农 业 微 生 物 学 实 验 指 导 北 京 农 学 院 食 品 科 学 系 授 课 教 师 刘 一 倩 高 秀 芝 2006 年 3 月
实 验 1 显 微 镜 的 使 用 及 细 菌 形 态 的 观 察 1 目 的 要 求 (1) 了 解 普 通 光 学 显 微 镜 的 构 造, 各 部 分 的 功 能 和 使 用 方 法 (2) 学 习 并 掌 握 油 镜 的 原 理 和 使 用 方 法, 熟 悉 几 种 常 见 微 生 物 的 基 本 形 态 2 普 通 光 学 显 微 镜 的 构 造 与 油 镜 的 工 作 原 理 2.1 普 通 光 学 显 微 镜 的 构 造 显 微 镜 的 构 造 可 分 为 机 械 装 置 和 光 学 系 统 两 大 部 分 机 械 装 置 包 括 镜 座 镜 筒 镜 臂 物 镜 转 换 器 载 物 台 推 进 器 粗 调 螺 旋 微 调 螺 旋 光 圈 等 部 件 ; 光 学 系 统 由 接 目 镜 接 物 镜 聚 光 器 反 光 镜 等 组 成 ( 图 1-1) (1) 镜 座 镜 座 是 显 微 镜 底 座, 用 以 支 撑 全 镜, 呈 长 方 形 其 上 装 有 电 源 开 关 照 明 光 源 保 险 丝 光 源 滑 动 变 阻 器 等 (2) 镜 筒 镜 筒 上 连 接 目 镜 下 连 接 转 换 器, 光 线 从 筒 中 通 过 安 装 目 镜 的 镜 筒 分 为 可 调 式 的 单 筒 和 固 定 式 的 双 筒 两 种 从 镜 筒 上 缘 到 物 镜 转 换 器 螺 旋 口 之 间 的 距 离 称 为 筒 长 国 际 上 将 显 微 镜 的 标 准 筒 长 定 为 160mm, 此 数 字 标 在 物 镜 的 外 壳 上 (3) 镜 臂 连 接 镜 筒 和 镜 座 有 的 镜 臂 是 固 定 的, 有 的 可 向 后 方 倾 斜, 其 作 用 是 支 撑 镜 筒 载 物 台 聚 光 器 和 调 焦 装 置 等 (4) 物 镜 转 换 器 转 换 器 上 可 安 装 3~5 个 物 镜, 一 般 是 3 个 物 镜 ( 低 倍 镜 高 倍 镜 油 镜 ) 转 动 转 换 器 时, 可 以 按 需 要 调 换 各 种 物 镜, 将 之 推 到 使 用 位 置 上 图 1-1 光 学 显 微 镜 构 造 示 意 图 1. 物 镜 转 换 器 ;2. 物 镜 ;3. 游 标 卡 尺 ;4. 载 物 台 ; (5) 载 物 台 载 物 台 呈 长 方 形, 中 央 有 一 5. 聚 光 器 ;6. 虹 彩 光 圈 ;7. 光 源 ;8. 镜 座 ;9. 电 源 孔, 为 光 线 通 路 在 台 上 装 有 弹 簧 标 本 夹 和 推 开 关 ;10. 光 源 滑 动 变 阻 器 ;11. 粗 调 螺 旋 ;12. 微 调 进 器 螺 旋 ;13. 镜 臂 ;14. 镜 筒 ;15. 目 镜 ;16. 标 本 移 动 (6) 推 进 器 推 进 器 由 一 横 一 纵 两 个 推 进 螺 旋 齿 轴 和 齿 条 构 成, 转 动 其 上 螺 旋, 可 使 标 本 片 向 前 后 左 右 移 动 研 究 型 显 微 镜 的 纵 横 架 杆 上 刻 有 刻 度 标 尺, 构 成 精 密 的 平 面 坐 标 系 如 需 要 重 复 观 察 已 检 查 标 本 的 某 一 物 像 时, 可 在 第 一 次 检 查 时 记 下 纵 横 标 尺 的 数 值, 下 次 按 数 值 移 动 推 进 器, 就 可 以 找 到 原 来 标 本 的 位 置 (7) 粗 调 螺 旋 粗 调 螺 旋 用 于 粗 放 调 节 物 镜 和 标 本 的 距 离 老 式 单 目 镜 显 微 镜 的 粗 调 螺 旋 向 前 扭 动, 镜 头 下 降 接 近 标 本 新 式 双 目 镜 显 微 镜 ( 如 Motic 显 微 镜 ) 镜 检 时, 双 手 向 后 扭 动 使 载 物 台 上 升, 让 标 本 接 近 物 镜, 反 之 则 下 降, 标 本 远 离 物 镜 使 用 显 微 镜 观 查 标 本 时, 主 要 使 用 粗 调 螺 旋 调 节 (8) 微 调 螺 旋 用 粗 调 螺 旋 只 能 粗 放 地 调 节 焦 距, 难 于 观 察 到 清 晰 的 物 像, 因 而 需 要 用 微 调 螺 旋 做 进 一 步 调 节 其 每 转 一 周, 镜 筒 移 动 0.1 mm 新 式 研 究 型 显 微 镜 粗 微 螺 旋 为 共 轴 式 原 则 上, 微 调 螺 旋 每 次 旋 转 不 超 过 一 周 (9) 光 圈 在 聚 光 器 下 方, 可 任 意 开 闭, 用 来 调 节 射 入 聚 光 器 光 线 强 弱
(10) 接 目 镜 目 镜 作 用 是 将 物 镜 放 大 了 的 实 像 进 行 第 二 次 放 大, 形 成 虚 像 并 映 入 眼 帘 不 同 的 目 镜 上 刻 有 5 10 15 等 字 样, 以 表 示 该 目 镜 的 放 大 倍 数 普 通 光 学 显 微 镜 常 用 的 目 镜 主 要 是 惠 更 斯 目 镜 研 究 型 显 微 镜 配 有 性 能 更 好 的 目 镜, 如 补 偿 目 镜 (K) 平 场 目 镜 (P) 和 广 视 场 目 镜 (WF) 等 照 相 时 选 用 照 相 目 镜 (NFK) (11) 接 物 镜 物 镜 安 装 于 转 换 器 上, 入 射 光 线 通 过 物 镜 时 使 被 检 物 像 形 成 第 一 次 放 大 的 实 像 普 通 显 微 镜 装 有 低 倍 镜 (10 ) 高 倍 镜 (40 ) 和 油 镜 (100 ) 三 种 消 色 差 物 镜, 外 壳 上 标 有 Ach 字 样, 通 常 与 惠 更 斯 目 镜 配 合 便 用 使 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 时, 物 镜 与 标 本 间 的 介 质 是 空 气, 称 之 为 干 燥 系 物 镜 ; 而 使 用 油 镜 时, 物 镜 与 标 本 间 的 介 质 是 香 柏 油, 称 之 为 油 浸 系 物 镜 油 镜 标 有 HI 或 Oil 字 样 及 镜 头 下 缘 刻 有 白 环 或 红 环 检 查 细 菌 标 本 要 用 油 镜 研 究 型 显 微 镜 配 有 性 能 更 好 的 物 镜, 如 复 消 色 差 物 镜 (Apo) 平 场 物 镜 (Plan) 平 场 消 色 差 物 镜 (Plan Ach) 平 场 复 消 色 差 物 镜 (Plan Apo) 等 (12) 聚 光 器 由 聚 光 透 镜 升 降 螺 旋 和 能 调 节 开 孔 大 小 的 虹 彩 光 圈 组 成, 装 在 载 物 台 下 面, 可 通 过 升 降 螺 旋 而 起 落 其 作 用 是 将 光 线 聚 光 于 标 本 之 上, 增 强 照 明 度 普 通 光 学 显 微 镜 配 置 的 都 是 明 视 场 聚 光 器, 分 为 阿 贝 聚 光 器 齐 明 聚 光 器 和 摇 出 聚 光 器 三 种 研 究 型 显 微 镜 ( 如 Motic BA400 显 微 镜 ) 配 有 性 能 更 好 的 消 色 差 摇 出 式 聚 光 器, 能 将 聚 光 器 上 透 镜 从 光 路 中 摇 出, 满 足 低 倍 物 镜 (4 ) 大 视 场 照 明 的 需 要 齐 明 聚 光 器 虽 质 量 最 好, 但 不 适 于 4 倍 以 下 的 物 镜 (13) 反 光 镜 早 期 普 通 光 学 显 微 镜 常 用 自 然 光 检 视 标 本, 在 镜 座 上 装 有 反 光 镜, 由 平 凹 两 面 镜 子 组 成 光 线 较 强 时 用 平 面 镜, 光 弱 时 用 凹 面 镜, 可 自 由 旋 