六 孔 板 每 孔 中 加 入 2ml 细 胞 悬 液, 放 入 培 养 箱 内 常 规 条 件 下 培 养 24 小 时 后 待 PDLC 接 种 稳 定 后, 将 PLGA 膜 转 移 到 新 的 六 孔 板 内 继 续 培 养, 以 避 免 在 原 六 孔 板 底 部 贴 壁 生 长 ( 二 维 培 养 ) 的 干 扰 3 天 后 ( 接 种 4 天 后 ), 通 过 扫 描 电 镜 观 察 和 荧 光 倒 置 显 微 镜 观 察 PDLC-PLGA 复 合 物 形 态, 样 本 制 备 及 染 色 具 体 方 法 同 前 文 所 述 1.4 PDLC 三 维 培 养 的 最 适 静 压 力 - 2 -
1.4.1 静 压 力 的 加 载 PDLC 接 种 培 养 4 天 后, 利 用 改 良 的 重 物 法 对 PDLC-PLGA 复 合 体 施 加 持 续 静 压 力 80 85 加 力 具 体 方 法 如 下 : 将 不 锈 钢 小 球 放 入 圆 柱 型 玻 璃 瓶 中, 通 过 改 变 容 器 中 不 锈 钢 小 球 的 数 量 调 节 压 力 值 由 于 PLGA 膜 横 截 面 面 积 为 4cm 2, 所 以 当 重 物 质 量 分 别 为 20 60 100 140g 时, 其 对 应 的 压 应 力 分 别 为 5 15 25 35g/cm 2 加 力 前, 用 盖 玻 片 覆 盖 PDLC-PLGA 复 合 体, 将 已 灭 菌 的 重 物 置 于 盖 玻 片 上, 于 培 养 箱 内 培 养, 时 间 为 6h 对 照 组 中,PDLC-PLGA 复 合 物 使 用 同 样 的 盖 玻 片 覆 盖 且 不 放 置 重 物, 与 实 验 组 同 条 件 下 培 养 每 一 力 值, 实 验 组 与 对 照 组 各 设 置 12 个 重 复 样 本 1.4.2 RNA 的 提 取 加 力 6h 后, 将 PDLC-PLGA 复 合 体 取 出 置 于 小 号 培 养 皿 里, 用 PBS 液 冲 洗 3-5 次, 去 除 材 料 上 残 留 的 血 清 和 培 养 液 然 后 用 移 液 枪 吸 干 培 养 皿 内 PBS 液, 加 入 1mlTrizol 液 (Invitrogen,USA), 吹 打 直 到 PLGA 支 架 完 全 崩 解 转 移 裂 解 液 移 至 1mlEP 管 内, 提 取 总 90 95 RNA 具 体 步 骤 如 下 : 首 先 向 EP 管 内 加 入 0.2ml 氯 仿, 剧 烈 晃 动 15 秒, 再 在 4 下 离 心 15min (12000rpm), 然 后 吸 取 水 相 至 EP 管 中 向 EP 管 内 加 入 0.5ml 异 丙 醇, 颠 倒 数 次 直 至 液 体 混 匀, 置 于 冰 上 沉 淀 10min 然 后 于 4 下 离 心 10min(12000rpm), 弃 去 上 清 液,EP 管 底 部 可 见 胶 状 RNA 沉 淀 向 EP 管 内 加 入 1ml 75% 乙 醇, 颠 倒 混 匀, 再 于 4 下 离 心 5min (12000rpm), 弃 上 清 液 离 心 机 瞬 时 离 心 后, 移 液 枪 吸 尽 液 体 待 RNA 干 燥 5min 后, 向 RNA 中 加 入 20µl DEPC 水 溶 解, 转 移 至 -80 条 件 下 冻 存 1.4.3 RT-PCR 利 用 试 剂 盒 在 PCR 仪 上 对 提 取 的 RNA 进 行 扩 增, 并 将 扩 增 后 的 样 本 置 于 -20 冰 箱 保 存 备 用 然 后 根 据 传 统 方 法 建 立 反 应 体 系, 并 于 FTC2000 型 荧 光 定 量 PCR 仪 上 进 行 扩 增, 以 GAPDH 作 为 内 参 对 照 扩 增 反 应 结 束 后, 依 据 扩 增 动 力 学 曲 线 测 定 单 个 样 品 荧 光 强 度 达 100 到 阈 值 时 的 扩 增 循 环 数, 并 以 此 计 算 基 因 表 达 量 测 定 指 标 为 RANKL( 表 1), 因 为 该 因 子 在 破 骨 促 进 作 用 中 发 挥 着 最 直 接 和 不 可 或 缺 的 作 用 1.4.4 三 维 培 养 PDLC 压 应 力 下 破 骨 诱 导 因 子 表 达 按 照 2.1-2.4 所 述 方 法, 建 立 PDLC 三 维 培 养 模 型, 选 用 最 适 压 应 力 (25g/cm 2 ) 并 按 照 同 样 方 法 进 行 加 力 加 力 6h 24h 及 72h 后 收 集 样 本, 并 通 过 RT-PCR 检 测 一 系 列 破 骨 诱 导 105 相 关 因 子 基 因 表 达 的 改 变 表 1. 