临床基因扩增检验标本的处理、 保存及核酸提取方法

临 床 基 因 扩 增 检 验 标 本 的 处 理 保 存 及 核 酸 提 取 方 法 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 李 金 明

临 床 标 本 的 正 确 采 集 运 送 保 存 的 重 要 性 临 床 检 验 的 质 量 保 证 措 施 之 一 解 决 涉 及 实 验 室 检 验 的 医 患 纠 纷 的 方 法 之 一

核 酸 提 取 的 重 要 性 核 酸 提 取 是 临 床 PCR 检 验 最 为 关 键 的 部 分, 亦 是 手 式 操 作 的 主 要 部 分 核 酸 提 取 的 成 败 关 系 到 临 床 PCR 检 验 的 正 确 与 否 临 床 PCR 检 验 操 作 中 最 易 出 问 题 的 环 节

标 本 采 集 标 本 采 集 时 间 对 扩 增 检 测 结 果 的 影 响 标 本 采 集 部 位 的 准 备 标 本 的 类 型 和 采 集 量 采 样 质 量 的 评 价 采 样 及 运 输 容 器 标 本 采 集 中 的 防 污 染

标 本 运 送 样 本 一 经 采 集, 则 应 尽 可 能 快 的 送 至 检 测 实 验 室 样 本 中 如 加 入 了 适 当 的 稳 定 剂, 如 用 于 RNA 测 定 加 入 GITC 的 血 清 ( 浆 ) 样 本 和 用 于 DNA 测 定 的 EDTA 抗 凝 血 等, 则 可 在 室 温 下 运 送 或 邮 寄 实 验 室 应 根 据 待 测 靶 核 酸 的 特 性, 对 各 种 临 床 样 本 的 运 送 条 件 作 出 相 应 的 规 定

临 床 标 本 的 处 理 和 保 存 血 清 ( 浆 ) 全 血 外 周 血 单 个 核 细 胞 痰 棉 拭 子 脓 液 体 液 组 织

血 清 ( 浆 ) DNA 测 定, 可 按 照 一 般 的 血 清 标 本 处 理 程 序, 对 测 定 影 响 不 大 RNA 测 定, 标 本 的 获 取 和 保 存 方 式 对 测 定 结 果, 可 能 有 决 定 性 影 响 最 好 是 使 用 EDTA 抗 凝 ( 严 禁 使 用 肝 素, 因 其 对 PCR 扩 增 有 抑 制, 且 很 难 在 核 酸 提 取 过 程 中 完 全 去 除 ) 全 血 标 本, 抗 凝 后 6 小 时 内 分 离 血 浆, 如 使 用 血 清 标 本, 则 需 尽 快 (2 小 时 内 ) 分 离 血 清, 标 本 的 短 期 (1~2 周 ) 保 存 可 在 -20 下, 较 长 期 保 存 应 在 -70 下

全 血 以 全 血 作 为 待 测 标 本 时, 必 须 注 意 抗 凝 剂 的 选 择, 一 般 使 用 EDTA-Na 2 或 枸 椽 酸 钠, 不 可 使 用 肝 素 全 血 样 本 如 用 于 DNA 提 取 检 测, 可 4 下 短 期 保 存, 如 用 于 RNA 检 测, 则 应 在 取 血 后, 尽 快 提 取 RNA

外 周 血 单 个 核 细 胞 外 周 血 单 个 核 细 胞 可 从 抗 凝 全 血 制 备, 主 要 有 两 条 途 径, 一 是 使 用 淋 巴 细 胞 分 离 液 分 离 制 备 ; 二 是 使 用 红 细 胞 裂 解 液, 裂 解 全 血 中 的 红 细 胞, 经 生 理 盐 水 数 次 洗 涤, 即 可 得 到 单 个 核 细 胞 外 周 血 单 个 核 细 胞 如 暂 不 提 取 核 酸, 可 保 存 于 -70 下.