转 方 向, 以 将 最 佳 光 线 反 射 入 聚 光 器 新 式 研 究 型 显 微 镜 镜 座 上 装 有 光 源, 并 由 电 流 调 节 螺 旋 来 调 节 光 照 强 度 2.2 油 镜 使 用 的 工 作 原 理 在 显 微 镜 的 光 学 系 统 中, 物 镜 的 性 能 直 接 影 响 显 微 镜 的 分 辨 率 与 其 他 物 镜 相 比, 油 镜 的 放 大 倍 数 最 大, 使 用 也 比 较 特 殊, 需 在 载 玻 片 与 镜 头 之 间 滴 加 香 柏 油, 这 主 要 有 如 下 二 方 面 的 原 因 : (1) 增 加 照 明 亮 度 油 镜 的 放 大 倍 数 虽 然 可 达 100, 但 因 焦 距 很 短, 镜 头 直 径 很 小, 进 入 镜 头 中 的 光 线 亦 较 少, 故 所 需 要 的 光 照 强 度 最 大 ( 图 1-2) 当 油 镜 头 和 标 本 玻 片 之 间 的 介 质 为 空 气 时, 因 空 气 折 射 率 (n=1.00) 与 玻 璃 的 折 射 率 (n=1.55) 不 同, 会 有 一 部 分 光 线 被 折 射 而 不 能 进 入 镜 头 内, 使 视 野 更 暗, 物 像 显 现 不 清 若 在 镜 头 与 标 本 玻 片 之 间 滴 上 与 玻 璃 的 折 射 率 相 仿 的 油 类, 如 香 柏 油 (n=1.52) 等, 则 光 线 不 发 生 折 射, 从 而 增 加 了 视 野 的 照 明 亮 度 ( 图 1-3) 图 1-2 物 镜 的 焦 距 工 作 距 离 和 虹 彩 光 圈 的 关 系
图 1-3 干 燥 系 物 镜 A 与 油 浸 系 物 镜 B 的 光 线 通 路 (2) 增 加 显 微 镜 的 分 辨 力 显 微 镜 的 分 辨 力 或 分 辨 率 是 指 显 微 镜 能 够 辨 别 两 点 之 间 最 小 距 离 的 能 力 它 与 物 镜 的 数 值 口 径 成 正 比, 与 光 波 长 度 成 反 比 因 此, 当 光 波 波 长 一 定 时, 物 镜 的 数 值 口 径 愈 大, 则 显 微 镜 的 分 辩 力 愈 大, 被 检 物 体 的 细 微 结 构 也 愈 清 晰 地 区 别 出 来 分 辨 力 可 由 下 列 公 式 表 示 : 分 辨 力 ( 最 大 可 分 辨 距 离 )=λ/2na 式 中 λ 为 光 波 波 长 (0.4~0.7 µm);na 为 物 镜 的 数 值 口 径 值 它 是 光 线 投 射 到 物 镜 上 的 最 大 角 度 ( 称 为 镜 口 角 ) 的 一 半 正 弦, 与 介 质 的 折 射 率 之 乘 积, 即 NA=n sinα 式 中 α 为 光 线 最 大 入 射 角 的 半 数, 它 取 决 于 物 镜 的 直 径 和 焦 距 在 实 际 应 用 中 光 线 入 射 角 最 大 只 能 达 到 120º, 其 半 数 的 正 弦 为 Sin60º=0.87 以 空 气 为 介 质 时,NA=1 0.87=0.87; 而 以 香 柏 油 为 介 质 时, NA=1.52 0.87=1.32, 故 以 香 柏 油 为 介 质 的 油 镜 要 比 用 空 气 为 介 质 的 高 倍 镜 分 辩 力 高, 因 而 细 菌 用 油 镜 才 可 观 察 到 然 而, 显 微 镜 的 放 大 倍 数 越 高, 并 不 等 于 其 分 辨 力 越 高 假 如 采 用 放 大 率 为 40 的 高 倍 镜 (NA=0.65) 和 放 大 率 为 24 的 目 镜, 虽 然 总 放 大 率 为 960, 但 其 分 辩 力 只 有 0.42µm; 若 采 用 放 大 率 为 90 的 油 镜 (NA=1.25) 和 放 大 率 为 9 的 目 镜, 虽 然 总 放 大 率 为 810, 但 却 能 分 辨 出 0.22µm 之 间 的 距 离, 因 而 显 微 镜 的 总 放 大 倍 数 越 高 并 不 是 其 分 辨 力 越 高 3 实 验 材 料 3.1 菌 种 细 菌 三 型 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 等 染 色 玻 片 标 本 3.2 溶 液 或 试 剂 香 柏 油 二 甲 苯 3.3 仪 器 与 其 他 用 具 显 微 镜 擦 镜 纸 等 4 普 通 光 学 显 微 镜 的 使 用 流 程 安 置 调 光 源 调 目 镜 调 聚 光 器 镜 检 ( 低 倍 镜 高 倍 镜 油 镜 ) 擦 物 镜 头 复 原 5 操 作 步 骤 5.1 观 察 前 的 准 备 5.1.1 显 微 镜 的 安 置 置 显 微 镜 于 平 整 的 实 验 台 上, 镜 座 距 实 验 台 边 缘 约 10cm 镜 检 时 姿 势 要 端 正 一 般 用 左 眼 观 察, 右 眼 绘 图 或 记 录, 两 眼 同 时 睁 开, 以 减 少 眼 睛 疲 劳 5.1.2 光 源 调 节 安 装 在 镜 座 内 的 光 源 灯 可 通 过 调 节 电 压 以 获 得 适 当 的 照 明 亮 度 反 光 镜 采 集 自 然 光 或 灯 光 作 为 照 明 光 源 时, 较 强 的 自 然 光 源 用 平 面 镜, 较 弱 的 照 明 光 源 用 凹 面 镜, 并 调 节 其 角 度, 使 视 野 内 的 亮 度 适 宜 均 匀 凡 检 查 染 色 标 本 时, 光 线 应 强 ; 检 查 未 染 色 标 本 时, 光 线 不 宜 太 强, 可 通 过 光 圈 聚 光 器 反 光 镜 调 节 适 宜 的 光 线 5.1.3 双 筒 显 微 镜 的 目 镜 调 节 根 据 使 用 者 的 个 人 情 况, 双 筒 显 微 镜 的 目 镜 间 距 可 以 适 当 调 节, 而 左 目 镜 上 一 般 还 配 有 屈 光 度 调 节 环, 可 以 适 应 眼 距 不 同 或 两 眼 视 力 有 差 异 的 不 同 观 察 者 5.1.4 聚 光 器 数 值 孔 径 值 的 调 节 正 确 使 用 聚 光 镜 才 能 提 高 镜 检 效 果 聚 光 镜 的 主 要 参 数 是
数 值 孔 径, 它 有 一 定 的 可 变 范 围, 一 般 聚 光 镜 边 框 上 的 数 字 是 代 表 它 的 最 大 数 值 孔 径, 通 过 调 节 聚 光 镜 下 面 可 变 光 阑 的 开 放 程 度, 可 以 得 到 各 种 不 同 的 数 值 孔 径, 以 适 应 不 同 物 镜 的 需 要 5.2 显 微 镜 观 察 一 般 情 况 下, 特 别 是 初 学 者, 进 行 显 微 镜 观 察 时, 应 遵 守 从 低 倍 镜 到 高 倍 镜, 再 到 油 镜 的 观 察 程 序 因 为 低 倍 数 物 镜 视 野 相 对 较 大, 易 发 现 目 标 和 确 定 检 查 的 位 置 5.2.1 低 倍 镜 观 察 将 标 本 片 置 于 载 物 台 上, 用 弹 簧 夹 固 定, 移 动 推 进 器, 使 观 察 对 象 处 于 物 镜 正 下 方 旋 动 粗 调 螺 旋, 使 物 镜 与 标 本 片 距 离 约 lcm( 单 镜 筒 显 微 镜 ) 或 0.5cm( 双 镜 筒 显 微 镜 ), 再 以 粗 螺 旋 调 节, 使 镜 头 缓 慢 升 起 ( 单 镜 筒 ), 或 使 载 物 台 缓 慢 下 降 ( 双 镜 筒 ), 直 到 物 像 出 现 后 再 用 微 螺 旋 调 节 使 物 像 清 晰 然 后 移 动 标 本 玻 片, 将 观 察 目 标 移 至 视 野 中 心 后, 仔 细 观 察 与 绘 图 5.2.2 高 倍 镜 观 察 由 低 倍 镜 直 接 转 换 成 高 倍 镜 至 正 下 