小 动 物 疾 病 防 治 专 业 动 物 组 织 胚 胎 学 综 合 性 实 验 犬 猫 组 织 切 片 的 制 作 实 验 指 导 李 玉 谷 编 华 南 农 业 大 学 兽 医 学 院 二 零 零 四 年 六 月
犬 猫 组 织 切 片 的 制 作 实 验 指 导 李 玉 谷 编 写 张 媛 整 理 李 楚 宣 审 校
目 录 概 述 2 实 验 一 实 验 二 实 验 三 实 验 四 实 验 五 实 验 六 动 物 麻 醉 与 组 织 取 材 3 组 织 固 定 5 组 织 冲 洗 与 脱 水 8 组 织 透 明 浸 蜡 与 包 埋 11 组 织 切 片 贴 片 与 烤 片 14 组 织 切 片 染 色 15 1
概 述 一 本 实 验 的 目 的 动 物 组 织 制 片 的 方 法, 最 主 要 的 和 最 常 用 的 是 石 蜡 包 埋 切 片 法, 该 方 法 广 泛 应 用 于 动 物 组 织 学 病 理 学 生 物 学 等 许 多 学 科 和 临 床 实 践 中 石 蜡 包 埋 切 片 法 的 基 本 原 理, 是 将 石 蜡 渗 入 组 织 内 作 为 支 持 物, 然 后 用 切 片 机 将 组 织 切 成 薄 片, 经 染 色 后 在 显 微 镜 下 观 察 本 综 合 性 实 验, 要 求 同 学 们 学 会 犬 猫 组 织 的 石 蜡 包 埋 切 片,HE 染 色 标 本 的 制 作 过 程 通 过 该 实 验, 掌 握 犬 猫 组 织 的 取 材 固 定 脱 水 透 明 浸 蜡 包 埋 切 片 和 HE 染 色 等 基 本 方 法 和 操 作 技 能, 为 今 后 临 床 病 理 诊 断 等 奠 定 基 础 二 本 实 验 所 需 的 仪 器 设 备 光 学 显 微 镜 石 蜡 切 片 机 组 织 脱 水 机 石 蜡 包 埋 机 磨 刀 机 染 色 机 染 色 缸 切 片 架 载 玻 片 盖 玻 片 冰 箱 恒 温 箱 干 燥 箱 天 平 酸 度 计 离 心 机 定 时 钟 解 剖 器 械 玻 璃 器 皿, 等 等 三 本 实 验 所 需 的 主 要 试 剂 组 织 固 定 剂 (10% 福 尔 马 林 等 ) 组 织 脱 水 剂 ( 酒 精 等 ) 组 织 透 明 剂 ( 二 甲 苯 等 ) 组 织 包 埋 介 质 ( 石 蜡 等 ) 染 色 剂 ( 苏 木 精 伊 红 等 ) 分 色 剂 (1% 盐 酸 酒 精 等 ) 封 片 剂 ( 中 性 树 胶 ) 等 2
实 验 一 动 物 麻 醉 与 组 织 取 材 一 动 物 麻 醉 猫 或 狗 一 只, 用 3%~4% 戊 巴 比 妥 钠, 按 1ml/kg w 静 脉 注 射 或 腹 腔 注 射 ; 或 按 5ml/kg w 腹 腔 注 射 20% 氨 基 甲 酸 乙 酯 ; 或 按 使 用 说 明 书 注 射 其 他 麻 醉 剂 二 组 织 取 材 组 织 取 材 是 制 片 的 一 个 重 要 技 术 问 题, 必 须 根 据 具 体 要 求, 确 定 取 材 的 部 位 和 方 法 否 则, 对 所 观 察 的 组 织 结 构, 不 是 看 不 到, 就 是 看 不 全 因 此, 在 取 材 之 前, 必 须 弄 清 所 取 组 织 器 官 的 解 剖 位 置 组 织 结 构 特 点 等, 同 时, 还 要 掌 握 实 际 的 操 作 技 术, 不 能 随 意 切 取 组 织 器 官 ( 一 ) 取 材 顺 序 在 麻 醉 状 态 下, 取 下 心 肝 脾 肺 肾 淋 巴 结 胰 小 肠 大 脑 等 主 要 器 官 的 小 块 组 织, 立 即 置 于 固 定 剂 中 进 行 固 定 一 般 说 来, 