痰 痰 属 于 分 泌 物, 临 床 上 常 用 作 为 结 核 杆 菌 DNA 测 定 标 本 痰 标 本 中 含 有 大 量 粘 蛋 白 和 杂 质, 故 在 核 酸 提 取 时, 需 对 样 本 进 行 初 步 处 理, 即 用 1 mol/l NaOH 或 变 性 剂 液 化 如 用 于 非 结 核 杆 菌 如 肺 炎 支 原 体 的 PCR 检 测, 痰 标 本 只 能 室 温 悬 浮 于 生 理 盐 水 中, 充 分 振 荡 混 匀, 促 使 大 块 粘 状 物 下 沉, 取 上 清 离 心, 所 得 到 的 沉 淀 物 即 可 用 于 核 酸 提 取 液 化 标 本 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取, 可 保 存 于 -70 下

痰 标 本 处 理 的 基 本 模 式 通 用 模 式 简 单 模 式

痰 标 本 处 理 通 用 模 式 试 剂 :(1) 通 用 标 本 处 理 (Universal sample processing, USP) 溶 液 : 由 4-6 mol/l 盐 酸 胍 (GuHCl),50 mmol/l Tris-HCl, ph7.5, 25 mmol/l EDTA, 0.5%Sarkosyl 和 0.1~0.2 mol/l β- 巯 基 乙 醇 (2) 0.05%Tween 80 (3)10%Chelex-100( 含 0.03% Triton X-100 和 0.3% Tween 20)

痰 标 本 处 理 简 单 模 式 试 剂 :(1) 裂 解 液 : 含 终 浓 度 0.1 mol/l NaOH 50μg 蛋 白 酶 K 和 0.05% Triton X- 100

痰 标 本 处 理 中 要 注 意 的 问 题 痰 标 本 在 没 有 加 入 内 标 以 控 制 假 阴 性 的 情 况 下, 不 能 采 用 异 硫 氰 酸 胍 盐 (GuSCN) 方 法 提 取 采 用 这 种 方 法 提 取, 有 可 能 会 在 提 取 过 程 中, 出 现 一 种 可 修 饰 DNA 的 酶, 在 最 后 一 步 提 取 中, 与 核 酸 一 起 洗 提 出 来, 从 而 抑 制 其 后 的 扩 增 在 PCR 主 反 应 混 合 液 中, 加 入 α- 酪 蛋 白 (alpha-casein) 白 蛋 白 等, 有 防 止 此 类 抑 制 物 产 生 的 效 果

棉 拭 子 在 使 用 PCR 方 法 检 测 性 病 病 原 体 时, 临 床 标 本 一 般 为 棉 拭 子, 可 将 棉 拭 子 置 于 适 量 生 理 盐 水 中, 充 分 震 荡 洗 涤 后, 室 温 静 置 5~10 分 钟, 待 大 块 状 物 下 沉 后, 取 上 清 立 即 离 心, 其 后 的 沉 淀 即 可 用 于 DNA 提 取 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取, 则 需 保 存 于 - 70 下.

脓 液 脓 液 的 处 理 依 情 况 而 定, 如 用 于 分 枝 杆 菌 ( 如 结 核 杆 菌 ) 核 酸 测 定 的 标 本, 粘 稠 的 脓 液 可 采 用 痰 标 本 的 处 理 模 式, 先 进 行 液 化, 再 离 心 取 沉 淀 提 取 DNA; 水 样 的 脓 液 则 直 接 离 心, 沉 淀 用 生 理 盐 水 洗 2~3 次 后, 即 可 用 于 DNA 提 取 对 于 用 于 非 分 枝 杆 菌 测 定 的 脓 液 标 本, 如 过 于 粘 稠, 则 加 入 适 量 生 理 盐 水, 充 分 振 荡 后, 静 置, 取 上 清 立 即 离 心, 沉 淀 用 于 DNA 提 取 ; 如 为 水 样, 则 按 上 述 直 接 离 心 取 沉 淀 即 可 沉 淀 标 本 的 保 存 条 件 同 样 为 -70

体 液 临 床 体 液 标 本 包 括 胸 水, 腹 水, 脑 脊 液, 尿 液 等, 可 按 水 样 标 本 的 方 式 离 心 取 沉 淀 后, 提 取 核 酸 沉 淀 样 本 的 保 存 同 上