方 转 换 时, 需 用 眼 睛 于 侧 面 观 察, 避 免 镜 头 与 玻 片 相 撞 调 节 聚 光 器 和 光 圈 使 视 野 亮 度 适 宜, 而 后 微 调 细 螺 旋 使 物 像 清 晰 利 用 推 进 器 移 动 标 本 找 到 需 要 观 察 的 部 位, 并 移 至 视 野 中 心 仔 细 观 察 或 准 备 用 油 镜 观 察 5.2.3 油 镜 观 察 先 将 光 圈 开 至 最 大, 集 光 器 升 至 最 高 位, 调 节 好 光 源, 使 照 明 亮 度 最 强 在 高 倍 镜 或 低 倍 镜 下 找 到 要 观 察 的 样 品 区 域 后, 用 粗 调 节 螺 旋 将 镜 筒 远 离 载 物 台, 然 后 在 标 本 上 滴 加 香 柏 油 ( 切 勿 过 多, 否 则 视 野 模 糊 ), 转 换 油 镜 头, 从 侧 面 注 视, 小 心 将 之 浸 入 油 滴 中, 使 其 几 乎 与 标 本 片 相 接 触 为 度 ( 注 意 : 切 不 可 将 油 镜 镜 头 压 到 标 本, 否 则 不 仅 压 碎 玻 片, 还 会 损 坏 镜 头 ) 用 粗 螺 旋 缓 慢 升 起 镜 筒 ( 单 镜 筒 ) 或 下 降 载 物 台 ( 双 镜 筒 ), 至 物 像 出 现 后, 再 以 细 螺 旋 调 至 物 像 清 晰 如 果 油 镜 已 离 开 油 面 而 仍 未 见 物 像, 可 再 将 镜 头 浸 入 油 中, 重 复 以 上 操 作 至 物 像 清 晰 为 止 5.3 显 微 镜 用 后 的 处 理 观 察 完 毕, 台 起 镜 头, 立 即 用 擦 镜 纸 擦 去 镜 头 上 的 油, 再 用 擦 镜 纸 蘸 取 少 许 二 甲 苯 ( 香 柏 油 溶 于 二 甲 苯 ) 或 乙 醚 乙 醇 混 合 液 擦 去 镜 头 上 的 残 留 油 迹, 最 后 再 用 擦 镜 纸 擦 去 残 留 的 二 甲 苯 严 禁 用 手 或 其 他 纸 擦 镜 头, 以 免 损 坏 镜 头 用 绸 布 清 洁 显 微 镜 的 金 属 部 件 将 各 部 分 还 原, 将 物 镜 转 成 八 字 形, 再 将 载 物 台 下 降 至 最 低, 降 下 聚 光 器, 以 免 与 物 镜 相 撞, 反 光 镜 垂 直 于 镜 座 套 上 镜 套, 放 回 柜 内 或 镜 箱 中 6 实 验 结 果 与 报 告 (1) 分 别 绘 出 用 油 镜 观 察 到 的 细 菌 的 形 态 图 注 意 观 察 它 们 的 个 体 形 态 大 小 排 列 方 式 有 芽 孢 的 细 菌, 观 察 其 菌 体 两 端 情 况 及 芽 孢 着 生 位 置 7 思 考 题 (1) 观 察 细 菌 时 为 何 使 用 油 镜? 它 与 干 燥 系 物 镜 使 用 方 法 有 何 不 同? 使 用 时 注 意 哪 些 问 题? (2) 普 通 光 学 显 微 镜 的 目 镜 与 物 镜 的 常 用 放 大 倍 数 有 几 种? 显 微 镜 的 放 大 倍 数 越 高, 分 辩 力 越 高 吗? 为 什 么? 举 例 说 明 (3) 试 列 表 比 较 低 倍 镜 高 倍 镜 及 油 镜 各 方 面 的 差 异 为 什 么 在 使 用 高 倍 镜 及 油 镜 时 应 特 别 注 意 避 免 粗 调 节 螺 旋 的 误 操 作? (4) 根 据 实 验 体 会, 谈 谈 应 如 何 根 据 所 观 察 微 生 物 的 大 小, 选 择 不 同 的 物 镜 进 行 有 效 的 观 察
实 验 2 细 菌 的 革 兰 氏 染 色 及 其 形 态 观 察 1 目 的 要 求 (1) 了 解 革 兰 氏 染 色 法 的 原 理 及 其 在 细 菌 分 类 鉴 定 中 的 重 要 性 (2) 学 习 掌 握 革 兰 氏 染 色 技 术, 进 一 步 熟 练 光 学 显 微 镜 油 镜 的 使 用 技 术 2 基 本 原 理 革 兰 氏 染 色 法 是 细 菌 学 中 最 重 要 的 鉴 别 染 色 法 根 据 细 菌 细 胞 壁 的 结 构 和 化 学 组 成 的 不 同, 经 革 兰 氏 染 色 后, 呈 现 不 同 的 染 色 反 应, 可 将 所 有 细 菌 区 分 为 两 大 类, 即 革 兰 氏 阳 性 菌 ( 用 G + 表 示 ) 和 革 兰 氏 阴 性 菌 ( 用 G - 表 示 ) 当 细 菌 用 结 晶 紫 初 染 后, 像 简 单 染 色 法 一 样, 所 有 细 菌 都 被 染 成 初 染 剂 的 蓝 紫 色 碘 作 为 媒 染 剂, 它 能 与 结 晶 紫 结 合 成 结 晶 紫 碘 的 复 合 物, 从 而 增 强 了 染 料 与 细 菌 的 结 合 力 染 色 关 键 在 于 脱 色 剂 的 脱 色 作 用 当 用 乙 醇 ( 或 丙 酮 ) 处 理 时, 两 类 细 菌 的 脱 色 效 果 是 不 同 的 G + 细 菌 的 细 胞 壁 主 要 由 肽 聚 糖 形 成 的 网 状 结 构 组 成, 壁 厚 类 脂 质 含 量 较 低, 用 乙 醇 ( 或 丙 酮 ) 脱 色 时 细 胞 壁 脱 水 使 肽 聚 糖 层 的 网 状 结 构 孔 径 缩 小, 透 性 降 低, 从 而 使 结 晶 紫 碘 的 复 合 物 不 易 被 洗 脱 而 保 留 在 细 胞 内, 经 脱 色 和 复 染 后 仍 保 留 初 染 剂 的 蓝 紫 色 G - 细 菌 则 不 同, 由 于 其 细 胞 壁 肽 聚 糖 层 较 薄 类 脂 含 量 较 高, 所 以 当 脱 色 处 理 时, 类 脂 质 被 乙 醇 ( 或 丙 酮 ) 溶 解, 细 胞 壁 通 透 性 增 大, 使 结 晶 紫 碘 的 复 合 物 比 较 容 易 被 洗 脱 出 来, 用 复 染 剂 复 染 后, 细 胞 被 染 上 复 染 剂 的 红 色 3 实 验 材 料 3.1 菌 种 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) 约 24h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物, 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) 或 蜡 样 芽 孢 杆 菌 (Bacillus cereus) 约 18~20h 营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物 3.2 染 色 剂 草 酸 铵 结 晶 紫 染 色 液 鲁 格 尔 氏 碘 液 95% 乙 醇 0.5% 番 红 ( 沙 黄 ) 染 色 液 3.3 仪 器 与 其 他 用 具 显 微 镜 酒 精 灯 载 玻 片 接 种 环 双 层 瓶 ( 内 装 香 柏 油 和 二 甲 苯, 因 二 甲 苯 有 毒 及 容 易 损 坏 镜 头, 可 用 乙 醚 乙 醇 混 合 液 替 代 二 甲 苯 ) 生 理 盐 水 擦 镜 头 纸 吸 水 滤 纸 纱 布 火 柴 玻 璃 铅 笔 玻 片 夹 或 镊 子 等 4 实 验 流 程 涂 片 干 燥 固 定 草 酸 铵 结 晶 紫 初 染 (1min) 水 洗 碘 液 媒 染 (1min) 水 洗 95% 乙 醇 脱 色 (30s) 水 洗 沙 黄 复 染 (1min) 水 洗 滤 纸 吸 干 镜 检 5 操 作 步 骤 5.1 制 片 取 菌 种 培 养 物 按 简 单 染 色 法 中 的 常 规 涂 片 干 燥 固 定 进 行 制 片 注 意 要 用 活 跃 生 长 期 的 幼 龄 培 养 物 做 革 兰 氏 染 色 5.2 初 染 在 涂 片 菌 膜 处 滴 加 草 酸 铵 结 晶 