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食 品 微 生 物 之 檢 驗 方 法 - 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 檢 驗 Methods of Test for Food Microorganisms- Test of Pathogenic Escherichia coli 第 一 部 份 : 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 分 離 計 數 及 鑑 別 1. 適 用 範 圍 : 本 方 法 適 用 於 食 品 中 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 檢 驗 2. 檢 驗 方 法 : 檢 體 經 系 列 稀 釋 後, 以 選 擇 性 培 養 基 培 養 及 計 數 之 方 法 或 增 菌 培 養 後 進 行 定 性 分 析 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 須 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好, 操 作 平 台 光 度 為 100 呎 燭 光 以 上, 密 閉 室 內 換 氣 良 好, 儘 可 能 沒 有 灰 塵 及 流 動 空 氣 每 15 分 鐘 落 菌 數 不 得 超 過 15 CFU/ 培 養 皿 2.2. 器 具 及 材 料 2.2.1. 生 物 安 全 操 作 櫃 (Biological safety cabinet, BSC): 第 二 等 級 (class II)( 含 ) 以 上 者 2.2.2. 乾 熱 滅 菌 器 2.2.3. 高 壓 滅 菌 釜 2.2.4. 冰 箱 : 能 維 持 5±3 者 2.2.5. 顯 微 鏡 : 能 放 大 至 1000 倍 之 一 般 光 學 顯 微 鏡 2.2.6. 培 養 箱 : 能 維 持 內 部 溫 差 在 ±1.0 以 內 者 2.2.7. 水 浴 : 能 維 持 水 溫 溫 差 在 ±0.2 以 內 者 2.2.8. 攪 拌 均 質 器 (Blender) 或 鐵 胃 (Stomacher): 能 適 用 於 無 菌 操 作 者 2.2.9. 燈 箱 : 觀 察 血 清 試 驗 用 2.2.10. 吸 管 (Pipette): 已 滅 菌 1 ml 吸 管 應 有 0.01 ml 之 刻 度 ;5 ml 及 10 ml 吸 管 應 有 0.1 ml 刻 度 2.2.11. 培 養 皿 : 已 滅 菌, 內 徑 約 90 mm, 深 度 約 15 mm, 底 皿 之 內 外 面 應 平 坦, 無 氣 泡 刮 痕 或 其 他 缺 點 2.2.12. 稀 釋 用 容 器 : 無 菌 袋 或 有 1000 ml 500 ml 99 ml 及 90 ml 標 記 附 蓋 ( 栓 ) 之 可 滅 菌 廣 口 瓶 2.2.13. 增 菌 用 容 器 : 附 蓋 之 500 ml 或 1000 ml 廣 口 瓶 2.2.14. 杜 蘭 發 酵 管 (Durham fermentation tube): 外 徑 9 22 mm, 使 用 時 倒 置 於 15 150 mm 之 試 管 內 2.2.15. 接 種 針 及 接 種 環 ( 直 徑 約 3 mm): 鎳 鉻 合 金, 鉑 銥 或 鉻 線 材 質, 或 可 拋 棄 式 者 2.2.16. 載 玻 片 及 蓋 玻 片 : 適 用 於 染 色 及 鏡 檢 者 2.2.17. 褐 色 試 藥 瓶 1

2.2.18. 蠟 筆 : 塗 寫 劃 記 載 玻 片 時 使 用 2.2.19. 研 缽 杵 : 研 磨 試 藥 用 2.2.20. 無 菌 濾 膜 : 孔 徑 0.45 μm 或 以 下 之 親 水 性 濾 膜 2.2.21. 試 藥 : 氯 化 鈉 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) 結 晶 紫 (crystal violet) 甲 基 紅 (methyl red) 伊 紅 Y(eosin Y) 亞 甲 藍 (methylene blue) 磷 酸 氫 銨 鈉 (NaNH 4 HPO 4.4H 2 O) 無 水 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ) 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4.12H 2 O) 硫 酸 鎂 (MgSO 4.7H 2 O) 檸 檬 酸 鈉 (Na 3 C 6 H 5 O 7.2H 2 O) 乳 糖 (lactose) 蔗 糖 (sucrose) 葡 萄 糖 (glucose) 葡 萄 糖 (dextrose) 側 金 盞 花 糖 醇 (adonitol) 纖 維 雙 糖 (cellobiose) 阿 拉 伯 膠 糖 (arabinose) 甘 露 糖 醇 (mannitol) 山 梨 酸 糖 醇 (sorbitol) 膽 汁 鹽 (bile salts No.3) 中 性 紅 (neutral red) 溴 甲 酚 紫 (bromocresol purple) 亞 甲 藍 (methylene blue) 溴 麝 香 草 藍 (bromothymol blue) 酚 紅 (phenol red) 離 胺 酸 (L-lysine) 硫 酸 月 桂 酸 鈉 (sodium lauryl sulfate) 黏 液 酸 (mucic acid) 無 水 硫 酸 鎂 (MgSO 4 ) 尿 素 (urea) 草 酸 銨 碘 化 鉀 氰 化 鉀 碘 沙 黃 O (safranin O) 對 - 二 甲 胺 基 苯 甲 醛 (P-dimethylaminobenzaldehyde) α- 萘 酚 (α-naphthol) 氫 氧 化 鉀 肌 酸 (creatine) 95% 乙 醇 無 水 乙 醇 戊 醇 (amyl alcohol) 異 戊 醇 (isoamyl alcohol) 鹽 酸 硝 酸 鉀 (KNO 3 ) 醋 酸 鈉 (CH 3 COONa) 液 態 石 蠟 氫 氧 化 鈉 硝 基 苯 吡 喃 半 乳 糖 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) 四 甲 基 對 位 苯 二 胺 鹽 酸 鹽 (N,N,N,N -tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) 對 - 胺 基 苯 磺 酸 (salfanilic acid) 冰 醋 酸 萘 基 乙 二 胺 鹽 酸 鹽 [N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride] 硫 酸 銨 亞 鐵 [Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2.6H 2 O] 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 ) 聚 己 二 烯 酸 80 (polysorbate 80) 硫 酸 銨 [(NH 4 ) 2 SO 4 ] 丙 二 酸 鈉 (sodium malonate) 及 鋅 粉 均 採 用 化 學 試 藥 級 ; 洋 菜 (agar) 胰 化 蛋 白 月 示 (tryptose) 胰 化 酪 蛋 白 (trypticase) 心 肌 浸 出 物 (heart muscle infusion) 硫 蛋 白 腖 (thiotone) 聚 蛋 白 腖 (polypeptone) 酵 母 抽 出 物 (yeast extract) 牛 肉 抽 出 物 (beef extract) 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone) 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone) 牛 腦 浸 出 物 (calf brain infusion) 牛 心 浸 出 物 (beef heart infusion) 及 蛋 白 腖 (peptone) 均 採 用 微 生 物 級 2.2.22. 試 劑 : 2.2.22.1. 30% 氫 氧 化 鈉 溶 液 : 取 氫 氧 化 鈉 30 g, 以 蒸 餾 水 溶 解 使 2

成 100 ml 2.2.22.2. 1.0 M 磷 酸 二 氫 鈉 溶 液 : 取 磷 酸 二 氫 鈉 6.9 g, 溶 於 蒸 餾 水 45 ml, 徐 徐 注 入 30% 氫 氧 化 鈉 溶 液 約 3 ml 至 ph 值 為 7.0, 再 加 蒸 餾 水 使 成 50 ml, 貯 存 於 4 冰 箱 中 備 用 2.2.22.3. 磷 位 硝 基 苯 吡 喃 半 乳 糖 試 劑 (ONPG reagent): 取 鄰 位 硝 基 苯 吡 喃 半 乳 糖 80 ml, 溶 於 37 蒸 餾 水 15 ml, 加 入 1.0 M 磷 酸 二 氫 鈉 溶 液 5 ml, 貯 存 於 4 冰 箱 中, 使 用 時 須 加 溫 至 37 2.2.22.4. 1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 : 取 氫 氧 化 鈉 4 g, 以 蒸 餾 水 溶 解 使 成 100 ml 2.2.22.5. 5 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 : 取 氫 氧 化 鈉 20 g, 以 蒸 餾 水 溶 解 使 成 100 ml 2.2.22.6. 5 N 醋 酸 溶 液 : 取 冰 醋 酸 286 ml, 加 水 715 ml 2.2.22.7. 50% 葡 萄 糖 溶 液 : 稱 取 葡 萄 糖 5 g, 溶 於 蒸 餾 水 10 ml, 以 無 菌 濾 膜 過 濾 2.2.22.8. 0.5% 氰 化 鉀 溶 液 : 取 氰 化 鉀 0.5 g, 溶 於 冷 卻 至 5~8 之 蒸 餾 水 100 ml ( 氰 化 鉀 劇 毒, 調 製 時 均 應 冷 卻 至 5 ~8, 貯 存 期 限 以 不 超 過 2 週 為 宜 ) 2.2.22.9. 柯 瓦 克 氏 試 劑 (Kovacs reagent): 取 對 - 二 甲 胺 基 苯 甲 醛 5 g, 溶 於 戊 醇 或 異 戊 醇 75 ml, 再 徐 徐 加 入 鹽 酸, 混 合 均 勻 後 應 呈 黃 色, 並 須 保 存 於 4 冰 箱 中 2.2.22.10. 歐 普 氏 試 劑 (Voges Proskauer reagent,vp reagent): 溶 液 A: 取 α- 萘 酚 5 g, 溶 於 無 水 乙 醇 100 ml 溶 液 B: 取 氫 氧 化 鉀 40 g, 溶 於 蒸 餾 水 使 成 100 ml 2.2.22.11. 氧 化 酶 試 驗 試 劑 (Oxidase test reagent): 取 四 甲 基 對 位 苯 二 胺 鹽 酸 鹽 1 g, 溶 於 蒸 餾 水 100 ml, 貯 存 於 褐 色 瓶, 置 於 4 冰 箱 中, 使 用 期 限 以 不 超 過 一 星 期 為 宜 2.2.22.12. 亞 硝 酸 鹽 試 驗 試 劑 (Nitrite test reagents): 試 劑 A: 取 對 - 胺 基 苯 磺 酸 1 g, 溶 於 5 N 醋 酸 溶 液 125 ml 試 劑 B: 取 萘 基 乙 二 胺 鹽 酸 鹽 0.25 g, 溶 於 5 N 醋 酸 溶 液 200 ml 2.2.22.13. 0.85% 生 理 食 鹽 水 : 取 氯 化 鈉 8.5 g 溶 於 蒸 餾 水 1000 ml, 分 裝 於 稀 釋 用 容 器 中, 經 121 滅 菌 15 分 鐘 2.2.22.14. 0.5% 生 理 食 鹽 水 : 取 氯 化 鈉 5.0 g 溶 於 蒸 餾 水 1000 ml, 分 裝 於 稀 釋 用 容 器 中, 經 121 滅 菌 15 分 鐘 2.2.22.15. 甲 基 紅 指 示 劑 (Methyl red indicator): 取 甲 基 紅 0.1 g, 3