组 织 组 织 有 新 鲜 组 织 块 和 石 蜡 切 片 新 鲜 组 织 块 的 处 理 步 聚 首 先 用 生 理 盐 水 洗 两 次, 然 后 将 其 捣 碎 或 切 碎, 加 入 生 理 盐 水 后 剧 烈 震 荡 混 匀, 离 心, 弃 上 清, 再 用 蛋 白 酶 K 消 化 后 提 取 核 酸 新 鲜 组 织 最 好 是 保 存 于 50% 乙 醇 中, 具 体 作 法 是, 先 用 生 理 盐 水 将 组 织 洗 一 次, 切 成 宽 度 小 于 1cm 的 小 片, 加 入 适 量 的 生 理 盐 水, 然 后, 边 摇 边 加 入 无 水 乙 醇 至 终 浓 度 为 50%. 这 样 固 定 的 组 织 标 本 室 温 下 可 保 存 数 日,4 可 保 存 6 年 石 蜡 切 片 用 于 核 酸 提 取, 需 先 用 辛 烷 或 二 甲 苯 脱 蜡, 再 用 蛋 白 酶 K 消 化 后 即 可 进 行 DNA 提 取

临 床 标 本 的 滤 纸 上 保 存 临 床 标 本 置 于 经 过 处 理 的 滤 纸 片 上, 如 靶 核 酸 为 DNA, 可 室 温 保 存 数 月 至 数 年, 如 靶 核 酸 为 RNA, 则 可 稳 定 数 周 保 存 在 滤 纸 上 的 标 本, 保 存 时 间 长, 还 可 因 为 标 本 中 的 PCR 抑 制 物 如 血 红 蛋 白 酶 免 疫 球 蛋 白 等 吸 附 于 滤 纸 上, 而 不 对 后 面 的 扩 增 检 测 造 成 影 响 不 管 是 全 血 血 清 ( 浆 ) 还 是 尿 液 粪 便 分 泌 物 等 均 可 此 种 方 法

临 床 标 本 中 PCR 反 应 抑 制 物 内 源 性 的 : 免 疫 球 蛋 白 蛋 白 酶 血 红 素 及 其 代 谢 产 物 白 细 胞 内 的 乳 铁 蛋 白 肌 红 蛋 白 脂 类 粘 蛋 白 尿 素 离 子 胆 盐 多 糖 等 外 源 性 的 : 如 肝 素 抗 凝 剂 纤 维 素 和 硝 酸 纤 维 素 过 度 UV 照 射 后 的 矿 物 油 手 套 滑 石 粉 标 本 容 器 或 采 样 器 材 上 含 有 的 抑 制 物

肝 素 的 作 用 机 理 肝 素 对 MLV 逆 转 录 酶 和 TAQ DNA 聚 合 酶 均 很 强 的 抑 制 作 用, 如 果 临 床 标 本 为 肝 素 抗 凝, 则 在 核 酸 纯 化 过 程 中, 标 本 中 的 肝 素 可 结 合 于 DNA 和 RNA 上, 尽 管 肝 素 和 核 酸 本 身 都 带 正 电 荷 对 标 本 进 行 煮 沸 凝 胶 过 滤 酸 碱 处 理 后 凝 胶 过 滤 反 复 乙 醇 沉 淀 等 均 不 能 去 除 肝 素 的 这 种 干 扰 作 用 每 μg 核 酸 标 本 中 加 入 0.1U 的 肝 素, 即 可 100% 的 抑 制 酶 活 性 在 标 本 中 加 入 肝 素 酶 I 或 Ⅱ1~3 U/μg 核 酸 ( 于 5 mm Tris ph7.5, 1 mm CaCl2, 40 U RNasin 25 2 小 时 ) 可 去 除 肝 素 的 抑 制 作 用