紫 适 量 ( 以 刚 好 将 菌 膜 覆 盖 为 宜 ), 染 色 1~2min, 倾 去 染 色 液, 细 水 冲 洗 至 洗 出 液 为 无 色 5.3 媒 染 滴 加 碘 液 于 涂 片 上, 作 用 1min, 水 洗 5.4 脱 色 用 滤 纸 吸 去 玻 片 上 的 残 水, 滴 加 95% 酒 精 于 涂 片 上, 轻 轻 摆 动 玻 片, 直 至 乙 醇 脱 色 刚 好 不 出 现 紫 色 为 止, 一 般 30s( 如 牛 乳 培 养 物 用 60s) 后 立 即 水 洗, 终 止 脱 色 5.5 复 染 沙 黄 复 染 1~2min, 水 洗 5.6 镜 检 用 滤 纸 吸 干 或 自 然 干 燥, 油 镜 检 查 G + 菌 呈 蓝 紫 色,G - 菌 呈 红 色 革 兰 氏 染 色 的 注 意 事 项 :1 涂 片 不 宜 过 厚, 勿 使 细 菌 密 集 重 叠, 影 响 脱 色 效 果, 否 则 脱 色 不 完 全 造 成 假 阳 性 镜 检 时 应 以 视 野 内 分 散 细 胞 的 染 色 反 应 为 标 准 2 火 焰 固 定 不 宜 过 热, 以 玻 片 不 烫 手 为 宜, 否 则 菌 体 细 胞 变 形 3 滴 加 染 色 液 与 酒 精 时 一 定 要 覆 盖 整 个 菌 膜, 否 则 部 分 菌 膜 未 受 处 理, 亦 可 造 成 假 象 4 乙 醇 脱 色 是 革 兰 氏 染 色 操 作 的 关 键 环 节 如 脱 色 过 度, 则 G + 菌 被 误 染 成 G - 菌 ; 而 脱 色 不 足,G - 菌 被 误 染 成 G + 菌 在 染 色 方 法 正 确 无 误 前 提 下, 如 菌 龄 过 长, 死 亡 或 细 胞 壁 受 损 伤 的 G + 菌 也 会 呈 阴 性 反 应, 故 革 兰 氏 染 色 要 用 活 跃 生 长 期 的 幼 龄 培 养 物
6 示 范 在 示 范 镜 下 观 察 大 肠 杆 菌 ( 图 2-1a) 枯 草 芽 孢 杆 菌 ( 图 2-1b) 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ( 图 2-1 c) 藤 黄 微 球 菌 ( 图 2-1d) 钩 端 螺 旋 菌 ( 图 2-1e) 副 溶 血 性 弧 菌 ( 图 2-1f) 的 形 态 及 排 列 方 式 (a) (b) (c) (d) (e) (f) 图 2-1 各 种 细 菌 在 光 学 显 微 镜 下 的 形 态 ( 1 000) 7 实 验 结 果 与 报 告 根 据 观 察 结 果, 按 比 例 大 小 绘 出 革 兰 氏 染 色 制 片 中 细 菌 的 形 态 图, 并 说 明 各 菌 的 形 状 颜 色 和 革 兰 氏 染 色 反 应 8 思 考 题 (1) 详 叙 革 兰 氏 染 色 的 原 理 及 操 作 方 法, 染 色 时 应 注 意 哪 些 问 题? (2) 哪 些 环 节 会 影 响 革 兰 氏 染 色 结 果 的 正 确 性? 其 中 最 关 键 的 环 节 是 什 么? (3) 不 经 过 复 染 这 一 步, 能 否 区 别 G + 菌 和 G - 菌? (4) 为 什 么 要 求 制 片 完 全 干 燥 后 才 能 用 油 镜 观 察? (5) 当 你 对 未 知 菌 进 行 革 兰 氏 染 色 时, 怎 样 保 证 操 作 正 确, 结 果 可 靠?
实 验 3 霉 菌 形 态 及 菌 落 特 征 的 观 察 1 目 的 和 要 求 (1) 学 习 并 掌 握 观 察 四 类 常 见 霉 菌 形 态 特 征 的 基 本 方 法 (2) 掌 握 青 霉 曲 霉 的 小 室 载 片 培 养 法, 以 便 更 好 地 观 察 其 个 体 形 态 (3) 观 察 霉 菌 的 平 板 菌 落 特 征, 了 解 霉 菌 的 菌 落 特 征 在 丝 状 真 菌 形 态 学 鉴 定 上 的 重 要 性 2 基 本 原 理 霉 菌 是 由 复 杂 的 菌 丝 体 组 成 它 分 为 基 内 菌 丝 或 营 养 菌 丝 气 生 菌 丝 或 繁 殖 菌 丝, 由 繁 殖 菌 丝 产 生 孢 子 霉 菌 的 繁 殖 菌 丝 及 孢 子 的 形 态 特 征 是 识 别 不 同 种 类 霉 菌 的 重 要 依 据 观 察 霉 菌 的 形 态 常 用 的 有 下 列 三 种 方 法 :1 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 浸 片 法 : 是 将 培 养 物 置 于 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 染 色 液 中, 制 成 霉 菌 制 片 由 于 霉 菌 菌 丝 较 粗 大 ( 约 为 3~10µm), 置 于 水 中 观 察 时, 菌 丝 容 易 收 缩 变 形, 故 常 用 乳 酸 石 炭 酸 棉 兰 染 色 液 制 片 使 细 胞 不 会 变 形, 染 液 的 蓝 色 能 增 强 反 差, 并 具 有 防 腐 防 干 燥 防 止 孢 子 飞 散 作 用, 能 保 持 较 长 时 间, 必 要 时 还 可 用 光 学 树 胶 封 固, 制 成 永 久 标 本 长 期 保 存 但 用 接 种 针 ( 或 小 镊 子 ) 挑 取 菌 丝 体 时, 菌 体 各 部 分 结 构 在 制 片 时 易 被 破 坏, 不 利 于 观 察 其 完 整 形 态 2 小 室 载 玻 片 培 养 法 : 用 无 菌 操 作 将 培 养 基 琼 脂 薄 层 置 于 载 玻 片 上, 接 种 后 盖 上 盖 玻 片 培 养, 霉 菌 即 在 载 玻 片 和 盖 玻 片 之 间 的 有 限 空 间 内 沿 盖 玻 片 横 向 生 长 培 养 一 定 时 间 后, 将 载 玻 片 上 的 培 养 物 置 显 微 镜 下 观 察 这 种 方 法 可 以 保 持 霉 菌 自 然 生 长 状 态, 便 于 观 察 到 霉 菌 完 整 的 营 养 和 气 生 菌 丝 体 的 特 化 形 态, 例 如 曲 霉 的 足 细 胞 顶 囊, 青 霉 的 分 生 孢 子 梗 根 霉 的 匍 匐 枝 假 根 等 此 外, 也 便 于 观 察 不 同 生 长 时 期 的 培 养 物 3 玻 璃 纸 培 养 法 : 其 操 作 方 法 与 放 线 菌 的 玻 璃 纸 培 养 观 察 方 法 相 似 此 种 方 法 用 于 观 察 不 同 生 长 阶 段 霉 菌 的 形 态, 亦 可 获 得 良 好 效 果 霉 菌 在 固 体 培 养 基 上 生 长 呈 棉 絮 状 ( 毛 霉 ) 蜘 蛛 网 状 ( 根 霉 ) 绒 毛 状 ( 曲 霉 ) 和 地 毯 状 ( 青 霉 ) 的 菌 落 其 繁 殖 方 式 多 为 无 性 繁 殖 和 少 为 有 性 繁 殖 霉 菌 的 菌 丝 体 及 其 菌 落 形 态 特 征 是 霉 菌 分 类 鉴 定 的 重 要 依 据 3 实 验 材 料 3.1 菌 种 黑 曲 霉 产 黄 青 霉 黑 根 霉 和 总 状 毛 霉 28~30 培 养 3~5d 的 PDA( 或 麦 芽 汁 ) 斜 面 和 平 板 培 养 物 ( 点 植 接 种 ) 培 养 根 霉 假 根 的 PDA 平 板 培 养 物 培 养 霉 菌 的 小 室 载 玻 片 培 养 物 3.2 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 (PDA) 琼 脂 培 养 基 麦 芽 汁 琼 脂 培 养 基 3.3 试 剂 与 染 色 剂 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 