溶 於 95% 乙 醇 300 ml, 再 加 蒸 餾 水 使 成 500 ml 2.2.22.16. 稀 釋 液 之 配 製 : 2.2.22.16.1. 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (Butterfield's phosphate-buffered dilution water, BPBW): 取 磷 酸 二 氫 鉀 34 g, 溶 於 蒸 餾 水 500 ml, 以 1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 調 整 ph 值 為 7.2, 再 加 蒸 餾 水 使 成 1000 ml, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 貯 存 於 冰 箱 中, 作 為 原 液 使 用 時, 取 原 液 1.25 ml, 加 入 蒸 餾 水 1000 ml, 分 裝 於 稀 釋 用 容 器 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘 2.2.22.16.2. 磷 酸 鹽 緩 衝 生 理 食 鹽 水 (Phosphate buffered saline, PBS): 取 氯 化 鈉 7.65 g 無 水 磷 酸 氫 二 鈉 0.724 g 及 磷 酸 二 氫 鉀 0.21 g, 溶 於 蒸 餾 水 500 ml, 以 1 N 氫 氧 化 鈉 溶 液 調 整 ph 值 為 7.4, 再 加 蒸 餾 水 使 成 1000 ml, 以 121 滅 菌 15 分 鐘 2.2.23. 革 蘭 氏 染 色 液 (Gram stain solution): 2.2.23.1. 哈 克 氏 (Hucker's) 結 晶 紫 液 ( 初 染 劑 ): 溶 液 A: 取 結 晶 紫 2 g, 溶 於 95% 乙 醇 20 ml 溶 液 B: 取 草 酸 銨 0.8 g, 溶 於 蒸 餾 水 80 ml 將 溶 液 A 與 溶 液 B 混 合, 靜 置 24 小 時 後 以 濾 紙 過 濾, 取 濾 液 作 為 初 染 劑 2.2.23.2. 革 蘭 氏 碘 液 ( 媒 染 劑 ): 取 碘 化 鉀 2 g 及 碘 1 g, 置 於 研 缽 中, 研 磨 5~10 秒, 加 蒸 餾 水 1 ml 研 磨, 次 加 蒸 餾 水 5 ml 研 磨, 再 加 蒸 餾 水 10 ml, 研 磨 至 碘 化 鉀 和 碘 完 全 溶 於 蒸 餾 水 中, 將 此 溶 液 注 入 褐 色 瓶 中, 再 以 適 量 蒸 餾 水 洗 滌 研 缽 及 杵 後, 以 此 洗 液 併 入, 使 溶 液 達 300 ml 2.2.23.3. 哈 克 氏 複 染 液 ( 複 染 劑 ): 取 沙 黃 O 2.5 g, 溶 於 95% 乙 醇 100 ml, 供 作 複 染 原 液 使 用 時, 取 原 液 10 ml, 加 入 蒸 餾 水 90 ml, 作 為 複 染 液 註 1: 革 蘭 氏 染 色 液 因 放 久 可 能 失 效, 購 買 成 品 時, 要 注 意 其 保 存 期 限 ; 自 行 配 製 者, 應 檢 查 其 染 色 效 果 2.2.24. 抗 血 清 : 2.2.24.1. 病 原 性 大 腸 桿 菌 多 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 (Poly-Valent OK type antisera):ok 1 OK 2 OK 3 OK 4 OK 5 2.2.24.2. 病 原 性 大 腸 桿 菌 單 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 (Monovalent 4

OK type antisera) 2.2.24.3. 病 原 性 大 腸 桿 菌 單 價 本 體 抗 血 清 (Monovalent O type antisera) 2.2.25. 培 養 基 : 2.2.25.1. 磷 酸 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液 (Tryptone phosphate broth, TP) 單 位 濃 度 雙 倍 濃 度 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone).. 20 g...40 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 )...2 g...4 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 )...2 g...4 g 氯 化 鈉...5 g...10 g 聚 己 二 烯 酸 80 (polysorbate 80)..15 ml.....30 ml 蒸 餾 水..1000 ml.1000 ml 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.0±0.2 2.2.25.2. 腦 心 浸 出 培 養 液 (Brain heart infusion broth, BHI) 牛 腦 浸 出 物 (calf brain infusion) 200 g 牛 心 浸 出 物 (beef heart infusion) 250 g 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone)... 10 g 氯 化 鈉. 5 g 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4.12H 2 O)..2.5 g 葡 萄 糖 (dextrose) 2 g 加 熱 溶 解 後, 分 裝 於 三 角 瓶 內 或 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.4±0.2 2.2.25.3. 伊 紅 亞 甲 藍 ( 洋 菜 ) 培 養 基 (Levine s eosin methylene blue agar, L-EMB) 蛋 白 腖 (peptone) 10 g 乳 糖 (lactose). 10 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ).2 g 洋 菜 (agar) 15 g 伊 紅 Y (eosin Y)... 0.4 g 亞 甲 藍 (methylene blue). 0.065 g 加 熱 沸 騰 溶 解 後, 分 裝 於 試 管 或 三 角 瓶 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.1±0.1 培 養 基 注 入 培 養 皿 前, 應 搖 動 混 合, 使 絮 狀 沈 澱 物 分 散 均 勻, 搖 動 時 應 避 免 產 生 氣 泡, 培 養 皿 約 倒 入 15~20 ml, 凝 固 後 打 開 皿 蓋 約 1/2~1/4, 使 培 養 基 之 表 面 乾 燥 已 注 入 培 養 皿 之 5

培 養 基 宜 當 天 使 用, 在 冰 箱 中 貯 存 者, 應 於 使 用 前 檢 查 有 無 雜 菌 之 污 染 2.2.25.4. 馬 康 奇 ( 洋 菜 ) 培 養 基 (MacConkey agar) 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone)... 3 g 蛋 白 腖 (peptone)... 17 g 乳 糖 (lactose). 10 g 膽 汁 鹽 (bile salts No.3) 1.5 g 氯 化 鈉. 5 g 中 性 紅 (neutral red) 0.03 g 結 晶 紫 (crystal violet).. 0.001 g 洋 菜 (agar).. 13.5 g 加 熱 沸 騰 溶 解 後, 分 裝 於 試 管 或 三 角 瓶 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.1±0.2 以 下 步 驟 與 2.2.14.3. 節 同 2.2.25.5. 硫 酸 月 桂 酸 胰 化 蛋 白 月 示 培 養 液 (Lauryl sulfate tryptose broth, LST) 胰 化 蛋 白 月 示 (tryptose). 20 g 乳 糖 (lactose).. 5 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 )... 2.75 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ) 2.75 g 氯 化 鈉. 5 g 硫 酸 月 桂 酸 鈉 (sodium lauryl sulfate) 0.1 g 加 熱 溶 解 後, 分 取 9 ml 注 入 試 管 內 或 30 ml 注 入 增 菌 用 廣 口 瓶 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 6.8±0.2 2.2.25.6. 血 液 ( 洋 菜 ) 基 礎 培 養 基 (blood agar base, BAB) 心 肌 浸 出 物 (heart muscle infusion)... 375 g 硫 蛋 白 腖 (thiotone).. 10 g 氯 化 鈉. 5 g 洋 菜 (agar). 15 g 加 熱 沸 騰 溶 解 後, 分 裝 於 容 器 內, 以 121 滅 菌 20 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.3±0.2 2.2.25.7. 三 糖 鐵 ( 洋 菜 ) 培 養 基 (Triple sugar iron agar, TSI) 聚 蛋 白 腖 (polypeptone) 20 g 氯 化 鈉. 5 g 6