血 红 蛋 白 乳 铁 蛋 白 (lactoferrin) 血 红 蛋 白 和 乳 铁 蛋 白 分 别 是 红 细 胞 和 白 细 胞 内 的 主 要 PCR 抑 制 物, 它 们 均 含 有 铁 抑 制 机 制 可 能 是 :(1) 与 这 些 蛋 白 释 放 铁 离 子 至 PCR 混 合 物 中 有 关 研 究 铁 的 抑 制 效 应 时, 发 现 其 干 扰 DNA 合 成, 而 且 胆 红 素 胆 盐 和 氯 化 高 铁 血 红 素 (Hemin) 等 血 红 蛋 白 衍 生 物, 也 是 PCR 抑 制 物 (2) 亚 铁 血 红 素 (Heme) 可 通 过 返 馈 抑 制 调 节 DNA 聚 合 酶 活 性 及 协 调 红 细 胞 内 血 红 蛋 白 成 分 的 合 成 也 观 察 到, 氯 化 高 铁 血 红 素 通 过 直 接 作 用 于 DNA 聚 合 酶, 与 成 为 一 个 与 靶 DNA 竞 争 的 抑 制 剂 和 核 苷 酸 的 非 竞 争 性 抑 制 剂 (3) 由 于 靶 核 酸 DNA 被 血 液 中 大 量 的 凝 血 有 机 物 质 包 裹 所 致, 使 得 靶 DNA 不 能 接 触 DNA 聚 合 酶

血 红 蛋 白 1%(V/V) 血 液 可 完 全 抑 制 Taq 酶 活 性, 与 Mg2+ 浓 度 无 关 Tth 聚 合 酶 在 含 4%(V/V) 血 液 的 PCR 反 应 混 合 液 中 可 以 进 行 扩 增, 加 入 1U 单 链 DNA 结 合 蛋 白 T4 基 因 32 蛋 白 (gp32),tth 聚 合 酶 在 含 8% (V/V) 血 液 情 况 下, 仍 可 扩 增 因 此, 使 用 Tth 聚 合 酶 和 gp32 蛋 白, 可 实 现 从 临 床 标 本 不 提 取 纯 化 核 酸 直 接 扩 增 靶 DNA 不 同 的 热 稳 定 的 DNA 聚 合 酶 对 临 床 标 本 中 的 抑 制 物 的 敏 感 性 不 一 样

IgG IgG 的 抑 制 作 用 是 由 于 其 与 单 链 DNA 的 相 互 作 用, 使 得 靶 DNA 不 能 与 DNA 聚 合 酶 相 互 作 用 使 用 煮 沸 作 为 标 本 处 理 方 法 或 使 用 PCR 前 的 热 启 动, 将 增 强 IgG 对 PCR 反 应 的 抑 制

去 除 或 减 轻 抑 制 的 一 些 方 法 NaOH 处 理 可 中 和 临 床 标 本 中 的 Taq DNA 聚 合 酶 抑 制 剂, 但 这 种 方 法 不 适 用 于 DNA 含 量 低 的 标 本, 因 为 NaOH 处 理 可 使 DNA 大 量 丢 失

去 除 或 减 轻 抑 制 的 一 些 方 法 加 入 0.6% (wt/vol) 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 可 降 低 血 液 对 Taq DNA 聚 合 酶 的 抑 制 效 应, 既 使 在 2%(vol/vol) 血 液 存 在 下 亦 可 成 功 扩 增, 而 通 常 血 液 含 量 只 能 是 0.2% BSA 也 可 增 加 rtth 或 Taq DNA 聚 合 酶 的 扩 增 能 力, 使 其 对 粪 便 和 肉 类 标 本 中 抑 制 物 的 抵 抗 能 力 分 别 提 高 10 和 20 倍 单 链 DNA 结 合 T4 基 因 32 蛋 白 (gp32) 有 类 似 BSA 的 增 强 效 应

核 酸 纯 化 核 酸 分 离 纯 化 技 术 起 源 于 二 十 世 纪 五 十 年 代, 在 七 十 年 代 和 八 十 年 代 中 传 统 的 核 酸 沉 淀 溶 解 分 离 纯 化 方 法 得 到 了 普 遍 的 应 用 和 推 广 传 统 的 核 酸 提 取 方 法 常 涉 及 去 垢 剂 裂 解 蛋 白 酶 处 理 有 机 溶 剂 提 取 及 乙 醇 沉 淀 等 步 骤