染 色 液 50% 乙 醇 20% 甘 油 保 湿 剂 无 菌 生 理 盐 水 3.4 仪 器 与 其 他 用 具 接 种 环 接 种 钩 解 剖 针 解 剖 刀 镊 子 酒 精 灯 载 玻 片 盖 玻 片 透 明 胶 带 圆 形 滤 纸 片 U 形 玻 璃 棒 无 菌 平 皿 无 菌 细 口 滴 管 格 尺 普 通 光 学 显 微 镜 体 视 显 微 镜 恒 温 培 养 箱 等 4 操 作 步 骤 4.1 霉 菌 的 形 态 观 擦 4.1.1 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 浸 片 法 在 载 玻 片 上 滴 一 滴 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 染 色 液, 用 解 剖 针 ( 或 小 镊 子 ) 从 霉 菌 菌 落 边 缘 处 挑 取 少 量 已 产 孢 子 的 霉 菌 菌 丝, 先 置 于 50% 乙 醇 中 浸 一 下 以 洗 去 脱 落 的 孢 子, 再 置 于 载 玻 片 上 的 染 液 中, 用 解 剖 针 小 心 地 将 菌 丝 分 散 开 盖 上 盖 玻 片 ( 注 意 勿 压 入 气 泡 和 移 动 盖 玻 片, 以 免 影 响 观 察 ), 置 于 低 倍 镜 和 高 倍 镜 下 观 察 四 类 霉 菌 内 容 如 下 : 根 霉 : 用 低 倍 镜 观 察 孢 子 囊 梗, 囊 轴 等, 用 高 倍 镜 观 察 孢 子 囊 孢 子 的 形 状, 大 小 将 根 霉 斜 面 培 养 物 置 于 显 微 镜 载 物 台 上, 用 低 倍 镜 观 察 根 霉 的 孢 子 囊 柄 孢 子 囊 假 根 和 匍 匐 枝
毛 霉 : 用 低 倍 镜 观 察 孢 子 囊 梗, 囊 轴 等, 用 高 倍 镜 观 察 孢 子 囊 孢 子 的 形 状, 大 小 将 毛 霉 斜 面 培 养 物 置 于 显 微 镜 载 物 台 上, 用 低 倍 镜 观 察 毛 霉 的 孢 子 囊 梗 粗 细 孢 子 囊 大 小 形 状 色 泽 等 曲 霉 : 在 高 倍 镜 下 观 察 菌 丝 有 无 隔 膜, 分 生 孢 子 着 生 位 置, 辩 认 分 生 孢 子 梗 顶 囊 小 梗 和 分 生 孢 子 青 霉 : 在 高 倍 镜 下 观 察 菌 丝 有 无 隔 膜, 分 生 孢 子 梗 副 枝 小 梗 和 分 生 孢 子 的 形 状 等 4.1.2 粘 片 法 取 一 滴 棉 蓝 染 色 液 置 于 载 玻 片 中 央, 取 一 段 透 明 胶 带, 打 开 霉 菌 平 板 培 养 物, 粘 取 菌 体, 粘 面 朝 下, 放 在 染 液 上 镜 检 4.1.3 小 室 载 玻 片 培 养 法 (1) 培 养 小 室 的 灭 菌 将 略 小 于 平 皿 底 部 的 圆 形 滤 纸 片 1 张 U 形 玻 璃 棒 载 玻 片 和 两 块 盖 玻 片 等 按 图 7-5 放 入 平 图 3-1 小 室 载 玻 片 培 养 法 示 意 图 皿 内, 盖 上 平 皿 盖, 包 扎 后 于 121 湿 热 灭 菌 30min, 置 60 上 : 正 面 观 ; 下 : 侧 面 观 烘 箱 中 烘 干 备 用 1. 平 皿 ;2.U 形 玻 璃 棒 ;3. 盖 玻 片 ;4. 培 养 物 ;5. 载 玻 片 ;6. 保 湿 用 滤 纸 (2) 琼 脂 块 的 制 作 取 已 灭 菌 的 PDA 琼 脂 培 养 基 6~7ml 注 入 另 一 灭 菌 平 皿 中, 使 之 凝 固 成 薄 层 用 解 剖 刀 切 成 0.5~1.0cm 2 的 琼 脂 块, 并 将 其 移 至 上 述 培 养 室 中 的 载 玻 片 上 ( 每 片 放 两 块 )( 图 3-1) 制 作 过 程 应 注 意 无 菌 操 作 (3) 接 种 和 培 养 用 接 种 环 或 接 种 钩 挑 取 很 少 量 的 青 霉 ( 曲 霉 根 霉 毛 霉 ) 的 孢 子 接 种 于 培 养 基 四 周, 用 无 菌 镊 子 将 盖 玻 片 覆 盖 在 琼 脂 块 上, 并 轻 压 使 之 与 载 玻 片 间 留 有 极 小 缝 隙, 但 不 能 紧 贴 载 玻 片, 否 则 不 透 气 注 意 : 接 种 量 要 少, 尽 可 能 将 孢 子 分 散 接 种 在 琼 脂 块 边 缘 上, 否 则 培 养 后 菌 丝 过 于 稠 密, 影 响 观 察 先 在 平 皿 的 滤 纸 上 加 3~5ml 灭 菌 的 20% 甘 油 ( 用 于 保 持 平 皿 内 的 湿 度 ), 盖 上 皿 盖, 皿 盖 上 注 明 菌 名 组 别 和 接 种 日 期, 置 28~30 培 养 3~ 5d (4) 镜 检 培 养 至 1~2d 后, 可 以 逐 日 连 续 观 察 到 孢 子 的 萌 发 菌 丝 体 的 生 长 分 化 和 子 实 体 的 形 成 过 程 将 小 室 内 的 载 玻 片 取 出, 直 接 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 观 察 上 述 四 类 霉 菌 的 形 态, 重 点 观 察 曲 霉 分 生 孢 子 头 和 青 霉 的 帚 状 枝 形 态, 根 霉 和 毛 霉 的 孢 子 囊 和 孢 子 囊 孢 子, 菌 丝 有 无 隔 膜 等 情 况 4.1.4 根 霉 的 假 根 观 察 方 法 将 溶 化 并 冷 却 至 50 的 PDA 培 养 基 倒 入 无 菌 平 皿, 其 量 约 为 平 皿 高 度 的 1/2 冷 凝 后, 用 接 种 环 蘸 取 根 霉 孢 子 划 线 接 种 于 平 板 表 面 倒 置 平 皿, 在 皿 盖 内 放 一 无 菌 载 玻 片, 于 28 培 养 2~3d 后, 取 出 皿 盖 内 的 载 玻 片 标 本, 在 附 着 菌 丝 体 的 一 面 盖 上 盖 玻 片, 置 低 倍 显 微 镜 下 观 察 假 根 及 从 根 节 上 分 图 3-2 根 霉 假 根 的 培 养 化 出 的 孢 子 囊 梗 孢 子 囊 孢 囊 孢 子 和 两 个 假 根 间 的 匍 匐 菌 丝 等 结 构 ( 图 3-2) 4.2 霉 菌 的 菌 落 特 征 观 察 在 一 定 培 养 条 件 下 ( 包 括 培 养 基 的 性 状 培 养 温 度 和 时 间 等 ), 不 同 种 属 的 霉 菌 在 菌 落 形 态 上 显 出 一 定 的 特 征, 用 肉 眼 或 放 大 镜 ( 低 倍 镜 ) 即 可 观 察 霉 菌 的 菌 落 特 征 内 容 不 同 于 细 菌 和 酵 母 菌, 可 根 据 下 列 要 求 对 各 种 霉 菌 的 菌 落 特 征 进 行 观 察, 并 加 以 记 录 4.2.1 菌 落 大 小 分 局 限 生 长 和 蔓 延 生 长, 用 格 尺 测 量 菌 落 的 直 径 和 高 度 4.2.2 菌 落 的 颜 色 表 面 和 反 面 的 颜 色, 基 质 的 颜 色 变 化 ( 有 无 分 泌 水 溶 性 色 素 ) 4.2.3 菌 落 的 组 织 形 状 分 棉 絮 状 蜘 蛛 网 状 绒 毛 状 地 毯 状 等 4.2.4 菌 落 的 表 面 形 状 分 同 心 轮 纹 放 射 状 疏 松 或 紧 密 的 菌 丝, 有 无 水 滴 等