先 取 腹 腔 内 的 脏 器, 然 后 取 胸 腔 骨 盆 腔 内 的 脏 器, 最 后 开 颅 取 神 经 系 统 及 其 他 材 料 狗 的 神 经 免 疫 内 分 泌 消 化 呼 吸 泌 尿 生 殖 系 统 的 材 料 均 较 好 ; 猫 的 神 经 内 分 泌 消 化 泌 尿 系 统 以 及 肌 肉 的 材 料 也 较 好 ( 二 ) 取 材 方 法 1 心 脏 (1) 部 位 : 左 心 室 乳 头 肌 处 (2) 方 法 : 沿 乳 头 肌 长 轴 作 纵 切 2 肝 (1) 部 位 : 中 部 (2) 方 法 : 纵 切 或 横 切 (3) 大 小 :2~3mm 厚 因 肝 为 实 质 性 器 官, 细 胞 排 列 密 集, 固 定 剂 难 以 渗 入, 故 组 织 块 不 能 过 大 3 脾 (1) 部 位 : 中 部 (2) 方 法 : 横 切 (3) 注 意 : 先 用 生 理 盐 水 从 脾 动 脉 注 入 冲 洗, 同 时 切 开 脾 静 脉, 将 血 液 冲 出, 至 脾 呈 灰 白 色, 然 后 取 材 3
4 肺 (1) 部 位 : 中 部 (2) 方 法 : 横 切 (3) 注 意 : 先 从 肺 支 气 管 或 肺 动 脉 注 射 适 量 的 固 定 剂, 然 后 将 全 肺 投 入 固 定 剂 中 固 定 6~12h 后, 再 取 材 5 肾 (1) 方 法 : 最 好 先 进 行 灌 注 固 定, 而 后 取 材, 即 从 肾 动 脉 注 入 固 定 剂, 同 时 切 开 肾 静 脉, 当 血 液 流 尽 后, 将 全 肾 投 入 固 定 剂 中 固 定 2~4h 后, 再 沿 正 中 矢 面 剖 开, 然 后 在 任 一 半 面 上, 从 皮 质 向 髓 质 的 方 向 切 一 扇 形 组 织 块, 以 确 保 皮 质 髓 质 完 全, 再 投 入 固 定 剂 继 续 固 定 (2) 注 意 : 皮 质 髓 质 一 定 要 完 整 6 淋 巴 结 (1) 部 位 : 肠 系 膜 淋 巴 结 较 好, 髂 内 淋 巴 结 颈 淋 巴 结 也 可 (2) 方 法 : 沿 门 部 作 正 中 纵 切 面, 分 为 两 半 7 胰 (1) 部 位 : 以 胰 尾 较 好, 因 为 此 处 胰 岛 较 多 (2) 大 小 : 长 0.3~0.5cm 8 小 肠 (1) 部 位 : 一 般 取 各 段 肠 管 的 中 部 (2) 方 法 : 横 切 纵 切 均 可 横 切 时, 可 先 取 一 段 稍 长 的 肠 管, 用 生 理 盐 水 冲 去 内 容 物, 然 后 两 端 结 扎, 再 注 入 适 量 固 定 剂 于 肠 腔 内, 投 入 固 定 剂 中 预 固 定 4~6h 后 再 取 材, 长 约 0.5~1.0cm; 纵 切 时, 组 织 块 经 生 理 盐 水 洗 涤 后, 将 外 壁 贴 于 滤 纸 上, 然 后 投 入 固 定 剂 中 固 定 9 大 脑 (1) 部 位 : 中 央 前 回 或 后 回 (2) 方 法 : 垂 直 切 入 (3) 注 意 : 皮 质 髓 质 均 切 到 ( 三 ) 取 材 注 意 事 项 1 动 作 轻 柔, 避 免 挤 压 组 织 一 般 用 刀 片, 少 用 或 不 用 剪 刀, 切 取 时 要 一 刀 下 去, 不 要 来 回 拉 锯 式 拖 动 2 及 时 取 材 动 物 死 后 30min 内 完 成 3 组 织 块 大 小 适 中, 一 般 为 1 1 0.3~0.5cm, 并 有 代 表 性 4 取 材 后 及 时 固 定 4