基 因 扩 增 引 物 Tab1. Primer of gene amplification 基 因 引 物 产 物 大 小 RANKL F: 5 -ACCGACATCCCATCTGGTT-3 R: 5 -GCCATCCTGATTAACTATTAGTT-3 120 bp OPG F: 5 -TTGAAATGGCAGTTGATTCCTTT-3 R: 5 -TATCCTCTTTCTCAGGGTGCTTG-3 168bp IL-8 F: 5 -CAAACCTTTCCACCCCAAAT-3 R: 5 -CAAACCTTTCCACCCCAAAT-3 169 bp IL-11 F: 5 -GAGCTCTACAGCTCCCAG-3 R: 5 -TCTTCAGGGAAGAGCCACCT-3 105bp FGF-2 F: 5 -CTGGCTTCTAAATGTGTTAC-3 191bp - 3 -
PTHrP GAPDH 2. 结 果 R: 5 -CTCTTAGCAGACATTGGAAG-3 F: 5 -AATCAGAGCTACCTCGGAG-3 R: 5 -CTTTGTACGTCTCCACCTT-3 F: 5 -ACCACAGCTCATGCCATCAC-3 R: 5 -TCCACCACCCTGGTGCTGTA-3 134bp 429 bp 2.1 原 代 培 养 PDLC 110 约 一 周 后 可 见 少 许 牙 周 膜 细 胞 从 残 余 组 织 块 边 缘 爬 出 弃 掉 培 养 液 后, 用 PBS 冲 洗 2-3 次, 每 培 养 瓶 添 加 约 5ml 常 规 培 养 液 (DMEM 培 养 基,10% 胎 牛 血 清,1% 青 霉 素,1% 链 霉 素 ) 进 行 培 养, 并 常 规 换 液 待 牙 周 膜 细 胞 长 满 培 养 瓶 底 壁 时, 用 含 0.02%EDTA 和 0.25% 胰 酶 的 消 化 液 消 化 细 胞, 并 常 规 分 瓶 传 代 培 养 2.2 PLGA 膜 的 形 态 115 经 吖 啶 橙 染 色 的 PLGA 膜 荧 光 显 微 镜 下 观 察 为 多 孔 状, 可 见 明 显 的 三 维 支 架 结 构 ( 图 1.A) SEM 下 观 察,PLGA 三 维 支 架 表 面 为 凹 凸 不 平 的 多 孔 状 ( 图 1.B) 2.3 三 维 培 养 PDLC 的 形 态 PDLC 接 种 96h 后, 使 用 荧 光 显 微 镜 观 察, 可 见 PDLC 在 PLGA 支 架 内 密 集 地 生 长 ( 图 1.C) 扫 SEM 下 观 察 可 见 PDLC 在 材 料 内 生 长 情 况 良 好, 与 PLGA 直 接 及 PDLC 产 生 的 120 胞 外 基 质 连 成 网 状 ( 图 1.D) 图 1. PLGA 三 维 支 架 镜 下 观 察 125 A 接 种 前 吖 啶 橙 染 色 B 接 种 前 电 镜 观 察 C 接 种 后 吖 啶 橙 染 色 D 接 种 后 电 镜 观 察 Fig 1. Obsevation of PLGA scaffolds under microcsopies A acridine orange staining of PLGA scaffolds B SEM observation of PLGA scaffolds C acridine orange staining of PLGA-PDLC complex D SEM observation of PLGA-PDLC complex - 4 -
2.4 PDLC 三 维 培 养 的 最 适 压 应 力 130 135 各 组 RANKL 基 因 水 平 相 对 表 达 见 图 2 5g/cm2 的 压 应 力 没 有 引 起 RANKL mrna 表 达 改 变 15g/cm 2 使 RANKL 表 达 轻 微 上 调, 但 没 有 统 计 学 意 义 (P>0.05) 当 压 应 力 增 大 到 25 g/cm 2 时, RANKL 的 mrna 表 达 显 著 上 调 (P<0.01), 为 对 照 组 的 10.7 倍 当 力 值 进 一 步 增 大 到 35g/cm 2 时, RANKL 的 mrna 表 达 依 然 显 著 上 调 (P<0.01), 为 对 照 组 的 11.4 倍 压 应 力 为 25 g/cm 2 和 35g/cm 2 时,PDLC 内 RANKL 的 表 达 无 统 计 学 差 异 基 于 较 大 力 值 对 PDLC 生 长 有 更 强 的 抑 制 作 用, 在 本 实 验 中,25 g/cm 2 被 设 为 三 维 培 养 PDLC 最 适 压 应 力 值 ( 图 2) 图 2. 压 力 下 PDLC 的 RANKL 表 达 Fig 2. RANKL expression of pressured PDLC 140 2.5 持 续 压 应 力 下 破 骨 诱 导 因 子 的 表 达 持 续 压 应 力 下, 各 破 骨 诱 导 相 关 因 子 mrna 相 对 表 达 随 时 间 的 变 化 见 图 6 RANKL mrna 表 达 在 受 压 后 6h 和 24h 呈 上 调 趋 势, 在 72h 时 则 下 调 ( 图 3.A) 与 之 对 应 的,OPG mrna 表 达 在 受 压 后 6h 下 调, 于 24h 和 72h 则 明 显 上 调 ( 图 3.A) 其 余 大 量 破 骨 诱 导 因 子 在 整 个 受 压 过 程 中 都 呈 现 上 调 趋 势, 包 括 PTHrP,IL-11,IL-8 及 FGF-2( 图 3.B-F) 145-5 -