乳 糖 (lactose). 10 g 蔗 糖 (sucrose) 10 g 葡 萄 糖 (glucose).. 1 g 硫 酸 銨 亞 鐵 [Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2.6H 2 O].. 0.2 g 硫 代 硫 酸 鈉 (Na 2 S 2 O 3 ). 0.2 g 酚 紅 (phenol red). 0.025 g 洋 菜 (agar). 13 g 加 熱 沸 騰 溶 解 後, 分 取 5 ml 注 入 13 120 mm 試 管 內, 以 118 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.3±0.2 滅 菌 後 作 成 斜 面 培 養 基, 斜 面 長 度 約 4~5 cm, 斜 面 底 部 之 深 度 約 2~3 cm 2.2.25.8. 尿 素 培 養 液 (Urea broth) 尿 素 (urea) 20 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract).. 0.1 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ). 9.1 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ). 9.5 g 酚 紅 (phenol red) 0.01 g 溶 解 後, 經 無 菌 濾 膜 過 濾, 分 取 濾 液 1.5~3 ml, 注 入 已 滅 菌 之 試 管 中, 最 後 ph 值 為 6.8±0.2 2.2.25.9. 溴 甲 酚 紫 培 養 液 (Bromocresol purple broth) 蛋 白 腖 (peptone)... 10 g 牛 肉 抽 出 物 (beef extract)... 3 g 氯 化 鈉.. 5 g 溴 甲 酚 紫 (bromocresol purple). 0.04 g 溶 解 後, 分 取 約 2.5 ml 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 10 分 鐘, 最 終 ph 值 為 7.0 ± 0.2 冷 卻 後, 各 試 管 分 別 加 入 經 無 菌 濾 膜 過 濾 之 50% 葡 萄 糖 溶 液 278 L, 使 培 養 液 中 葡 萄 糖 之 最 終 濃 度 為 5% (w/v) 含 側 金 盞 花 醇 溶 液 纖 維 雙 糖 溶 液 阿 拉 伯 膠 糖 溶 液 甘 露 糖 醇 溶 液 乳 糖 溶 液 及 山 梨 酸 糖 醇 溶 液 之 溴 甲 酚 紫 培 養 液 配 製 方 法 亦 同 2.2.25.10. 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液 (Tryptone broth) 胰 化 蛋 白 腖 (tryptone).. 10 g 7

加 熱 溶 解 後, 分 取 5 ml 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 6.9±0.2 2.2.25.11. 離 胺 酸 脫 羧 酶 培 養 液 (Lysine decarboxylase broth) 蛋 白 腖 (peptone). 5 g 酵 母 抽 出 物 (yeast extract).. 3 g 葡 萄 糖 (glucose).. 1 g 離 胺 酸 (L-lysine). 5 g 溴 甲 酚 紫 (bromocresol purple). 0.02 g 加 熱 溶 解 後, 分 取 5 ml 注 入 附 有 螺 旋 蓋 之 試 管 內, 以 121 滅 菌 10 分 鐘, 最 後 ph 值 為 6.5±0.2 2.2.25.12. 氰 化 鉀 培 養 基 (Potassium cyanide broth) 基 礎 培 養 液 聚 蛋 白 腖 (polypeptone). 3 g 氯 化 鈉. 5 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ). 0.225 g 無 水 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ). 5.64 g 加 熱 溶 解 後, 取 1000 ml 裝 於 三 角 瓶 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.6±0.2 以 安 全 吸 球 吸 取 0.5% 氰 化 鉀 溶 液 15 ml, 加 入 基 礎 培 養 液 1000 ml 中, 混 合 均 勻, 分 取 1~1.5 ml 注 入 已 滅 菌 之 試 管 中 2.2.25.13. MR-VP 培 養 液 (MR-VP broth) 月 示 蛋 白 腖 (proteose peptone)... 7 g 葡 萄 糖 (glucose). 5 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) 5 g 加 熱 溶 解 過 濾 後, 分 取 5 ml 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 6.9±0.2 2.2.25.14. 柯 塞 爾 氏 檸 檬 酸 鹽 培 養 液 (Koser s citrate broth) 磷 酸 氫 銨 鈉 (NaNH 4 HPO 4.4H 2 O) 1.5 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) 1 g 硫 酸 鎂 (MgSO 4.7H 2 O). 0.2 g 檸 檬 酸 鈉 (Na 3 C 6 H 5 O 7.2H 2 O).. 3 g 溶 解 後, 分 取 10 ml 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 6.7±0.2 8

2.2.25.15. 醋 酸 鹽 ( 洋 菜 ) 培 養 基 (Acetate agar) 醋 酸 鈉 (CH 3 COONa). 2 g 氯 化 鈉. 5 g 無 水 硫 酸 鎂 (MgSO 4 ).. 0.2 g 磷 酸 二 氫 銨 (NH 4 H 2 PO 4 ) 1 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ) 1 g 溴 麝 香 草 藍 (bromothymol blue)... 0.08 g 洋 菜 (agar) 20 g 加 熱 沸 騰 溶 解 後, 始 加 入 無 水 硫 酸 鎂 並 混 搖 均 勻 分 取 8 ml 注 入 試 管 內, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 6.7 滅 菌 後 作 成 斜 面 培 養 基, 斜 面 長 度 約 5 cm 2.2.25.16. 黏 液 酸 鹽 培 養 液 (Mucate broth) 蛋 白 腖 (peptone)... 10 g 黏 液 酸 (mucic acid).. 10 g 溴 麝 香 草 藍 (bromothymol blue). 0.024 g 蛋 白 腖 加 熱 溶 解 後, 始 加 入 黏 液 酸, 再 徐 徐 注 入 5 N 氫 氧 化 鈉 溶 液, 攪 拌 使 完 全 溶 解, 分 取 5 ml 注 入 附 有 螺 旋 蓋 之 試 管 內, 以 121 滅 菌 10 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.4±0.1 2.2.25.17. 黏 液 酸 鹽 對 照 培 養 液 (Mucate control broth) 蛋 白 腖 (peptone)... 10 g 溴 麝 香 草 藍 (bromothymol blue). 0.024 g 加 熱 溶 解 後, 分 取 5 ml 注 入 附 有 螺 旋 蓋 之 試 管 內, 以 121 滅 菌 10 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.4±0.1 2.2.25.18. 吲 哚 亞 硝 酸 鹽 培 養 基 (Indole nitrite medium) 胰 化 酪 蛋 白 (trypticase) 20 g 無 水 磷 酸 氫 二 鈉 (Na 2 HPO 4 ).. 2 g 葡 萄 糖 (Dextrose) 1 g 硝 酸 鉀 (KNO 3 ) 1 g 洋 菜 (agar)... 1 g 加 熱 並 煮 沸 1~2 分 鐘, 俟 完 全 溶 解 後, 分 取 5 ml 注 入 試 管 內, 以 118 滅 菌 15 分 鐘, 最 後 ph 值 為 7.2±0.2 9

2.2.25.19. 丙 二 酸 鹽 培 養 液 (Malonate broth) 酵 母 抽 出 物 (yeast extract). 1 g 硫 酸 銨 [(NH 4 ) 2 SO 4 ] 2 g 磷 酸 氫 二 鉀 (K 2 HPO 4 ). 0.6 g 磷 酸 二 氫 鉀 (KH 2 PO 4 ). 0.4 g 氯 化 鈉. 2 g 丙 二 酸 鈉 (sodium malonate).. 3 g 葡 萄 糖 (glucose) 0.25 g 溴 麝 香 草 藍 (bromthymol blue).. 0.025 g 加 熱 溶 解 後, 分 取 約 3 ml 注 入 試 管 中, 以 121 滅 菌 15 分 鐘, 最 終 ph 值 為 6.7 ± 0.2 2.3. 檢 液 之 調 製 : 2.3.1. 檢 體 之 處 理 : 2.3.1.1. 固 態 檢 體 : 將 檢 體 適 當 切 碎, 混 合 均 勻 後, 取 25 g, 加 入 已 滅 菌 之 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 225 ml, 用 攪 拌 均 質 器 攪 拌 先 以 低 速 攪 拌 數 秒 鐘, 再 高 速 攪 拌, 攪 拌 之 總 時 間 不 能 超 過 2 分 鐘, 作 為 10 倍 稀 釋 檢 液 2.3.1.2. 粉 狀 粒 狀 或 其 他 易 於 粉 碎 之 檢 體 : 使 用 已 滅 菌 之 藥 勺 或 其 他 方 便 使 用 之 用 具, 將 檢 體 粉 碎, 並 混 合 均 勻, 取 25 g, 加 入 已 滅 菌 之 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 225 ml, 作 為 10 倍 稀 釋 檢 液 2.3.1.3. 液 態 檢 體 : 用 振 盪 方 式, 將 檢 體 混 合 均 勻, 取 25 ml, 加 入 已 滅 菌 之 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 225 ml, 作 為 10 倍 稀 釋 檢 液 2.3.1.4. 冷 凍 檢 體 : 須 解 凍 之 檢 體, 如 冷 凍 魚 畜 ( 肉 ) 蔬 果 水 餃 等, 應 在 冷 藏 之 溫 度 下 解 凍 ( 如 2~5,18 小 時 內 即 可 解 凍 完 全 ); 亦 可 使 用 更 高 的 溫 度 快 速 解 凍 ( 置 於 45 以 下 之 水 浴 中, 可 於 15 分 鐘 內 解 凍 者 ) 解 凍 時 應 經 常 搖 動 檢 體, 以 加 速 解 凍 俟 檢 體 解 凍 後, 再 予 以 切 碎 並 混 合 均 勻 取 25 g, 加 入 已 滅 菌 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 225 ml, 用 攪 拌 均 質 器 攪 拌 ( 攪 拌 方 法 同 2.3.1.1. 節 ), 作 為 10 倍 稀 釋 檢 液 不 須 解 凍 者, 如 食 用 冰 塊 冰 棒 冰 淇 淋 等 冰 類 製 品, 應 速 先 行 使 成 適 當 小 塊 取 25 g, 加 入 已 滅 菌 之 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 225 ml, 用 攪 拌 均 質 器 攪 拌 ( 攪 拌 方 法 同 2.3.1.1. 節 ), 作 為 10 倍 稀 釋 檢 液 10