一 般 核 酸 提 取 试 剂 促 使 靶 核 酸 从 细 胞 内 释 出 的 原 理 靶 核 酸 可 以 与 宿 主 细 胞 整 合, 核 内 游 离 及 胞 浆 内 各 种 构 形 存 在 于 细 胞 内, 如 测 定 的 是 病 原 微 生 物, 则 靶 核 酸 存 在 于 细 菌 病 毒 原 虫 或 真 菌 细 胞 内, 如 果 上 述 细 胞 破 裂, 则 靶 核 酸 亦 可 存 在 于 细 胞 外 一 般 均 使 用 去 垢 剂 ( 如 Triton-100) 裂 解 细 胞, 用 一 种 蛋 白 裂 解 酶 ( 如 蛋 白 酶 K) 消 化 结 合 于 核 酸 的 蛋 白 质, 从 而 将 靶 核 酸 从 细 胞 内 释 放 出 来

核 酸 的 分 离 纯 化 核 酸 的 分 离 纯 化 就 是 要 将 蛋 白 脂 类 等 干 扰 核 酸 扩 增 的 物 质 去 除 经 典 方 法 硅 吸 附 法 对 于 商 品 核 酸 提 取 试 剂 盒, 临 床 实 验 室 在 使 用 前, 必 须 对 其 核 酸 提 取 纯 度 和 效 率 进 行 评 价

DNA 提 取 的 经 典 方 法 即 所 谓 的 酚 - 氯 仿 提 取 法

RNA 提 取 的 独 特 性 临 床 标 本 及 实 验 室 环 境 中, 存 在 大 量 对 RNA 具 有 强 烈 降 解 作 用 的 RNase, 而 RNase 较 耐 高 温, 不 易 失 活 如 何 避 免 RNase 对 标 本 的 污 染 及 防 止 RNase 对 提 取 的 RNA 的 降 解, 是 保 证 RNA 成 功 提 取 的 关 键 之 所 在

RNA 提 取 所 用 器 皿 的 处 理 经 高 压 灭 菌 的 一 次 性 使 用 的 塑 料 制 品 如 试 管, 离 心 管 等 基 本 上 无 RNase, 可 以 不 经 预 处 理 直 接 用 于 制 备 和 贮 存 RNA. 实 验 室 用 的 普 通 玻 璃 器 皿 经 常 有 RNase 污 染, 使 用 前 必 须 于 180 干 烤 8 小 时 以 上, 或 用 0.1% 焦 碳 酸 二 乙 酯 (DEPC) 的 水 溶 液 浸 泡 用 于 制 备 RNA 的 烧 杯, 试 管 和 其 它 用 品 DEPC 是 RNase 的 强 烈 抑 制 剂 灌 满 DEPC 的 器 皿 于 37 下 放 置 2 小 时, 然 后 用 灭 菌 水 淋 洗 数 次, 并 于 100 干 烤 15 分 钟, 最 后 高 压 蒸 汽 下 15 分 钟 上 述 处 理 可 除 去 器 皿 上 痕 量 的 DEPC, 以 防 DEPC 通 过 羧 甲 基 化 作 用 对 RNA 的 嘌 呤 碱 基 进 行 修 饰

RNA 提 取 所 用 溶 液 的 准 备 对 于 RNA 提 取 所 需 溶 液 的 配 制, 必 须 用 高 压 灭 菌 的 水 和 RNA 研 究 专 用 的 化 学 试 剂 配 制 溶 液, 用 干 烤 过 的 药 匙 称 取 试 剂, 将 溶 液 装 入 无 RNase 的 玻 璃 器 皿 可 能 的 话, 溶 液 均 应 用 0.1%DEPC 于 37 至 少 处 理 12 小 时, 然 后 于 100 加 热 15 分 钟 或 高 压 蒸 汽 灭 菌 15 分 钟 须 注 意 的 是,DEPC 可 与 胺 类 迅 速 发 生 化 学 反 应, 因 此 不 能 用 来 处 理 含 有 Tris 一 类 的 缓 冲 液, 因 此 可 存 几 瓶 新 的, 未 开 封 的 Tris 试 剂 以 制 备 无 RNase 的 溶 液

RNA 提 取 中 RNase 污 染 的 控 制 实 验 操 作 人 员 的 手 是 RNase 污 染 最 主 要 的 潜 在 来 源 策 略 是 : 在 准 备 用 于 RNA 纯 化 的 实 验 材 料 和 溶 液 时, 以 及 在 涉 及 RNA 的 整 个 提 取 操 作 过 程 中, 都 应 戴 一 次 性 手 套 在 RNA 提 取 实 验 中, 应 勤 换 手 套