5 示 范 (1) 在 示 范 光 学 显 微 镜 下 观 察 黑 曲 霉 ( 图 3-3a) 黄 曲 霉 ( 图 3-3b) 杂 色 曲 霉 ( 图 3-3c) 橘 青 霉 ( 图 3-3d) 少 根 根 霉 ( 图 3-3e) 蓝 色 犁 头 霉 ( 图 3-3f) 在 PDA 琼 脂 培 养 基 上 纯 培 养 的 形 态 特 征 注 意 观 察 霉 菌 的 菌 丝 内 有 无 隔 膜, 营 养 菌 丝 有 无 假 根, 无 性 孢 子 的 种 类 ( 孢 子 囊 孢 子 或 分 生 孢 子 ), 孢 子 着 生 位 置, 形 状 颜 色 (a) (b) (c) (d) (e) (f) 图 3-3 霉 菌 在 光 学 显 微 镜 下 的 形 态 ( 乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 染 色 ) (2) 在 体 视 显 微 镜 下 观 察 黑 曲 霉 ( 图 3-4a) 黄 曲 霉 ( 图 3-4b) 杂 色 曲 霉 ( 图 3-4c) 橘 青 霉 ( 图 3-4d) 黑 根 霉 ( 图 3-4e) 总 状 毛 霉 ( 图 3-4f) 在 PDA 琼 脂 平 板 上 的 菌 落 特 征 注 意 观 察 菌 落 的 大 小 颜 色 组 织 形 状 表 面 形 状 等 (a) (b) (c)
(d) (e ) (f) 图 3-4 霉 菌 在 PDA 琼 脂 平 板 上 的 菌 落 特 征 6 实 验 结 果 与 报 告 (1) 根 据 观 察 结 果, 按 比 例 大 小 绘 图 说 明 根 霉 毛 霉 曲 霉 ( 低 倍 镜 下 ) 青 霉 ( 高 倍 镜 下 ) 的 形 态 特 征, 并 标 明 结 构 名 称 (2) 按 照 霉 菌 的 菌 落 特 征 内 容 列 表 描 述 你 所 观 察 到 的 曲 霉 青 霉 根 霉 毛 霉 的 菌 落 特 征, 并 识 别 和 区 别 它 们 之 间 的 不 同 之 处 (3) 观 察 采 用 小 室 载 玻 片 培 养 法 培 养 青 霉 和 黑 曲 霉 的 形 态 特 征 7 思 考 题 (1) 你 主 要 根 据 哪 些 形 态 特 征 来 区 分 根 霉 和 毛 霉, 青 霉 和 曲 霉? 列 表 比 较 它 们 在 形 态 结 构 上 的 异 同 (2) 根 据 小 室 载 玻 片 培 养 方 法 的 基 本 原 理, 你 认 为 上 述 操 作 过 程 中 的 哪 些 步 骤 可 以 根 据 具 体 情 况 作 一 些 改 进 或 可 用 其 他 方 法 替 代?
1 目 的 和 要 求 (1) 了 解 微 生 物 分 离 与 纯 化 的 原 理 实 验 4 土 壤 中 微 生 物 的 分 离 (2) 掌 握 微 生 物 的 各 种 平 板 分 离 与 纯 化 方 法, (3) 重 点 掌 握 常 用 的 平 板 划 线 分 离 技 术 和 斜 面 接 种 技 术 2 基 本 原 理 纯 种 分 离 技 术 是 食 品 微 生 物 学 中 重 要 的 基 本 技 术 之 一 为 了 生 产 和 科 研 的 需 要, 人 们 往 往 需 从 自 然 界 混 杂 的 微 生 物 群 体 中 分 离 出 具 有 特 殊 功 能 的 纯 种 微 生 物 ; 或 重 新 分 离 被 其 他 微 生 物 污 染 或 因 自 发 突 变 而 丧 失 原 有 优 良 性 状 的 菌 株 ; 或 通 过 诱 变 及 遗 传 改 造 后 选 出 优 良 性 状 的 突 变 株 及 重 组 菌 株 从 混 杂 微 生 物 群 体 中 获 得 只 含 有 某 一 种 或 某 一 株 微 生 物 的 过 程 称 为 微 生 物 的 分 离 与 纯 化 平 板 分 离 法 普 遍 用 于 微 生 物 的 分 离 与 纯 化 其 基 本 原 理 是 选 择 适 合 于 待 分 离 微 生 物 的 最 适 培 养 基 和 培 养 条 件, 如 培 养 基 的 营 养 成 分 酸 碱 度 温 度 和 氧 等 要 求, 或 加 入 某 种 抑 制 剂 创 造 一 个 只 利 于 目 的 菌 生 长 而 抑 制 其 他 微 生 物 生 长 的 环 境, 从 而 可 选 择 性 地 分 离 目 的 菌 细 菌 或 放 线 菌 皆 喜 中 性 或 微 碱 性 环 境, 但 细 菌 比 放 线 菌 生 长 快 分 离 放 线 菌 时, 一 般 在 样 品 稀 释 液 或 高 氏 1 号 培 养 基 中 添 加 数 滴 10% 的 酚 液 酵 母 菌 和 霉 菌 都 喜 酸 性 环 境 在 分 离 酵 母 菌 和 霉 菌 时 只 要 选 择 好 适 宜 的 培 养 基 和 ph 值, 即 可 抑 制 细 菌 的 生 长 一 般 在 培 养 基 临 用 前 需 添 加 灭 菌 的 乳 酸, 以 降 低 培 养 基 的 ph 值 至 3.5, 或 添 加 链 霉 素 抑 制 细 菌 的 生 长 有 时 分 离 霉 菌 时, 为 了 抑 制 菌 丝 蔓 延 生 长, 在 马 丁 氏 培 养 基 中 还 加 入 去 氧 胆 酸 钠 微 生 物 四 大 菌 类 的 分 离 培 养 基 培 养 温 度 培 养 时 间 见 表 4-1 所 示 表 4-1 微 生 物 四 大 菌 类 的 分 离 和 培 养 样 品 来 源 分 离 对 象 分 离 方 法 选 择 稀 释 度 培 养 基 名 称 培 养 温 度 / 培 养 时 间 /d 土 样 细 菌 倾 注 涂 布 划 线 10-5,10-6,10-7 牛 肉 膏 蛋 白 胨 37 1~2 土 样 放 线 菌 倾 注 涂 布 划 线 10-3,10-4,10-5 高 氏 1 号 28 5~7 土 样 霉 菌 倾 注 涂 布 划 线 10-2,10-3,10-4 马 丁 氏 28~30 3~5 马 铃 薯 蔗 糖 果 园 土 样 酵 母 菌 倾 注 涂 布 划 线 10-4,10-5,10-6 马 铃 薯 蔗 糖 28~30 2~3 或 面 肥 马 丁 氏 微 生 物 在 固 体 培 养 基 上 生 长 形 成 的 单 个 菌 落, 通 常 是 由 一 个 细 胞 繁 殖 而 成 的 集 合 体 因 此 可 通 过 挑 取 单 菌 落 而 获 得 一 种 纯 培 养 纯 种 ( 纯 培 养 ) 是 指 一 株 菌 种 或 一 个 培 养 物 中 所 有 的 细 胞 或 孢 子 都 是 由 一 个 细 胞 分 裂 繁 殖 而 产 生 的 后 代 获 取 单 个 菌 落 的 方 法 可 通 过 稀 释 倾 注 平 板 稀 释 涂 布 平 板 或 平 板 划 线 等 技 术 完 成 值 得 指 出 的 是, 从 微 生 物 群 体 中 经 分 离 生 长 在 平 板 上 的 单 个 菌 落 并 不 一 定 保 证 是 纯 培 养 因 此, 纯 培 养 的 确 定 除 观 察 其 菌 落 特 征 外, 还 要 结 合 显 微 镜 检 测 个 体 形 态 特 征 后 才 能 确 定, 有 些 微 生 物 的 纯 培 养 要 经 过 一 系 列 分 离 与 纯 化 过 程 和 多 种 特 征 鉴 定 才 能 得 到 土 壤 是 微 生 物 生 活 的 大 本 营, 它 所 含 微 生 物 无 论 是 数 量 还 是 种 类 都 是 极 其 丰 富 的 因 此 土 壤 是 微 生 物 多 样 性 的 重 要 场 所, 是 发 掘 微 生 物 资 源 的 重 要 基 地, 可 以 从 中 分 离 纯 化 得 到 许 多 有 价 值 的 菌 株 本 实 验 将 采 用 不 同 的 培 养 基 从 土 壤 中 分 离 不 同 类 型 的 微 生 物 3 实 验 材 料 3.1 菌 源 选 定 采 土 地 点 后, 铲 去 表 层 土 2~5cm, 取 5~10cm 处 的 土 样, 放 入 灭 菌 的 牛 皮 纸 袋 中 备 用 土 样 采 集 后 应 及 时 分 离, 否 则 应 放 在 4 冰 箱 中 暂 存 3.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 高 氏 1 号 PDA 或 马 丁 氏 琼 脂 培 养 基, 制 备 平 板 和 斜 面 试 管 3.3 溶 液 或 试 剂 10% 酚 液 无 菌 生 理 盐 水 (9ml/ 试 管,99ml/150ml 三 角 瓶, 带 适 量 玻 璃 珠 ) 链 霉 素 80% 乳 酸 75% 酒 精 棉 球