2.3.1.5. 凝 態 及 濃 稠 液 態 檢 體 : 如 布 丁 煉 乳 等 檢 體, 經 適 當 攪 拌 均 勻 後, 取 25 g 加 入 已 滅 菌 之 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 225 ml, 用 攪 拌 均 質 器 攪 拌 ( 攪 拌 方 法 同 2.3.1.1. 節 ), 作 為 10 倍 稀 釋 檢 液 註 2: 處 理 含 油 脂 量 多, 不 易 勻 散 及 易 起 泡 沫 之 檢 體 時, 應 加 入 適 量 之 滅 菌 乳 化 劑 ( 如 Triten X-100 Tergitol Anionic 7 或 1% Tween 80, 使 其 於 檢 液 中 濃 度 為 1%), 充 分 振 搖, 使 之 乳 化 2.3.2. 檢 液 之 處 理 : 分 別 使 用 滅 菌 之 吸 管, 吸 取 2.3.1. 節 之 10 倍 稀 釋 檢 液 10 ml, 加 入 BHI 培 養 液 90 ml, 依 序 作 成 一 系 列 適 當 之 100 倍 1000 倍 及 10000 倍 等 稀 釋 檢 液, 其 稀 釋 方 法 如 下 圖 所 示 25 g 或 25 ml ( 原 液 ) 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 225 ml 90 ml 90 ml 90 ml 10 倍 100 倍 1000 倍 10000 倍 2.4. 鑑 別 試 驗 : 2.4.1. 平 板 計 數 法 : 將 2.3. 節 之 10 倍 稀 釋 檢 液 塗 抹 於 馬 康 奇 ( 洋 菜 ) 培 養 基 表 面, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 20 小 時 2.4.2. 增 菌 培 養 : 將 2.3.1. 節 檢 體 處 理 之 PBS 或 BPBW 稀 釋 液 以 BHI 培 養 液 取 代, 充 分 混 合, 於 室 溫 振 盪 培 養 10 分 鐘, 再 靜 置 10 分 鐘 使 檢 體 自 然 沉 澱, 取 上 層 BHI 培 養 液 於 另 外 已 滅 菌 之 容 器, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 3 小 時, 使 細 胞 復 甦 (resuscitation) 移 入 等 量 之 雙 倍 濃 度 之 TP 培 養 液, 於 44±0.2 培 養 20 小 時 2.4.3. 分 離 培 養 : 自 4.1. 節 之 馬 康 奇 ( 洋 菜 ) 培 養 基 直 接 取 鉤 取 可 疑 菌 落, 增 菌 培 養 之 2.4.2. 節 TP 培 養 液 各 取 一 白 金 耳 量, 分 別 在 L-EMB 及 馬 康 奇 ( 洋 菜 ) 培 養 基 表 面 劃 面 後, 於 35 培 養 箱 培 養 20 小 時, 觀 察 所 形 成 菌 落 之 生 長 狀 態, 若 為 可 疑 病 原 性 大 腸 桿 菌 者, 在 L-EMB 之 菌 落 為 直 徑 2-4 mm, 頂 部 凸 狀, 中 央 暗 紫 色 具 金 屬 光 澤, 在 馬 康 奇 ( 洋 菜 ) 培 養 基 上 之 菌 落 為 紅 色 無 色 或 淡 粉 紅 色, 挑 取 可 疑 菌 落 接 種 於 血 液 ( 洋 菜 ) 基 礎 培 養 基 斜 面 上, 置 於 35 培 養 箱 中 11

, 培 養 24±2 小 時 後, 供 作 生 化 試 驗 及 血 清 型 別 試 驗 用 2.4.4. 革 蘭 氏 染 色 (Gram stain) (1) 加 適 量 無 菌 生 理 食 鹽 水 於 載 玻 片 上, 以 接 種 針 ( 或 環 ) 鉤 取 適 量 菌 株, 均 勻 塗 抹 成 薄 抹 片, 風 乾 後 迅 速 通 過 火 焰 3~4 次 微 熱 固 定, 勿 直 接 火 烤 (2) 初 染 : 將 已 固 定 之 抹 片, 用 哈 克 氏 結 晶 紫 液 染 1 分 鐘, 水 洗 (3) 媒 染 : 加 革 蘭 氏 碘 液 作 用 1 分 鐘, 水 洗 (4) 脫 色 : 用 95% 乙 醇 洗 至 不 再 有 紫 色 褪 出 時, 再 水 洗, 此 步 驟 僅 約 30 秒, 惟 視 抹 片 之 厚 薄 而 定 (5) 複 染 : 用 哈 克 氏 複 染 液 複 染 30 秒, 水 洗 (6) 風 乾 (7) 鏡 檢 : 呈 現 深 紫 色 者 為 革 蘭 氏 陽 性 菌, 呈 現 淡 紅 色 者 為 革 蘭 氏 陰 性 菌 結 果 為 革 蘭 氏 染 色 陰 性, 無 芽 胞 桿 菌 者, 則 為 可 疑 病 原 性 大 腸 桿 菌 2.4.5. 生 化 試 驗 : 自 2.4.3. 節 之 血 液 ( 洋 菜 ) 基 礎 培 養 基 斜 面 上 鉤 菌 ; 作 以 下 試 驗 2.4.5.1. 初 步 試 驗 : 2.4.5.1.1. 硫 化 氫 產 生 試 驗 (H 2 S production test): 鉤 菌 利 用 斜 面 劃 線 及 穿 刺 法 接 種 方 法 :TSI 斜 面 ( 洋 菜 ) 培 養 基, 置 於 35 培 養 箱 中, 培 養 20±2 小 時, 培 養 基 呈 黑 色 者 為 正 反 應 (+), 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.1.2. 尿 素 酶 試 驗 (Urease test): 鉤 菌 接 種 於 尿 素 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 20±2 小 時, 培 養 液 由 橘 紅 色 變 為 紫 紅 色 者 為 正 反 應 (+), 仍 維 持 橘 紅 色 者 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.1.3. 阿 拉 伯 膠 糖 發 酵 試 驗 (Arabinose fermentation test): 鉤 菌 接 種 於 阿 拉 伯 糖 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 20±2 小 時, 培 養 液 由 紫 色 變 為 黃 色 者 為 正 反 應 (+), 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.1.4. 吲 哚 試 驗 (Indole test): 鉤 菌 接 種 於 胰 化 蛋 白 腖 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 24±2 小 時, 加 入 柯 瓦 克 氏 試 劑 0.2 ml, 輕 輕 搖 動 後 靜 置 10 分 鐘, 上 層 呈 現 紅 色, 則 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 通 常 為 正 反 應, 經 上 述 試 驗 確 認 為 可 疑 病 原 性 12

大 腸 桿 菌 時, 始 繼 續 進 行 以 下 試 驗 2.4.5.1.5. 鄰 位 硝 基 苯 吡 喃 半 乳 糖 試 驗 (ONPG test): 自 2.4.5.1.1. 節 之 可 疑 病 原 性 大 腸 桿 菌 反 應 之 TSI Agar 斜 面 上 鉤 菌, 置 於 含 有 0.85% 生 理 食 鹽 水 0.2 ml 之 試 管 中, 作 成 懸 浮 液 後, 再 加 入 一 片 浸 過 鄰 位 硝 基 苯 吡 喃 半 乳 糖 試 劑 之 濾 紙 小 圓 片, 輕 輕 搖 動 後, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 6 小 時, 濾 紙 小 圓 片 變 成 黃 色 者 為 正 反 應 (+), 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 經 鄰 位 硝 基 苯 吡 喃 半 乳 糖 試 驗 確 認 為 可 疑 病 原 性 大 腸 桿 菌 時, 始 繼 續 進 行 以 下 試 驗 2.4.5.2. 第 二 步 試 驗 : 2.4.5.2.1. 側 金 盞 花 醇 發 酵 試 驗 (Adonitol fermentation test): 鉤 菌 接 種 於 側 金 盞 花 醇 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中, 培 養 48 小 時, 培 養 液 由 紫 色 變 為 黃 色 者 為 正 反 應 (+), 否 則 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.2. 氰 化 鉀 試 驗 (KCN test): 鉤 菌 接 種 於 氯 化 鉀 培 養 液 後 以 橡 皮 塞 封 緊 試 驗 管 口, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時, 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次, 培 養 液 由 清 澈 狀 變 為 混 濁 狀 者 為 正 反 應 (+), 仍 維 持 清 澈 狀 者 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.3. 離 胺 酸 脫 羧 酶 試 驗 (Lysine decarboxylase test): 鉤 菌 接 種 於 離 胺 酸 脫 羧 酶 培 養 液 後, 徐 徐 注 入 液 態 石 蠟 至 高 約 2.5 cm, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 96±2 小 時, 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次 培 養 液 維 持 原 紫 色 者 為 正 反 應 (+), 由 紫 色 變 為 黃 色 者 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.4. 普 氏 試 驗 (VP test): 鉤 菌 接 種 於 MR-VP 培 養 液 中, 並 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時 後, 取 培 養 液 1 ml 至 另 一 已 滅 菌 之 試 管 中, 加 入 歐 普 氏 試 劑 之 溶 液 A 0.6 ml 及 溶 液 B 0.2 ml 後, 再 加 入 少 許 肌 酸, 振 搖 均 勻, 經 2~4 小 時 後 觀 察 結 果, 呈 現 粉 紅 色 則 為 正 反 應 (+), 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.5. 纖 維 雙 糖 發 酵 試 驗 (Cellobiose fermentation test): 鉤 菌 接 種 於 纖 維 雙 糖 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時 後, 培 養 液 由 紫 色 變 為 黃 色 者 為 13