图 3. 最 适 力 下 PDLC 破 骨 诱 导 因 子 的 表 达 A:RANKL,OPG B:PTHrP C:IL-11 D:IL-8 E:FGF-2 Fig 3. The osteoclastogenic factors of pressured PDLCs under optimal force A:RANKL,OPG B:PTHrP C:IL-11 D:IL-8 E:FGF-2 150 3. 讨 论 3.1 PDLC 的 三 维 培 养 155 160 随 着 高 分 子 材 料 的 迅 速 发 展, 人 工 合 成 材 料 的 选 择 也 日 益 广 泛 在 众 多 材 料 中, 聚 乳 酸 (PLA) 聚 乙 醇 酸 (PGA) 以 及 两 者 的 共 聚 物 PLGA 因 良 好 的 生 物 相 容 性 以 及 可 降 解 吸 收 性, 是 组 织 工 程 研 究 中 广 为 运 用 的 一 类 材 料 PGA 具 有 亲 水 性 好 的 特 点, 但 其 降 解 速 度 较 快 力 学 性 能 以 及 加 工 性 能 相 对 较 差 ; 与 之 相 反,PLA 降 解 慢, 且 具 有 优 良 的 力 学 性 能, 但 其 细 胞 粘 附 力 不 甚 理 想 PLGA 是 二 者 的 共 聚 物, 兼 具 了 PGA 细 胞 粘 附 性 和 PLA 力 学 强 度 的 优 点 因 此, 我 们 选 用 PLGA 作 为 支 架 材 料 进 行 PDLC 的 三 维 培 养 及 应 力 加 载 当 PDLC 以 5 10 4 /ml 2ml 的 细 胞 量 接 种 后, 粘 附 到 PLGA 膜 的 细 胞 比 例 约 为 70%, 证 明 该 模 型 对 PDLC 有 较 高 的 细 胞 粘 附 性 接 种 4d 后, 通 过 荧 光 显 微 镜 和 SEM 观 察,PDLC 在 三 维 支 架 内 密 集 生 长, 且 可 见 大 量 细 胞 外 基 质 与 PLGA 支 架 和 细 胞 本 身 联 结 成 网 状, 证 明 该 支 架 模 型 对 于 PDLC 的 生 物 相 容 性 良 好 总 的 来 说, 相 对 于 以 往 的 三 维 模 型, 我 们 建 立 的 PLGA 支 架 更 适 合 PDLC 的 三 维 培 养, 为 下 一 步 的 应 力 加 载 试 验 奠 定 了 坚 实 的 基 础 3.2 三 维 培 养 的 最 适 压 应 力 165 170 175 180 [4] [5] 近 年 来, 细 胞 三 维 培 养 技 术 日 益 成 熟 de Araujo 等 和 Lee 等 曾 尝 试 以 胶 原 凝 胶 合 成 支 架 进 行 PDLC 三 维 培 养, 然 而 在 二 者 的 研 究 中 RANKL 均 未 上 调 我 们 认 为 造 成 上 述 结 果 的 一 个 重 要 原 因 是 : 在 这 些 研 究 中, 研 究 者 将 适 用 于 二 维 培 养 的 力 值 未 经 调 整 运 用 于 三 维 培 养 的 细 胞 上 而 实 际 上, 三 维 培 养 使 细 胞 所 处 的 微 环 境 与 体 内 实 际 情 况 更 为 相 似 基 于 此 点, 我 们 在 该 阶 段 试 验 中 采 用 了 更 接 近 临 床 治 疗 的 力 值 胶 原 凝 胶 机 械 性 能 较 差, 在 较 大 的 压 力 作 用 下 容 易 破 碎, 而 人 工 高 分 子 材 料 则 克 服 了 这 个 缺 点 基 于 我 们 曾 以 PLGA 支 架 实 现 成 肌 细 胞 三 维 培 养 及 施 加 张 应 力 的 经 验 [7], 在 该 研 究 中 我 们 以 PLGA 为 支 架 进 行 PDLC 三 维 培 养 并 利 用 重 物 法 施 加 静 压 力 大 量 关 注 正 畸 治 疗 生 物 力 学 的 实 验 证 实 证 实,RANKL 的 表 达 在 正 畸 压 力 侧 骨 改 建 过 程 中 发 挥 着 重 要 作 用 [8] 正 是 因 为 在 压 应 力 刺 激 下 PDLC 产 生 的 RANKL 与 未 分 化 破 骨 前 体 细 胞 上 的 RANK 结 合, 才 增 强 了 破 骨 细 胞 的 分 化 和 成 熟 因 此, 在 该 阶 段 实 验 中 我 们 以 RANKL 作 为 检 测 指 标 判 断 不 同 