3.4 仪 器 及 其 他 用 品 1ml 无 菌 吸 管 无 菌 培 养 皿 三 角 形 无 菌 玻 璃 涂 棒 接 种 环 显 微 镜 天 平 无 菌 称 量 纸 药 勺 试 管 架 记 号 笔 等 4 实 验 流 程 倾 注 法 倒 平 板 制 备 梯 度 稀 释 液 培 养 挑 取 单 菌 落 保 存 倒 平 板 涂 布 或 划 线 法 5 操 作 步 骤 5.1 制 备 土 壤 稀 释 液 称 取 土 样 1g, 放 入 盛 99ml 无 菌 生 理 盐 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 三 角 瓶 中, 振 摇 约 20min, 使 土 样 与 水 充 分 混 合, 将 细 胞 分 散, 即 成 为 10-2 的 土 壤 悬 液 用 一 支 1ml 无 菌 吸 管 从 三 角 瓶 中 吸 取 1ml 土 壤 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 生 理 盐 水 的 大 试 管 中 ( 图 4-11), 另 换 一 支 1m1 吸 管 插 入 10-3 试 管 中 反 复 吹 吸 10 余 次, 进 一 步 分 散 菌 体 ( 图 4-13) 注 意 吹 吸 菌 液 时 不 要 过 猛 太 快, 吸 时 将 吸 管 伸 入 管 底, 吹 时 将 吸 管 提 到 接 近 液 面 以 下, 避 免 将 吸 管 中 的 过 滤 棉 花 浸 湿 或 试 管 内 液 体 外 溢 或 者 右 手 持 稀 释 液 试 管, 用 左 手 掌 敲 打 试 管 20~30 次, 充 分 振 荡 混 匀, 即 成 为 10-3 的 稀 释 液 然 后 用 此 无 菌 吸 管 从 10-3 试 管 中 吸 取 1ml 加 入 另 一 盛 有 9ml 无 菌 生 理 盐 水 的 试 管 中, 另 换 一 支 1m1 吸 管 插 入 10-4 试 管 中 反 复 吹 吸 10 余 次, 混 合 均 匀 如 此 重 复, 连 续 稀 释 可 依 次 制 成 10-3 ~10-7 不 同 稀 释 度 的 土 壤 稀 释 液, 整 个 稀 释 过 程 如 图 4-2 所 示 注 意 : 用 吸 管 释 放 稀 释 液 时, 管 尖 不 能 接 触 液 面, 并 且 每 一 个 梯 度 的 稀 释 液 换 一 支 吸 管 1 2 3 4 5 6 图 4-1 稀 释 分 离 无 菌 操 作 示 意 图 1 火 焰 旁 从 三 角 瓶 中 取 出 土 壤 悬 浮 液 ; 2 拔 棉 塞, 灼 烧 试 管 口 ;3 火 焰 旁 对 试 管 中 土 壤 悬 浮 液 进 行 稀 释 混 匀 ; 4 用 吸 管 取 稀 释 菌 液 ; 5 将 稀 释 菌 液 加 入 无 菌 培 养 皿 中 ; 6 将 溶 化 冷 却 至 45~50 培 养 基 倒 入 培 养 皿 内
依 次 各 取 1mL 每 支 试 管 均 装 9mL 无 菌 水 10% 酚 液 图 4-2 稀 释 倾 注 ( 涂 布 ) 平 板 法 中 样 品 的 稀 释 和 稀 释 液 的 取 样 培 养 5.2 平 板 接 种 培 养 平 板 分 离 培 养 法 有 稀 释 倾 注 平 板 法 稀 释 涂 布 平 板 法 和 平 板 划 线 分 离 法 三 种 方 法 5.2.1 稀 释 倾 注 平 板 法 (1) 倾 注 平 板 取 无 菌 平 皿 12 套, 分 别 用 记 号 笔 标 明 10-2 ~10-7 稀 释 度 各 2 套 用 1m1 无 菌 吸 管 分 别 吸 取 10-2 ~10-7 的 土 壤 稀 释 液 各 1ml( 图 4-14), 倾 注 相 应 标 号 的 无 菌 平 皿 中 ( 无 菌 操 作 见 图 4-15), 每 个 稀 释 度 接 种 两 个 平 板 (2) 倒 平 板 取 溶 化 后 冷 却 至 45~50 ( 不 烫 手 ) 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 高 氏 1 号 琼 脂 培 养 基 ( 加 入 10% 酚 数 滴 ) 和 马 铃 薯 蔗 糖 琼 脂 培 养 基 ( 每 100ml 加 入 灭 菌 乳 酸 1ml), 按 图 4-2 所 示, 分 别 倒 入 相 应 标 号 的 无 菌 平 皿 约 15ml( 倒 量 已 铺 满 皿 底 为 限 ), 置 水 平 位 置 迅 速 轻 轻 旋 动 平 皿, 使 培 养 基 与 稀 释 菌 液 充 分 混 匀, 而 又 不 使 培 养 基 荡 出 平 皿 或 溅 到 平 皿 盖 上 每 个 稀 释 度 倒 两 个 平 皿 倒 平 板 操 作 如 图 4-16 所 示 (3) 培 养 待 培 养 基 凝 固 后, 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 倒 置 于 温 箱 中 ( 以 免 培 养 过 程 皿 盖 冷 凝 水 滴 下, 冲 散 已 分 离 的 菌 落 ),37 培 养 1~2d, 高 氏 1 号 和 马 铃 薯 蔗 糖 平 板 倒 置 于 28 温 箱 中 培 养 3~5d 5.2.2 稀 释 涂 布 平 板 法 (1) 倒 平 板 取 无 菌 平 皿 12 套, 分 别 用 记 号 笔 标 明 10-2 ~10-7 稀 释 度 各 2 套 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 高 氏 1 号 马 铃 薯 蔗 糖 琼 脂 培 养 基 分 别 加 热 溶 化 待 冷 至 55~60 时, 高 氏 1 号 培 养 基 中 加 入 10% 酚 数 滴, 马 铃 薯 蔗 糖 培 养 基 中 每 100ml 加 入 灭 菌 的 乳 酸 1ml, 混 合 均 匀 后, 按 图 4-2 所 示 分 别 倒 平 板, 平 放 桌 上 待 凝 固 后 备 用 每 种 培 养 基 倒 4 个 平 皿 (2) 涂 布 平 板 用 1ml 无 菌 吸 管 分 别 由 10-2 ~10-7 土 壤 稀 释 液 中 各 吸 取 0.1 或 0.2 ml, 按 图 4-2 所 示, 依 次 滴 加 于 相 应 标 号 平 板 培 养 基 表 面 中 央 位 置 按 图 4-3 所 示, 在 火 焰 旁 左 手 拿 培 养 皿, 并 用 拇 指 将 皿 盖 打 开 一 缝, 右 手 持 无 菌 玻 璃 涂 棒 ( 用 酒 精 棉 球 擦 拭 并 灼 烧 灭 菌 ) 于 平 板 培 养 基 表 面 上, 将 菌 悬 液 自 平 板 中 央 以 同 心 圆 方 向 轻 轻 向 外 涂 布 扩 散, 使 之 均 匀 分 布 室 温 下 静 置 5~10min, 使 菌 液 浸 入 培 养 基 注 意 : 每 个 稀 释 度 用 一 个 灭 菌 玻 璃 涂 棒, 在 由 低 向 高 浓 度 涂 布 时, 亦 可 不 用 更 换 玻 璃 涂 棒 图 4-3 平 板 涂 布 操 作 图