正 反 應 (+), 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.6. 檸 檬 酸 鹽 利 用 試 驗 (Citrate utilization test): 鉤 菌 接 種 於 柯 塞 爾 氏 檸 檬 酸 鹽 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 72~96 小 時 後, 呈 現 混 濁 狀, 則 為 正 反 應 (+); 仍 維 持 原 澄 清 狀 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.7. 乳 糖 產 氣 試 驗 : 鉤 菌 接 種 於 乳 糖 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時 後, 產 生 氣 體 者, 則 為 正 反 應 (+); 未 產 生 氣 體 者, 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.8. 丙 二 酸 鹽 試 驗 (Malonate test): 鉤 菌 接 種 於 丙 二 酸 鹽 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時, 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次 培 養 液 由 綠 色 變 為 藍 色 者 為 正 反 應 (+); 仍 維 持 綠 色 者 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.9. 甘 露 醇 利 用 試 驗 (Mannitol utilization test): 鉤 菌 接 種 於 甘 露 醇 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時 後, 顏 色 由 紫 色 變 為 黃 色, 且 有 氣 體 產 生 者 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.10. 葡 萄 糖 發 酵 試 驗 (Glucose fermentation test): 鉤 菌 接 種 於 葡 萄 糖 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時 後, 顏 色 由 紫 色 變 為 黃 色, 且 有 氣 體 產 生 者 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.11. 甲 基 紅 試 驗 (MR test): 將 2.4.5.2.4. 節 剩 餘 之 MR-VP 培 養 液 再 培 養 48±2 小 時 後, 加 入 甲 基 紅 指 示 劑 0.3 ml, 輕 輕 搖 勻, 仍 為 紅 色, 則 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.12. 醋 酸 鹽 氧 化 試 驗 (Acetate oxidation test): 鉤 菌 接 種 於 醋 酸 鹽 ( 洋 菜 ) 培 養 基 斜 面 上, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時, 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次 ; 斜 面 上 有 菌 體 生 長 且 培 養 基 由 綠 色 變 為 藍 色 者 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.13. 黏 液 酸 鹽 利 用 試 驗 (Mucate utilization test): 鉤 菌 分 別 接 種 於 黏 液 酸 鹽 培 養 液 及 黏 液 酸 鹽 對 照 培 養 液 中, 置 14

於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時, 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次 黏 液 酸 鹽 培 養 液 由 藍 色 變 為 黃 色, 而 黏 液 酸 鹽 對 照 培 養 液 仍 維 持 藍 色 者 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 註 3: 對 於 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 類 似 Shigella 不 產 氣 無 運 動 性 乳 糖 發 酵 較 慢 者, 在 離 胺 酸 脫 羧 酶 試 驗, 醋 酸 鹽 氧 化 試 驗, 粘 液 酸 鹽 利 用 試 驗 中 其 中 一 次 或 一 次 以 上 為 正 反 應 2.4.5.2.14. 細 胞 色 素 氧 化 酶 試 驗 (Cytochrome oxidase test): 鉤 菌 接 種 於 BAB 斜 面 上, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 24±2 小 時 後, 滴 加 2~3 滴 氧 化 酶 試 驗 試 劑 於 斜 面 之 菌 落 上, 於 2 分 鐘 內 菌 落 上 粉 紅 色 後 逐 漸 轉 變 為 暗 紫 色 者 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 負 反 應 2.4.5.2.15. 硝 酸 鹽 還 原 試 驗 (Nitrate reduction test): 鉤 菌 接 種 於 亞 硝 酸 鹽 培 養 基 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 18~24 小 時, 取 培 養 液 3 ml 至 另 一 已 滅 菌 之 試 管 中, 加 入 亞 硝 酸 鹽 試 驗 試 劑 A 及 試 劑 B 各 2 滴, 輕 輕 搖 勻 後 觀 察 結 果, 呈 現 紅 紫 色 則 為 正 反 應 (+), 若 顏 色 無 變 化 時 加 入 少 許 鋅 粉 而 有 紅 紫 色 呈 現 時 則 為 負 反 應 (-), 否 則 亦 為 正 反 應 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.5.2.16. 山 梨 醇 發 酵 試 驗 (Sorbitol fermentation test): 鉤 菌 接 種 於 山 梨 醇 溴 甲 酚 紫 培 養 液 中, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 48±2 小 時 後, 培 養 液 由 紫 色 變 為 黃 色 者 為 正 反 應 (+); 否 則 為 負 反 應 (-), 大 部 分 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 2.4.6. 鏡 檢 : 自 2.4.5. 節 及 或 2.4.5.1.1. 節 培 養 基 斜 面 上 鉤 菌, 接 種 於 BAB 斜 面 上, 置 於 35 培 養 箱 中 培 養 24±2 小 時 後, 鉤 菌 作 革 蘭 氏 染 色 鏡 檢, 結 果 為 革 蘭 氏 染 色 陰 性, 無 芽 胞 桿 菌 者, 為 可 疑 病 原 性 大 腸 桿 菌 2.4.7. 血 清 型 別 試 驗 : 經 生 化 試 驗 及 鏡 檢 確 認 為 可 疑 病 原 性 大 腸 桿 菌 陽 性 時, 將 2.4.5. 節 之 BAB 置 於 22 培 養 箱 中, 再 繼 續 培 養 至 少 24 小 時 後, 加 入 0.5% 生 理 食 鹽 水 5 ml, 充 分 振 盪 後, 將 懸 浮 液 等 量 移 入 兩 支 已 滅 菌 之 試 管 中, 一 支 試 管 進 行 多 價 與 單 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 試 驗, 另 一 支 試 管 進 行 單 價 本 體 抗 血 清 試 驗, 其 步 驟 如 下 : 15

2.4.7.1. 多 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 試 驗 (Polyvalent OK type antisera test): 利 用 蠟 筆 在 載 玻 片 上 畫 成 兩 部 份 大 小 約 1 2 cm, 一 邊 滴 入 一 滴 多 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 及 數 滴 0.5% 生 理 食 鹽 水, 混 合 均 勻 後, 另 一 邊 滴 入 數 滴 0.5% 生 理 食 鹽 水, 作 為 對 照 組, 再 各 取 一 白 金 耳 量 懸 浮 液, 分 別 塗 抹 於 載 玻 片 上 之 兩 部 份 內, 反 覆 傾 斜 3 分 鐘, 使 混 合 均 勻 後 觀 察 結 果 正 反 應 者 則 有 凝 集 現 象, 對 照 組 則 無, 負 反 應 者 則 為 無 凝 集 現 象, 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 凝 集 反 應 可 能 很 緩 慢 或 很 微 弱, 血 清 學 試 驗 呈 負 反 應 時, 可 將 細 菌 懸 浮 液 以 100 加 熱 15 分 鐘 破 壞 菌 體 之 莢 膜 組 織 後, 再 作 一 次 凝 集 試 驗 2.4.7.2. 單 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 試 驗 (Monovalent OK type antisera test): 取 2.4.6.1. 節 細 菌 懸 浮 液, 利 用 各 單 價 本 體 莢 膜 抗 血 清 代 替 多 價 本 體 莢 膜 抗 血 清, 依 2.4.6.1. 進 行 試 驗 及 觀 察, 正 反 應 者 應 呈 凝 集 現 象, 對 照 組 則 無 ; 負 反 應 者 則 無 凝 集 現 象, 且 對 照 組 亦 無, 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 凝 集 反 應 可 能 很 緩 慢 或 很 微 弱, 血 清 學 試 驗 呈 負 反 應 時, 可 將 細 菌 懸 浮 液 以 100 加 熱 15 分 鐘 破 壞 菌 體 之 莢 膜 組 織 後, 再 作 一 次 凝 集 試 驗 2.4.7.3. 單 價 本 體 抗 血 清 試 驗 (Monovalent O type antisera test) : 取 2.4.6. 節 另 一 支 試 管 中 之 細 菌 懸 浮 液, 利 用 各 單 價 本 體 抗 血 清 代 替 多 價 本 體 莢 膜 抗 血 清, 依 2.4.6.1. 節 進 行 試 驗 及 觀 察 正 反 應 者 呈 凝 集 現 象, 但 對 照 組 則 無 ; 負 反 應 者 則 兩 組 均 無 凝 集 現 象, 病 原 性 大 腸 桿 菌 為 正 反 應 大 部 分 凝 集 反 應 很 緩 慢 且 很 微 弱, 血 清 學 試 驗 呈 負 反 應 時, 可 將 細 菌 懸 浮 液 以 100 加 熱 1 小 時, 再 作 一 次 凝 集 試 驗 2.5. 判 定 : 2.5.1. 病 原 性 大 腸 桿 菌 陽 性 者 應 符 合 第 2.4.5. 節 2.4.6. 節 及 2.4.7. 節 之 反 應 結 果 2.5.2. 平 板 計 數 : 計 數 2.4.1. 節 馬 康 奇 ( 洋 菜 ) 培 養 基 之 可 疑 菌 落, 乘 以 判 定 病 原 性 大 腸 桿 菌 陽 性 之 比 率 2.6. 如 使 用 經 確 效 認 可 之 市 售 培 養 基 生 化 檢 測 套 組 或 鑑 定 系 統, 其 檢 驗 結 果 有 爭 議 時, 以 本 檢 驗 方 法 為 準 16