力 值 的 压 应 力 对 PDLC 促 破 骨 形 成 作 用 影 响 的 差 异 结 果 表 明, 在 低 压 应 力 (5 15g g/cm 2 ) 刺 激 下, RANKL 的 表 达 无 明 显 变 化 ; 而 当 力 值 上 调 至 25g/cm 2 时,RANKL 的 表 达 明 显 增 强 这 说 明 该 模 型 在 PDLC 三 维 培 养 及 应 力 加 载 上 较 之 前 报 道 中 采 用 的 胶 原 凝 胶 模 型 更 接 近 人 体 内 的 实 际 情 况 当 压 力 值 继 续 增 加 至 35g/cm 2 时,RANKL 的 表 达 并 没 有 明 显 上 调 换 言 之,25g/cm 2 和 35g/cm 2 的 压 应 力 刺 激 下 PDLC 产 生 RANKL 的 能 力 非 常 接 近 另 一 个 无 法 忽 略 的 问 题 是 更 大 的 压 力 极 可 能 给 PDLC 的 生 长 繁 殖 带 来 更 大 的 损 伤, 因 此 我 们 将 25g/cm 2 定 为 本 模 型 模 拟 正 畸 压 力 侧 生 物 力 学 反 应 的 最 佳 力 值, 并 将 在 接 下 来 的 实 验 里 采 用 这 一 力 值 - 6 -
3.3 破 骨 诱 导 因 子 的 表 达 185 190 在 25g/cm 2 压 应 力 作 用 下, 我 们 检 测 到 一 系 列 破 骨 诱 导 相 关 因 子 的 改 变 与 已 有 报 道 类 似, 受 到 压 应 力 后 RANKL 表 达 上 调 [3], 然 而 加 力 72h 时,RANKL 的 表 达 反 而 下 调 这 说 明 也 许 存 在 另 外 的 破 骨 诱 导 因 子 在 加 力 较 长 时 间 后 继 续 维 持 破 骨 形 成 作 用 有 趣 的 是, 在 这 一 阶 段 的 实 验 中, 我 们 发 现 众 多 潜 在 破 骨 诱 导 因 子 的 表 达 在 加 力 后 上 调, 如 PTHrP,IL-11, IL-8 以 及 FGF-2 [9, PTHrP 已 被 证 实 在 牙 萌 出 的 骨 吸 收 作 用 中 发 挥 着 重 要 的 作 用 10], 同 时 还 被 证 明 可 以 在 [11, 体 外 作 用 于 牙 囊 细 胞, 提 高 其 RANKL 表 达 并 抑 制 OPG 表 达 12] IL-11 在 成 骨 细 胞 - 破 骨 细 胞 相 互 作 用 的 过 程 中 起 着 重 要 的 作 用 [13] [14, FGF-2 以 及 IL-8 的 上 调 则 与 之 前 的 报 道 一 致 15] 简 而 言 之, 这 些 因 子 都 被 证 实 对 破 骨 细 胞 的 分 化 成 熟 起 着 重 要 的 作 用, 所 以 它 们 很 有 可 能 是 维 持 正 畸 压 力 侧 持 续 破 骨 形 成 作 用 的 重 要 因 子 195 200 4. 结 论 本 研 究 构 建 的 PLGA 支 架 可 以 较 好 地 在 体 外 模 拟 牙 周 膜 组 织 环 境, 可 能 成 为 深 入 研 究 正 畸 牙 移 动 机 制 的 重 要 工 具 细 胞 三 维 培 养 日 趋 普 遍, 但 至 今 对 三 维 培 养 的 细 胞 进 行 力 学 刺 激 的 研 究 尚 处 于 探 索 阶 段, 没 有 成 熟 的 实 验 模 型 可 以 依 赖 实 际 上 三 维 培 养 的 细 胞 更 贴 近 于 体 内 细 胞 真 实 生 长 的 环 境, 其 力 学 刺 激 或 其 他 刺 激 的 施 加 也 应 该 更 贴 近 体 内 实 际 情 况 该 研 究 中, 除 了 经 典 的 RANKL 上 调 外, 我 们 还 观 察 到 PTHrP,IL-11,IL-8 以 及 FGF-2 等 潜 在 破 骨 诱 导 因 子 基 因 表 达 的 增 强 这 些 因 子 在 正 畸 牙 移 动 过 程 中 的 作 用 仍 需 要 进 一 步 研 究 205 210 215 220 225 230 [ 参 考 文 献 ] (References) [1] Wise GE, King GJ. Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement. J Dent Res. 2008 May;87(5):414-34. [2] Mullally BH, Blakely D, Burden DJ. Ankylosis: an orthodontic problem with a restorative solution. Br Dent J. 1995 Dec 9-23;179(11-12):426-9. [3] Kanzaki H, Chiba M, Shimizu Y, Mitani H. Periodontal ligament cells under