(3) 培 养 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 倒 置 于 37 温 箱 中 培 养 1~2d, 高 氏 1 号 和 马 铃 薯 蔗 糖 平 板 倒 置 于 28 温 箱 中 培 养 3~5d 5.2.3 平 板 划 线 分 离 法 (1) 倒 平 板 按 稀 释 涂 布 平 板 法 倒 平 板, 并 用 记 号 笔 标 明 培 养 基 名 称 土 样 编 号 和 日 期 (2) 平 板 划 线 在 近 火 焰 处, 左 手 拿 皿 底, 右 手 拿 接 种 环, 挑 取 上 述 10-2 的 土 壤 悬 液 一 环 在 上 述 3 种 培 养 基 平 板 上 划 线 ( 图 4-4), 划 线 完 毕, 将 牛 肉 膏 蛋 白 胨 平 板 倒 置 于 37 温 箱 中 培 养 1~2d( 分 离 细 菌 ), 高 氏 1 号 和 马 铃 薯 蔗 糖 平 板 倒 置 于 28 温 箱 中 培 养 3~5d( 分 离 放 线 菌 酵 母 菌 和 霉 菌 ) 培 养 后 在 划 线 平 板 上 观 察 沿 划 线 处 长 出 的 菌 落 形 态 特 征, 经 涂 片 染 色 和 镜 检 为 纯 种 后 再 接 种 斜 面 平 板 划 线 方 式 很 多, 但 无 论 采 用 哪 种 方 式, 其 目 的 都 是 通 过 划 线 将 样 品 在 平 板 上 进 行 适 当 稀 释, 使 之 形 成 单 个 菌 落 ( 既 由 一 个 菌 体 细 胞 繁 殖 而 形 成 的 孤 立 群 落 ) 常 用 的 划 线 分 离 方 式 有 以 下 两 种 连 续 划 线 法 : 用 接 种 环 以 无 菌 操 作 挑 取 10-2 土 壤 悬 液 一 环, 先 在 平 板 培 养 基 的 边 缘 一 处 反 复 划 线 涂 布, 然 后 取 出 接 种 环, 烧 死 多 余 菌 体 待 接 种 环 在 培 养 基 空 白 边 缘 处 接 触 一 下 冷 却 后, 而 后 从 涂 菌 部 位 在 平 板 上 自 左 向 右 轻 轻 划 线 当 划 至 平 皿 的 一 半 时, 旋 转 平 皿 180º 角, 再 于 平 皿 的 另 一 半 培 养 基 的 边 缘 继 续 划 线 划 线 时 接 种 环 面 与 培 养 基 表 面 成 30~40º 角, 用 手 腕 力 量 在 平 板 表 面 轻 快 地 作 之 字 形 滑 动 ( 图 4-5a) 注 意 接 种 环 勿 划 破 或 嵌 入 培 养 基, 前 后 两 条 划 线 不 宜 重 叠, 要 疏 密 适 中, 以 免 长 成 菌 苔, 并 能 充 分 利 用 平 板 表 面 积 划 线 完 毕, 盖 上 皿 盖, 倒 置 于 温 箱 培 养 分 区 划 线 法 : 用 接 种 环 以 无 菌 操 作 挑 取 10-2 土 壤 悬 液 一 环, 先 在 平 板 培 养 基 的 一 边 作 第 一 次 平 行 划 线 3 或 4 条, 再 转 动 培 养 皿 约 70º 角, 并 将 接 种 环 上 剩 余 菌 烧 掉, 待 冷 却 后 通 过 第 一 次 划 线 部 分 作 第 二 次 平 行 划 线, 再 用 同 样 的 方 法 通 过 第 二 次 划 线 部 分 作 第 三 次 划 线 和 通 过 第 三 次 平 行 划 线 部 分 作 第 四 次 平 行 划 线 ( 图 4-5 c) 划 线 完 毕 后, 盖 上 培 养 皿 盖, 倒 置 于 温 箱 培 养 图 4-4 两 种 平 板 划 线 操 作 图
1 1 1 2 2 5 3 4 2 4 3 (a) (b) (c) (d) 图 4-5 平 行 划 线 方 式 示 意 图 a 和 b 用 于 稀 释 液 中, 可 连 续 划 线 ; c 和 d 用 于 较 浓 的 菌 样, 分 数 次 划 线, 每 次 划 线 后 要 烧 接 种 环, 然 后 在 划 下 一 区 5.3 纯 化 培 养 ( 挑 取 单 菌 落 ) 5.3.1 菌 落 特 特 征 的 观 察 与 选 择 采 用 平 板 分 离 培 养 法 长 出 的 肉 眼 可 见 菌 落, 不 同 菌 株 的 菌 落 形 态 特 征 各 异, 据 此 可 在 一 定 程 度 上 鉴 别 微 生 物 从 分 离 平 板 中 选 择 目 的 菌 株 的 菌 落, 进 行 纯 化 培 养 观 察 菌 落 特 征 主 要 有 : 大 小 表 面 形 状 隆 起 度 边 缘 性 状 菌 落 形 状 表 面 光 泽 菌 落 质 地 颜 色 透 明 度 等 等, 有 时 还 要 结 合 气 味 观 察 观 察 菌 落 特 征 具 体 内 容 参 见 实 验 七 5.3.2 斜 面 纯 化 培 养 此 法 是 将 平 板 分 离 培 养 得 到 的 单 菌 落 在 无 菌 操 作 之 下, 分 别 接 种 到 各 支 斜 面 培 养 基 上, 以 便 作 进 一 步 扩 大 培 养 或 鉴 定 保 存 之 用 接 种 前, 可 根 据 目 的 菌 的 菌 落 特 征, 选 择 好 平 板 上 的 单 菌 落, 并 做 好 标 记 ( 用 记 号 笔 圈 上 或 编 号 ) 对 所 选 单 菌 落 用 接 种 环 挑 取 一 半 进 行 革 兰 氏 染 色, 如 果 镜 检 发 现 没 有 杂 菌 ( 纯 一 ), 则 挑 取 另 一 半 菌 落 接 种 于 上 述 3 种 相 应 培 养 基 斜 面 上, 分 别 置 于 28 和 37 温 箱 中 培 养 1~ 5d, 既 长 出 菌 苔 对 斜 面 菌 苔 进 行 革 兰 氏 染 色 镜 检, 若 发 现 有 杂 菌 ( 不 纯 ), 则 应 重 新 选 择 纯 一 的 目 的 菌 落, 重 新 纯 化 培 养, 或 由 检 样 开 始 再 一 次 进 行 分 离 纯 化, 直 到 获 得 纯 培 养 物 具 体 接 种 方 法 : 左 手 持 平 板, 右 手 拿 接 种 环 在 火 焰 旁 用 拇 指 食 指 和 中 指 将 皿 盖 揭 开 一 缝, 将 烧 过 的 接 种 环 先 在 空 白 培 养 基 处 冷 却, 然 后 挑 取 菌 落, 取 出 带 菌 的 接 种 环 在 火 焰 无 菌 区 (10cm 之 内 ) 稍 等 片 刻, 此 时 左 手 将 平 板 放 下, 拿 起 一 支 斜 面 培 养 基 试 管, 以 小 拇 指 和 手 掌 拔 出 棉 塞, 迅 速 将 带 菌 接 种 环 伸 入 试 管, 于 斜 面 上 自 下 而 上 地 曲 折 划 线 接 种 注 意 接 种 过 程 要 迅 速, 否 则 易 污 染 空 气 中 的 杂 菌, 接 种 时 勿 将 菌 烫 死 和 勿 用 力 划 破 培 养 基 6 示 范 (1) 演 示 制 备 土 壤 稀 释 液 无 菌 操 作 过 程 (1) 演 示 稀 释 倾 注 平 板 法 稀 释 涂 布 平 板 法 和 连 续 平 板 划 线 法 的 无 菌 操 作 过 程 (3) 演 示 从 平 板 菌 落 接 种 于 斜 面 的 纯 化 培 养 操 作 7 实 验 结 果 与 报 告 (1) 所 做 倾 注 平 板 法 涂 布 平 板 法 和 平 板 划 线 法 是 否 较 好 地 得 到 了 单 菌 落? 如 果 不 是, 请 分 析 其 原 因 并 重 做 (2) 在 3 种 不 同 的 平 板 上 你 分 离 得 到 哪 些 类 群 的 微 生 物? 描 述 它 们 的 菌 落 特 征 (3) 将 你 所 分 离 样 品 中 单 菌 落 菌 株 的 菌 落 特 征 描 述 出 来, 并 绘 出 镜 检 形 态 图 8 思 考 题 (1) 如 何 确 定 平 板 上 某 单 个 菌 落 是 否 为 纯 培 养? 请 写 出 实 验 的 主 要 步 骤 (2) 详 述 平 板 划 线 分 离 操 作 过 程 和 斜 面 接 种 方 法 如 果 接 种 后 经 培 养 未 长 出 菌 落 或 菌 苔, 是 何 原 因?