第 二 部 份 : 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 PCR 檢 測 1. 適 用 範 圍 : 本 方 法 適 用 於 病 原 性 大 腸 桿 菌 致 病 基 因 鑑 別 2. 檢 驗 方 法 : 檢 體 之 增 菌 液 或 經 分 離 純 化 後 之 菌 株, 經 DNA 萃 取 後, 以 聚 合 酶 鏈 反 應 (polymerase chain reaction, PCR) 鑑 別 致 病 基 因 之 方 法 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 需 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好 檢 體 前 處 理 檢 體 DNA 抽 取 PCR 試 劑 配 製 及 PCR 等 檢 驗 過 程 皆 需 有 區 隔 空 間, 避 免 交 叉 污 染 PCR 試 劑 之 配 製 應 於 生 物 安 全 操 作 櫃 內 進 行 2.2. 裝 置 ( 註 1) : 2.2.1. 聚 合 酶 鏈 反 應 器 :GeneAmp PCR System 9700, 或 同 級 品 2.2.2. 高 壓 滅 菌 釜 2.2.3. 真 空 乾 燥 裝 置 : 供 DNA 乾 燥 用 2.2.4. 生 物 安 全 操 作 櫃 (Biological safety cabinet, BSC): 第 二 等 級 (class II)( 含 ) 以 上 者 2.2.5. 加 熱 振 盪 器 : 具 55 溫 控 及 振 盪 功 能 2.2.6. 微 量 冷 凍 離 心 機 (Micro refrigerated centrifuge): 可 達 20000 g, 並 具 4 溫 控 功 能 2.2.7. 離 心 機 : 供 各 式 微 量 離 心 管 離 心 用 2.2.8. 分 光 光 度 計 : 具 波 長 260 nm 280 nm 2.2.9. 冷 凍 設 備 : 具 冷 藏 及 凍 結 (-20 C) 功 能 2.2.10. 旋 渦 混 合 器 (Vortex mixer) 2.2.11. 電 泳 槽 : 供 DNA 電 泳 用 2.2.12. 照 相 裝 置 : 供 拍 攝 電 泳 膠 片 用 2.2.13. 紫 外 燈 箱 : 具 波 長 302 nm 365 nm 紫 外 燈 2.2.14. 酸 鹼 度 測 定 儀 (ph meter) 2.2.15. 天 平 : 最 大 稱 重 量 為 2000 g, 靈 敏 度 為 0.1 g; 最 大 稱 重 量 為 100 g, 靈 敏 度 為 1 mg 註 1: 本 方 法 所 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 不 代 表 為 同 類 產 品 中 最 好 者 ; 反 之, 未 使 用 或 未 提 及 之 產 品 品 牌 亦 不 代 表 為 同 類 產 品 中 較 差 者 2.3. 試 藥 : 2.3.1. DNA 抽 取 用 : 適 用 於 革 蘭 氏 陰 性 細 菌 DNA 抽 取 之 市 售 套 組 2.3.2. PCR 用 ( 註 2) : 17

2.3.2.1. 鑑 別 試 驗 用 引 子 : 2.3.2.1.1. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) 致 病 基 因 2.3.2.1.1.1. 標 的 基 因 :stx1 引 子 F:LP30 5' - CAG TTA ATG TGG TGG CGA AGG - 3' 引 子 R:LP31 5' - CAC CAG ACA ATG TAA CCG CTG - 3' PCR 增 幅 產 物 大 小 348 bp 2.3.2.1.1.2. 標 的 基 因 :stx2 引 子 F:LP43 5' - ATC CTA TTC CCG GGA GTT TAC G - 3' 引 子 R:LP44 5' - GCG TCA TCG TAT ACA CAG GAG C - 3' PCR 增 幅 產 物 大 小 584 bp 2.3.2.1.2. Enterotoxigenic E. coli (ETEC) 致 病 基 因 2.3.2.1.2.1. 標 的 基 因 :sth 引 子 F:STIb 1 5' - CCC TCA GGA TGC TAA ACC AG - 3' 引 子 R:STIb 2 5' - TTA ATA GCA CCC GGT ACA AGC - 3' PCR 增 幅 產 物 大 小 166 bp 2.3.2.1.2.2. 標 的 基 因 :stp 引 子 F:STIa 1 5' - TCT GTA TTA TCT TTC CCC TC - 3' 引 子 R:STIa 2, 5' - ATA ACA TCC AGC ACA GGC - 3' PCR 增 幅 產 物 大 小 186 bp 2.3.2.1.2.3. 標 的 基 因 :lth, ltp 引 子 F:LT-1 5' - AGC AGG TTT CCC ACC GGA TCA CCA - 3' 引 子 R:LT-2 5' - GTG CTC AGA TTC TGG GTC TC- 3' PCR 增 幅 產 物 大 小 132 bp 2.3.2.1.3. Enteropathogenic E. coli (EPEC) 致 病 基 因 標 的 基 因 :bfpa 引 子 F:EP1 5' - AAT GGT GCT TGC GCT TGC TGC - 3' 引 子 R:EP2 5' - GCC GCT TTA TCC AAC CTG GTA - 3' 18

PCR 增 幅 產 物 大 小 326 bp 2.3.2.1.4. Enteroinvasive E. coli (EIEC) 致 病 基 因 標 的 基 因 :inve 引 子 F:I-1 5' - ATA TCT CTA TTT CCA ATC GCG T - 3' 引 子 R:I-5 5' - GAT GGC GAG AAA TTA TAT CCC G - 3' PCR 增 幅 產 物 大 小 382 bp 2.3.2.2. 去 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 (Deoxyribonucleoside triphosphate, dntp) 溶 液 含 去 氧 腺 苷 三 磷 酸 (deoxyadenosine triphosphate, datp) 去 氧 胞 苷 三 磷 酸 (deoxycytidine triphosphate, dctp) 去 氧 鳥 糞 嘌 呤 苷 三 磷 酸 (deoxyguanosine triphosphate, dgtp) 及 去 氧 胸 苷 三 磷 酸 (deoxythymidine triphosphate, dttp) 各 2.5 mm 之 溶 液 2.3.2.3. 聚 合 酶 Taq DNA polymerase (2 U/µL), 內 附 10 倍 含 15 mm 氯 化 鎂 之 PCR 緩 衝 溶 液, 或 同 級 品 註 2: 合 成 之 引 子 及 探 針, 拆 封 後, 以 無 菌 去 離 子 水 稀 釋 成 適 當 濃 度, 分 裝 後 置 於 -20 貯 存 備 用 2.3.3. 電 泳 用 : 溴 化 乙 錠 (ethidium bromide) 溴 酚 藍 (bromophenol blue) 二 甲 苯 藍 (xylene cyanol FF) 乙 二 胺 四 乙 酸 二 鈉 (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, Na 2 -EDTA) 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 (tris(hydroxymethyl)aminomethane, Tris) 氫 氧 化 鈉 及 硼 酸 採 試 藥 級 瓊 膠 (agarose) 及 甘 油 採 分 子 生 物 分 析 級 試 藥 DNA 分 子 量 標 記 物 質 (DNA molecular weight marker):100 bp DNA ladder marker 2.3.4. 對 照 用 物 質 : 病 原 性 大 腸 桿 菌 標 準 菌 株 或 其 DNA ( 註 2.4. 器 具 及 材 料 3) : 2.4.1. 微 量 吸 管 (Micropipette):10 μl 20 μl 200 μl 及 1000 μl 2.4.2. 吸 管 尖 頭 (Micropipette tip): 可 滅 菌 10 µl 20 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.3. 離 心 管 :200 µl 600 µl 1.5 ml 及 2 ml 2.4.4. PCR 反 應 管 :200 µl 2.4.5. PCR 反 應 盤 : 具 96 個 反 應 孔, 適 用 於 GeneAmp PCR System 9700 2.4.6. 電 泳 膠 片 製 作 盤 2.4.7. 玻 璃 或 塑 膠 瓶 :50 ml 100 ml 250 ml 500 ml 1000 ml 19

及 2000 ml 註 3: 使 用 之 塑 膠 或 玻 璃 器 皿 均 為 無 DNase 污 染 2.5. 試 劑 之 配 製 : 2.5.1. 0.5M 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA) 溶 液 : 稱 取 乙 二 胺 四 乙 酸 二 鈉 186.1 g, 加 去 離 子 水 800 ml 溶 解, 再 加 入 氫 氧 化 鈉 20 g 以 調 整 ph 值 至 8.0, 並 加 去 離 子 水 使 成 1000 ml 2.5.2. 0.5 倍 TBE (Tris-borate-EDTA) 緩 衝 溶 液 : 稱 取 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 54 g 及 硼 酸 27.5 g, 加 入 0.5M EDTA 溶 液 20 ml, 再 加 水 溶 解 使 成 1000 ml, 供 作 5 倍 TBE 緩 衝 溶 液, 或 使 用 市 售 5 倍 TBE 緩 衝 溶 液 臨 用 時 以 去 離 子 水 將 5 倍 TBE 緩 衝 溶 液 稀 釋 為 0.5 倍, 作 為 0.5 倍 TBE 緩 衝 溶 液 2.5.3. 2% 膠 片 : 稱 取 瓊 膠 2 g, 加 入 0.5 倍 TBE 緩 衝 溶 液 100 ml, 加 熱 攪 拌 至 瓊 膠 完 全 溶 解, 適 當 冷 卻 後, 倒 入 電 泳 膠 片 製 作 盤, 並 置 入 適 當 之 尺 梳, 待 膠 片 凝 固 後, 即 可 使 用 2.5.4. 6 倍 載 入 膠 片 緩 衝 溶 液 (6 gel loading buffer): 稱 取 溴 酚 藍 25 g 及 二 甲 苯 藍 0.25 g, 加 入 甘 油 30 ml, 再 加 入 無 菌 去 離 子 水 使 成 100 ml, 置 於 4 冰 箱 貯 存 備 用 2.5.5. 膠 片 染 液 : 稱 取 溴 化 乙 錠 0.1 g, 加 水 10 ml 溶 解, 供 作 原 液 (10 mg/ml), 使 用 前 以 水 稀 釋 成 1 µg/ml 溴 化 乙 錠 為 致 癌 物 質, 配 製 時 應 注 意 安 全 2.5.6. PCR 溶 液 ( 註 4) : 10 倍 含 15 mm 氯 化 鎂 之 PCR 緩 衝 溶 液... 5.0 µl Taq DNA polymerase (2 U/µL)... 2.0 µl 2.5 mm dntp... 8.0 µl 10 µm 引 子 F... 2.0 µl 10 µm 引 子 R... 2.0 µl 檢 體 DNA 溶 液... 1.0 µl 無 菌 去 離 子 水... 30.0 µl 總 體 積... 50.0 µl 註 4:PCR 溶 液 應 置 於 冰 浴 中 配 製 2.6. 檢 體 DNA 溶 液 之 製 備 : 2.6.1. 檢 體 增 菌 液 之 DNA 溶 液 製 備 : 自 第 一 部 2.4. 節 檢 體 增 菌 液 或 分 離 菌 株 取 1 ml 菌 液, 置 入 20