mechanical stress induce osteoclastogenesis by receptor activator of nuclear factor kappab ligand up-regulation via prostaglandin E2 synthesis. J Bone Miner Res. 2002 Feb;17(2):210-20. [4] de Araujo RM, Oba Y, Moriyama K. Identification of genes related to mechanical stress in human periodontal ligament cells using microarray analysis. J Periodontal Res. 2007 Feb;42(1):15-22. [5] Lee YH, Nahm DS, Jung YK, Choi JY, Kim SG, Cho M, et al. Differential gene expression of periodontal ligament cells after loading of static compressive force. J Periodontol. 2007 Mar;78(3):446-52. [6] Li Y, Zheng W, Liu JS, Wang J, Yang P, Li ML, et al. Expression of osteoclastogenesis inducers in a tissue model of periodontal ligament under compression. J Dent Res. 2011 Jan;90(1):115-20. [7] Li Y, Song J, Yang P, Zou R, Fan X, Zhao Z. Establishment of a three-dimensional culture and mechanical loading system for skeletal myoblasts. Cell Biol Int. 2009 Feb;33(2):192-8. [8] Kanzaki H, Chiba M, Shimizu Y, Mitani H. Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition. J Dent Res. 2001 Mar;80(3):887-91. [9] Kitahara Y, Suda N, Kuroda T, Beck F, Hammond VE, Takano Y. Disturbed tooth development in parathyroid hormone-related protein (PTHrP)-gene knockout mice. Bone. 2002 Jan;30(1):48-56. [10] Yao S, Pan F, Wise GE. Chronological gene expression of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) in the stellate reticulum of the rat: implications for tooth eruption. Arch Oral Biol. 2007 Mar;52(3):228-32. [11] Nakchbandi IA, Weir EE, Insogna KL, Philbrick WM, Broadus AE. Parathyroid hormone-related protein induces spontaneous osteoclast formation via a paracrine cascade. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7296-300. [12] Wise GE, Lumpkin SJ, Huang H, Zhang Q. Osteoprotegerin and osteoclast differentiation factor in tooth eruption. J Dent Res. 2000 Dec;79(12):1937-42. [13] Elias JA, Tang W, Horowitz MC. Cytokine and hormonal stimulation of human osteosarcoma interleukin-11 production. Endocrinology. 1995 Feb;136(2):489-98. - 7 -
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