实 验 二 组 织 固 定 一 组 织 固 定 的 目 的 使 用 固 定 剂 固 定 组 织 细 胞 的 目 的, 是 使 组 织 细 胞 内 的 蛋 白 质 脂 类 碳 水 化 合 物 酶 等 沉 淀 和 凝 固, 防 止 细 胞 死 后 自 溶 和 腐 败, 从 而 尽 量 保 持 其 生 前 原 有 的 形 态 结 构 自 溶 : 是 由 于 动 物 死 后 呼 吸 停 止 血 液 循 环 停 止, 组 织 内 缺 氧, 细 胞 逐 渐 死 亡, 酶 析 出, 造 成 其 蛋 白 质 等 溶 解, 从 而 使 细 胞 自 行 溶 解 破 坏 腐 败 : 是 由 于 自 然 界 的 细 菌 等 微 生 物 的 侵 入 繁 殖, 使 组 织 结 构 被 破 坏, 从 而 失 去 原 有 的 形 态 结 构 二 对 固 定 剂 的 要 求 为 了 能 够 阻 止 组 织 的 自 溶 和 腐 败, 并 使 组 织 细 胞 保 持 生 活 时 的 原 有 形 态 结 构, 要 求 固 定 剂 必 须 具 有 下 列 性 能 : 1 对 蛋 白 质 脂 肪 碳 水 化 合 物 等 具 有 沉 淀 和 凝 固 作 用 2 具 有 一 定 的 渗 透 能 力 和 穿 透 速 度 3 不 至 于 引 起 组 织 过 度 收 缩 或 膨 胀 4 不 至 于 引 起 组 织 过 度 硬 化 5 固 定 剂 的 ph 值 要 符 合 要 求 6 不 至 于 影 响 组 织 的 染 色 三 固 定 方 法 从 动 物 取 下 小 块 组 织, 直 接 投 入 下 列 某 种 固 定 剂 中 进 行 固 定 5
四 常 用 固 定 剂 1 甲 醛 固 定 剂 (1) 配 方 : 福 尔 马 林 ( 市 售 甲 醛 ) 10ml 蒸 馏 水 90ml (2) 应 用 : 常 规 固 定 剂, 一 般 组 织 均 可 固 定 (3) 时 间 :24h 2 中 性 甲 醛 固 定 剂 (1) 配 方 : 甲 醛 10ml 蒸 馏 水 90ml NaH 2 PO 4.H 2 O 0.4g Na 2 HPO 4 0.65g (2) 应 用 : 常 规 固 定 剂, 一 般 组 织 均 可 固 定 (3) 时 间 :24h 3 Carnoy 氏 固 定 剂 (1) 配 方 : 纯 酒 精 60ml 氯 仿 30ml 冰 醋 酸 10ml (2) 应 用 : 固 定 RNA DNA 糖 原 淋 巴 组 织 腺 体 效 果 好 (3) 时 间 : 组 织 块 厚 度 2mm 以 下,2~4h;5mm 左 右,8~12h 固 定 后 不 经 水 洗, 直 接 入 100% 酒 精 脱 水 4 Zenker 氏 固 定 剂 (1) 配 方 :HgCl 2 5g K 2 Cr 2 O 7 2.5g Na 2 SO 4.10H 2 O 1g 蒸 馏 水 100ml 冰 醋 酸 5ml( 临 时 加 入 ) (2) 应 用 : 为 组 织 学 常 规 固 定 剂, 对 胞 质 胞 核 固 定 均 很 好, 染 色 也 清 晰 6
( 3) 时 间 :24h (4) 注 意 : 切 片 要 脱 汞 5 Bouin 氏 固 定 剂 (1) 配 方 : 苦 味 酸 饱 和 水 溶 液 75ml 甲 醛 25ml 冰 醋 酸 5ml (2) 应 用 : 为 胚 胎 学 组 织 学 常 用 固 定 剂 (3) 时 间 :2~4mm 厚 组 织,12~24h;2mm 以 下,4~6h 五 组 织 固 定 注 意 事 项 1 组 织 必 须 新 鲜 上 面 已 经 谈 及, 动 物 死 后 30min 内 将 组 织 器 官 固 定 为 好, 最 迟 不 超 过 2h 2 组 织 块 大 小 适 中, 即 1 1 