已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管 中, 以 15000 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液 2.6.1.1. 直 接 煮 沸 法 : 將 沉 澱 物 懸 浮 於 無 菌 生 理 食 鹽 水 1 ml, 再 以 15000 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液 重 複 一 次 續 將 將 沉 澱 物 續 懸 浮 於 無 菌 去 離 子 水 中, 置 入 加 熱 振 盪 器 煮 沸 10 分 鐘, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 於 -20 冷 凍 保 存 2.6.1.2. 抽 取 DNA 法 : 採 用 適 用 於 革 蘭 氏 陰 性 細 菌 DNA 抽 取 之 市 售 套 組, 依 套 組 操 作 說 明 步 驟 抽 取 DNA 抽 取 之 DNA 溶 液 收 集 至 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 於 -20 冷 凍 保 存 2.6.2. 病 原 性 大 腸 桿 菌 分 離 菌 株 之 DNA 溶 液 製 備 : 自 培 養 基 上 鈎 取 一 接 種 環 的 菌 量, 置 入 含 有 1 ml 無 菌 去 離 子 水 之 已 滅 菌 1.5 ml 離 心 管 中, 振 盪 混 合 均 勻, 以 15000 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液 依 2.6.1.1. 節 或 2.6.1.2. 節 進 行 檢 體 DNA 原 液 之 製 備 2.6.3. DNA 濃 度 測 定 及 純 度 判 斷 : 取 適 量 之 檢 體 DNA 原 液, 以 無 菌 去 離 子 水 做 適 當 倍 數 之 稀 釋, 分 別 測 定 260 nm 及 280 nm 之 吸 光 值 (O.D.) 以 波 長 260 nm 吸 光 值 乘 50 ng/µl 及 稀 釋 倍 數, 即 為 檢 體 DNA 原 液 濃 度 DNA 溶 液 純 度 則 以 O.D. 260 /O.D. 280 比 值 作 判 斷, 其 比 值 應 介 於 1.7~2.0 2.7. 鑑 別 試 驗 ( 註 5) : 2.7.1. PCR 操 作 步 驟 : 以 無 菌 去 離 子 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 原 液 及 引 子 備 用 取 PCR 反 應 管, 依 照 2.5.6. 節 配 製 PCR 溶 液, 依 序 加 入 無 菌 去 離 子 水 10 倍 PCR 緩 衝 溶 液 dntp 引 子 DNA polymerase 及 檢 體 DNA 溶 液, 混 合 均 勻 後, 將 反 應 管 置 於 離 心 機 瞬 間 離 心, 使 混 合 液 聚 積 於 反 應 管 之 底 部 移 入 PCR 反 應 器, 依 2.7.2. 節 設 定 反 應 條 件, 進 行 反 應, 結 束 後, 取 出 PCR 增 幅 產 物, 進 行 電 泳 分 析 2.7.2. PCR 條 件 : 步 驟 溫 度 時 間 1. 最 初 變 性 95 3 min 2. 變 性 94 1 min 21

( 註 6) 3. 黏 接 55 1 min 4. 延 展 72 1 min 步 驟 2 至 步 驟 4, 共 進 行 35 個 循 環 反 應 5. 最 終 延 展 72 5 min 註 5:EHEC 及 EPEC 致 病 基 因 鑑 別 溫 度 為 56 2.7.3. 膠 片 電 泳 分 析 : 取 適 量 之 6 倍 載 入 膠 片 緩 衝 溶 液, 分 別 與 無 菌 去 離 子 水 ( 空 白 組 ) 及 PCR 增 幅 產 物 混 合 均 勻, 注 入 2% 膠 片 孔 中, 以 50 或 100 伏 特 電 壓 進 行 電 泳 同 時 另 取 DNA 分 子 量 標 記 物 質 進 行 電 泳, 作 為 PCR 增 幅 產 物 大 小 之 判 別 與 計 算 依 據 電 泳 後 之 膠 片 置 入 膠 片 染 液 中 進 行 染 色 約 15 分 鐘, 置 入 水 中 漂 洗 及 褪 染, 再 以 紫 外 光 照 射 觀 察 是 否 有 明 顯 之 DNA 螢 光 帶, 並 判 讀 結 果 同 時 另 測 試 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 2.7.4. 鑑 別 : 檢 體 DNA 溶 液 之 PCR 增 幅 產 物 電 泳 結 果, 與 正 反 應 對 照 組 及 DNA 分 子 量 標 記 物 質 之 電 泳 結 果 進 行 相 互 比 對, 當 檢 體 DNA 溶 液 DNA 模 版 與 正 反 應 對 照 組 DNA 均 出 現 PCR 增 幅 產 物, 經 由 DNA 分 子 量 標 記 物 質 估 算 PCR 增 幅 產 物 大 小 於 EHEC 為 348 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 stx1 致 病 基 因 ;PCR 增 幅 產 物 大 小 於 EHEC 為 584 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 stx2 致 病 基 因 ;PCR 增 幅 產 物 大 小 於 ETEC 為 166 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 sth 致 病 基 因 ;PCR 增 幅 產 物 大 小 於 ETEC 為 186 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 stp 致 病 基 因 ;PCR 增 幅 產 物 大 小 於 ETEC 為 132 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 lth, ltp 致 病 基 因 ;PCR 增 幅 產 物 大 小 於 EPEC 為 326 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 bfpa 致 病 基 因 ;PCR 增 幅 產 物 大 小 於 EIEC 為 382 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 inve 致 病 基 因 註 6: 本 PCR 反 應 條 件 係 採 GeneAmp PCR System 9700 設 定 之, 當 使 用 其 他 機 型 時, 應 自 行 探 討 反 應 條 件 附 註 : 第 二 部 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 PCR 檢 測 可 視 需 要 執 行 22

第 三 部 : 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 real-time PCR 檢 測 1. 適 用 範 圍 : 本 方 法 適 用 於 病 原 性 大 腸 桿 菌 致 病 基 因 鑑 別 2. 檢 驗 方 法 : 檢 體 之 增 菌 液 或 經 分 離 純 化 後 之 菌 株, 經 DNA 萃 取 後, 以 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 鑑 別 致 病 基 因 之 方 法 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 需 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好 檢 體 前 處 理 檢 體 DNA 抽 取 real-time PCR 試 劑 配 製 及 real-time PCR 等 檢 驗 過 程 皆 需 有 區 隔 空 間, 避 免 交 叉 污 染 Real-time PCR 試 劑 之 配 製 應 於 生 物 安 全 操 作 櫃 內 進 行 ( 註 1) 2.2. 裝 置 2.2.1. 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器 :Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, 或 同 級 品 2.2.2. 高 壓 滅 菌 釜 2.2.3. 生 物 安 全 操 作 櫃 (Biological safety cabinet, BSC): 第 二 等 級 (class II) ( 含 ) 以 上 者 2.2.4. 加 熱 振 盪 器 : 具 溫 控 及 振 盪 功 能 2.2.5. 微 量 冷 凍 離 心 機 (Micro refrigerated centrifuge): 可 達 20000 g, 並 具 4 溫 控 功 能 2.2.6. 離 心 機 : 供 各 式 微 量 離 心 管 離 心 用 2.2.7. 分 光 光 度 計 : 具 波 長 260 nm 280 nm 2.2.8. 冷 凍 設 備 : 具 冷 藏 及 凍 結 (-20 C) 功 能 2.2.9. 旋 渦 混 合 器 (Vortex mixer) 2.2.10. 酸 鹼 度 測 定 儀 (ph meter) 2.2.11. 天 平 : 最 大 稱 重 量 為 2000 g, 靈 敏 度 為 0.1 g; 最 大 稱 重 量 為 100 g, 靈 敏 度 為 1 mg 註 1: 本 方 法 所 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 不 代 表 為 同 類 產 品 中 最 好 者 ; 反 之, 未 使 用 或 未 提 及 之 產 品 品 牌 亦 不 代 表 為 同 類 產 品 中 較 差 者 2.3. 試 藥 2.3.1. DNA 抽 取 用 : 適 用 於 革 蘭 氏 陰 性 細 菌 DNA 抽 取 之 市 售 23

套 組 ( 註 2) 2.3.2. Real-time PCR 用 2.3.2.1. 鑑 別 試 驗 用 引 子 及 探 針 2.3.2.1.1. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) 致 病 基 因 2.3.2.1.1.1. 標 的 基 因 :stx1 引 子 F:Stx1F934 5 - GTG GCA TTA ATA CTG AAT TGT CA TCA -3 引 子 R:Stx1R1042 5 - GCG TAA TCC CAC GGA CTC TTC -3 探 針 P:Stx1P990 5 - (6FAM) TGA TGA GTT TCC TTC TAT GTG TCC GGC AGA T - (BHQ1)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 109 bp 2.3.2.1.1.2. 標 的 基 因 :stx2 引 子 F:Stx2F1218 5 - GAT GTT TAT GGC GGT TTT ATT TGC -3 引 子 R:Stx2R1300 5 - TGG AAA ACT CAA TTT TAC CTT TAG CA -3 探 針 P(Stx2P1249): 5 - (6FAM) - TCT GTT AAT GCA ATG GCG GCG GAT T - (BHQ1)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 83 bp 2.3.2.1.2. Enterotoxigenic E. coli (ETEC) 致 病 基 因 2.3.2.1.2.1. 標 的 基 因 :lt 引 子 F:LT1F 5 - AGC AGG TTT CCC ACC GGA TCA CCA -3 引 子 R:LT2R 5 - GTC CTC AGA TTC TGG GTC TC -3 探 針 P:LTP2 5 - (6FAM) - AAG AAC CCT GGA TTC ATC ATG CAC CAC AAG - (BHQ1) - 3 PCR 增 幅 產 物 大 小 132 bp 24