RNA 提 取 的 常 用 方 法 (1) 表 面 活 性 剂 加 蛋 白 酶 K, 氯 仿 - 酚 抽 提 法 (2) 胍 盐 提 取 结 合 氯 仿 - 酚 抽 提 法 (3) 胍 盐 提 取 结 合 玻 璃 粉 二 氧 化 硅 等 颗 粒 悬 浮 吸 附 法 等

异 硫 氰 酸 胍 (GuSCN) 结 合 氯 仿 - 酚 提 取 法

核 酸 提 取 的 改 良 方 法 旋 转 离 心 柱 (SPIN COLUMN) 方 法 玻 璃 粉 吸 附 法 二 氧 化 硅 (Se) 或 硅 藻 吸 附 法 微 量 全 血 核 酸 提 取 法 :NaI 方 法 其 它 方 法 : 疏 水 性 Immobilon-P 膜 全 自 动 核 酸 纯 化 仪

旋 转 离 心 柱 (SPIN COLUMN) 属 于 硅 吸 附 方 法 的 一 种 在 原 理 上 现 行 的 旋 转 离 心 柱 系 统 通 常 可 分 为 三 个 部 分 : 第 一 部 分 是 利 用 裂 解 液 促 使 细 胞 破 碎, 使 细 胞 中 的 核 酸 释 放 出 来 ; 第 二 部 分 是 把 释 放 的 核 酸 特 异 地 吸 附 在 特 定 的 硅 载 体 上, 当 然 这 种 载 体 只 对 核 酸 有 较 强 的 亲 和 力 和 吸 附 力 而 对 其 它 的 生 化 组 分 如 蛋 白 质 多 糖 脂 类 则 不 相 亲 和 也 不 吸 附 ; 第 三 部 分 是 把 吸 附 在 特 定 载 体 上 的 核 酸 洗 脱 下 来, 从 而 得 到 纯 化 的 核 酸

玻 璃 粉 吸 附 法

二 氧 化 硅 (Se) 或 硅 藻 吸 附 法

使 用 NaI 的 微 量 全 血 核 酸 提 取 法

靶 核 酸 提 取 的 质 量 纯 化 的 靶 核 酸 的 完 整 性 : 可 使 用 凝 胶 电 泳 将 样 本 的 核 酸 提 取 物 与 一 核 酸 标 准 比 较 测 定 核 酸 提 取 的 产 率 : 可 在 A 260 读 数 测 定 核 酸 纯 度 : 可 通 过 提 取 物 A 260 /A 280 比 率 判 定 血 清 或 血 浆 中 病 原 体 核 酸 纯 化 纯 度 : 采 用 一 种 间 接 的 方 法, 即 使 用 已 知 病 原 体 含 量 的 溶 血 和 / 或 脂 血 标 本 用 待 评 价 试 剂 提 取, 然 后 进 行 扩 增 检 测, 比 较 所 得 到 的 结 果

临 床 标 本 及 核 酸 提 取 中 可 能 存 在 的 非 源 自 标 本 的 抑 制 和 干 扰 物 质 核 酸 提 取 中 : 许 多 试 剂 如 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA) 去 垢 剂 如 十 二 烷 基 硫 酸 盐 (SDS) 和 chaotrope 试 剂 如 异 硫 氰 酸 胍 和 盐 酸 胍 等 酚 氯 仿 乙 醇 等 有 机 溶 剂

核 酸 样 本 制 备 及 扩 增 检 测 的 质 控 对 临 床 标 本 中 可 能 存 在 的 抑 制 / 干 扰 物 的 质 控 措 施 核 酸 提 取 及 扩 增 有 效 性 的 质 控

对 临 床 标 本 中 可 能 存 在 的 抑 制 / 干 扰 物 的 质 控 措 施 质 控 措 施 : 采 用 内 质 控 (internal control, IC)( 通 常 称 为 内 标 ) 的 方 法 内 标 有 两 种, 即 竞 争 性 的 和 非 竞 争 性 的 内 标

谢 谢!