2.3.2.1.2.2. 標 的 基 因 :st 引 子 F:STaF 101 年 11 月 19 日 署 授 食 字 第 1011902814 號 公 告 5 - GCT AAT GTT GGC AAT TTT TAT TTC TGT A -3 引 子 R:STaR 5 - AGG ATT ACA ACA AAG TTC ACA GCA GTA A -3 探 針 P:STaP3 5 - (6FAM) - CTT TCC CCT CTT TTA GTC AGT CAA CTG AAT CAC TT - (BHQ1) -3 PCR 增 幅 產 物 大 小 190 bp 2.3.2.1.3. Enteropathogenic E. coli (EPEC) 致 病 基 因 標 的 基 因 :eaea ( 註 3) 引 子 F:EaeF2 5 - CAT TGA TCA GGA TTT TTC TGG TGA TA -3 引 子 R:EaeR 5 - CTC ATG CGG AAA TAG CCG TTA -3 探 針 P:EaeP3 5 - (6FAM) - AGG TAT TGG TGG CGA ATA CTG GCG AGA CTA - (BHQ1) -3 PCR 增 幅 產 物 大 小 106 bp 2.3.2.1.4. Enteroinvasive E. coli (EIEC) 致 病 基 因 標 的 基 因 :inve 引 子 F:I1F 5 - ATA TCT CTA TTT CCA ATC GCG T -3 引 子 R:I5R 5 - GAT GGC GAG AAA TTC TAT CCC G -3 探 針 P:invEP5 5 - (6FAM) - AAA GAC CTT GAT ACA AAT TTG CCC CCG GAC A - (BHQ1) -3 PCR 增 幅 產 物 大 小 382 bp 註 2: 合 成 之 引 子 及 探 針, 拆 封 後, 以 無 菌 去 離 子 水 稀 釋 成 適 當 濃 度, 分 裝 後 置 於 -20 貯 存 備 用, 另 探 針 需 避 光 保 存, 探 針 5 端 採 用 6-carboxy-fluorescein (FAM) 標 記,3 端 25

採 用 Black Hole Quencher-1 (BHQ1) 標 記 註 3:EHEC 及 EPEC 皆 帶 有 eaea 基 因, 故 鑑 別 時 再 以 stx1 及 stx2 基 因 區 分 EHEC 及 EPEC 2.3.2.2. TaqMan Fast Reagents Starter Kit ( 適 用 於 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System), 本 試 劑 內 含 real-time PCR 所 需 去 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 聚 合 酶 等, 使 用 時 添 加 引 子 探 針 及 待 測 檢 體 DNA 2.3.3. 對 照 用 物 質 : 各 類 別 病 原 性 大 腸 桿 菌 標 準 菌 株 或 其 DNA ( 註 4) 2.4. 器 具 及 材 料 2.4.1. 微 量 吸 管 (Micropipette):10 µl 20 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.2. 吸 管 尖 頭 (Pipette tip): 可 滅 菌 10 µl 20 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.3. 離 心 管 :200 µl 600 µl 1.5 ml 及 2 ml 2.4.4. Real-time PCR 反 應 管 :100 µl 2.4.5. Real-time PCR 反 應 盤 : 具 96 個 反 應 孔, 適 用 於 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 2.4.6. 玻 璃 或 塑 膠 瓶 :50 ml 100 ml 250 ml 500 ml 1000 ml 及 2000 ml 註 4: 使 用 之 塑 膠 或 玻 璃 器 皿 均 為 無 DNase 污 染 ( 註 5) 2.5 Real-time PCR 溶 液 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 鑑 別 試 驗 用 5 µm 引 子 F... 2.0 µl 5 µm 引 子 R... 2.0 µl 5 µm 探 針... 1.0 µl TaqMan Fast Reagents Starter Kit... 12.5 µl 檢 體 DNA 溶 液... 2.0 µl 無 菌 去 離 子 水... 5.5 µl 總 體 積... 25.0 µl 註 4:Real-time PCR 溶 液 應 置 於 冰 浴 中 配 製 2.6 檢 體 DNA 溶 液 之 製 備 2.6.1. 檢 體 增 菌 液 之 DNA 溶 液 製 備 自 第 一 部 2.4.1. 節 增 菌 液 中 吸 取 菌 液 1 ml, 置 入 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管 中, 以 15000 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液 26

2.6.1.1. 直 接 煮 沸 法 將 沉 澱 物 加 入 無 菌 去 離 子 水 1 ml, 震 盪 混 合 均 勻, 以 15000 g 離 心 3 分 鐘, 去 除 上 清 液, 重 複 操 作 一 次 續 將 沉 澱 物 加 入 無 菌 去 離 子 水 1 ml, 震 盪 混 合 均 勻, 置 入 加 熱 振 盪 器 中 煮 沸 10 分 鐘, 取 出 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 置 於 -20 冷 凍 保 存 2.6.1.2. 抽 取 DNA 法 採 用 適 用 於 革 蘭 氏 陰 性 細 菌 DNA 抽 取 之 市 售 套 組, 依 套 組 操 作 說 明 步 驟 抽 取 DNA 抽 取 之 DNA 溶 液 收 集 至 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 置 於 -20 冷 凍 保 存 2.6.2. 分 離 菌 株 之 DNA 溶 液 製 備 取 一 接 種 環 之 分 離 菌 株, 置 入 含 有 無 菌 去 離 子 水 1 ml 之 已 滅 菌 1.5 ml 離 心 管 中, 震 盪 混 合 均 勻, 煮 沸 10 分 鐘, 取 出 離 心 管, 待 冷 卻 後 以 15000 g 離 心 3 分 鐘, 吸 取 上 清 液 至 另 一 已 滅 菌 1.5 ml 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液, 置 於 -20 冷 凍 保 存 亦 可 依 2.6.1.2. 節 進 行 檢 體 DNA 原 液 之 製 備 2.6.3. DNA 濃 度 測 定 及 純 度 判 斷 取 適 量 之 檢 體 DNA 原 液, 以 無 菌 去 離 子 水 做 適 當 倍 數 之 稀 釋, 分 別 測 定 260 nm 及 280 nm 之 吸 光 值 (O.D.) 以 波 長 260 nm 吸 光 值 乘 50 ng/µl 及 稀 釋 倍 數, 即 為 檢 體 DNA 原 液 濃 度 DNA 溶 液 純 度 則 以 O.D. 260 /O.D. 280 比 值 作 判 斷, 其 比 值 應 介 於 1.7~2.0 2.7. 鑑 別 試 驗 ( 註 5) 2.7.1. Real-time PCR 操 作 步 驟 以 無 菌 去 離 子 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 原 液 引 子 及 探 針 備 用 取 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 依 照 2.5. 節 配 製 real-time PCR 溶 液, 依 序 加 入 TaqMan Fast Reagents Starter Kit 稀 釋 過 之 引 子 及 探 針, 混 合 均 勻 後, 分 裝 23 µl 入 real-time PCR 反 應 盤 的 反 應 孔 中, 各 別 加 入 檢 體 DNA 溶 液 2 µl, 再 將 real-time PCR 反 應 盤 置 於 離 心 機 中, 以 200 g 瞬 間 離 心, 移 入 real-time PCR 反 應 器, 依 下 列 條 件 進 行 反 應 同 時 另 27

製 作 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 101 年 11 月 19 日 署 授 食 字 第 1011902814 號 公 告 病 原 性 大 腸 桿 菌 致 病 基 因 反 應 條 件 步 驟 溫 度 時 間 1. 熱 活 化 95 C 2 min 2. 最 初 變 性 95 C 15 sec 3. 黏 接 延 展 60 C 30 sec 步 驟 2 至 步 驟 3, 共 進 行 40 個 循 環 反 應 2.7.2. Real-time PCR 螢 光 分 析 檢 體 DNA 經 real-time PCR 反 應 後, 直 接 從 real-time PCR 反 應 器 上 之 螢 幕 觀 察 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 可 判 讀 反 應 結 果 同 時 另 測 試 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 2.7.3. 確 認 檢 體 DNA 之 real-time PCR 增 幅 產 物 螢 光 分 析 圖 與 正 反 應 對 照 組 螢 光 分 析 圖 進 行 相 互 比 對, 當 檢 體 DNA 與 正 反 應 對 照 組 之 real-time PCR 螢 光 分 析 圖 均 出 現 經 由 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 確 認 該 real-time PCR 增 幅 產 物 為 病 原 性 大 腸 桿 菌 致 病 基 因 之 基 因 片 段, 可 確 認 該 檢 體 中 含 有 病 原 性 大 腸 桿 菌 致 病 基 因 註 5: 本 PCR 反 應 條 件 係 採 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 設 定 之, 當 使 用 其 他 機 型 時, 應 自 行 探 討 反 應 條 件 附 註 : 第 三 部 病 原 性 大 腸 桿 菌 之 real-time PCR 檢 測 可 視 需 要 執 行 28

檢 驗 流 程 圖 檢 體 25 g 增 菌 培 養 平 板 計 數 法 加 BHI 225 ml 室 溫 振 盪 培 養 10 min 室 溫 靜 置 10 min 後, BHI 倒 入 另 一 容 器 35 培 養 3 hr 加 入 等 量 之 雙 倍 TP 44 培 養 20 hr 取 1 loop, 劃 線 於 L-EMB 及 MacConkey 加 PBS/BPBW 225 ml, 10 倍 稀 釋 後, 連 續 稀 釋 10 ml 90 ml 各 稀 釋 液 塗 抹 於 MacConkey 35 培 養 20 hr 35 培 養 20 hr 挑 可 疑 菌 落 鑑 別 傳 統 生 化 試 驗 或 市 售 生 化 檢 測 套 組 鑑 定 系 統 大 腸 桿 菌 陽 性 註 致 病 基 因 鑑 別 血 清 學 試 驗 確 認 型 別 計 算 菌 數 註 : 可 依 檢 體 含 菌 量 情 況 自 行 探 討 接 續 PCR 或 real-time PCR 之 步 驟 及 增 菌 時 間, 以 達 快 速 鑑 別 目 的 29