0.3~0.5cm 3 固 定 剂 以 新 配 为 好, 尤 其 是 既 含 氧 化 剂, 又 含 还 原 剂 的 固 定 剂, 如 Zenker 氏 固 定 剂 等 4 固 定 时 间 视 固 定 剂 性 质 组 织 块 大 小 而 定 一 般 不 要 超 过 所 规 定 的 时 间, 以 免 组 织 硬 化 收 缩 5 某 些 柔 软 组 织 不 易 切 成 薄 片, 取 材 时 可 以 取 大 一 点 进 行 预 固 定, 待 组 织 稍 硬 化 后, 再 切 成 小 块 组 织 继 续 固 定 6 如 果 组 织 块 较 大, 厚 度 超 过 0.5cm, 或 进 行 酶 组 织 化 学 染 色 时, 最 好 置 冰 箱 内 冷 藏 固 定 7 固 定 瓶 中 最 好 垫 一 些 棉 花 或 纱 布, 将 组 织 块 置 于 其 上, 这 样 组 织 块 不 至 于 贴 壁, 有 利 于 固 定 剂 均 匀 渗 入 8 固 定 剂 的 量 要 足 够, 一 般 固 定 剂 与 组 织 块 的 体 积 比 为 20:1 7
实 验 三 组 织 冲 洗 与 脱 水 一 组 织 冲 洗 ( 一 ) 冲 洗 的 目 的 组 织 经 过 固 定 剂 固 定 后, 一 般 均 要 用 水 或 酒 精 冲 洗 或 漂 洗 其 目 的 是 :(1) 停 止 固 定 剂 继 续 对 组 织 的 作 用 ;( 2 ) 除 去 组 织 中 的 固 定 剂, 以 免 影 响 染 色 ( 二 ) 冲 洗 原 则 1 含 升 汞 (HgCl 2 ) 重 铬 酸 钾 铬 酸 锇 酸 ( 四 氧 化 锇,OsO 4 ) 的 固 定 剂, 如 Zenker 氏 固 定 剂 等, 应 充 分 水 洗 2 Bouin 氏 固 定 剂, 以 及 酒 精 配 制 的 固 定 剂, 如 Carnoy 氏 固 定 剂, 甲 醛 酒 精 固 定 剂 等, 不 用 水 洗, 可 直 接 入 50% 或 70% 酒 精 洗 涤 3 甲 醛 短 时 间 固 定 的 组 织, 可 不 经 冲 洗, 但 甲 醛 长 期 固 定 的 组 织, 则 应 充 分 水 洗, 否 则 产 生 色 素, 影 响 染 色 和 观 察 ( 三 ) 冲 洗 方 法 1 简 易 流 水 冲 洗 法 2 系 列 玻 璃 瓶 或 水 槽 冲 洗 法 3 倒 置 冲 洗 法 4 酒 精 洗 涤 法 组 织 与 酒 精 的 体 积 比 为 1 20 50%~70% 酒 精, 更 换 3~6 次 ( 四 ) 冲 洗 时 间 一 般 为 12~24h 组 织 冲 洗 后, 若 因 特 殊 情 况, 暂 时 不 能 及 时 进 行 脱 水 包 埋, 可 保 存 在 70% 酒 精 中 如 用 下 列 溶 液, 效 果 更 好 : 甘 油 10ml, 80% 酒 精 90ml 8
二 组 织 脱 水 ( 一 ) 脱 水 的 目 的 标 本 经 固 定 和 冲 洗 后, 组 织 中 含 有 较 多 的 水 分, 只 有 除 去 这 些 水 分, 石 蜡 等 包 埋 介 质 才 能 渗 入 所 以, 必 须 进 行 脱 水 处 理 ( 二 ) 常 用 脱 水 剂 脱 水 剂 必 须 能 与 水 任 意 混 合, 同 时 又 能 与 透 明 剂 混 合 常 用 的 脱 水 剂 有 : 1 酒 精 可 作 为 固 定 剂, 又 可 作 为 脱 水 剂 (1) 优 点 : 脱 水 能 力 强 (2) 缺 点 : 高 浓 度 酒 精 对 组 织 有 强 烈 的 收 缩 硬 化 脆 化 作 用 因 此, 用 酒 精 脱 水 必 须 由 低 浓 度 到 高 浓 度, 再 到 无 水 酒 精, 逐 渐 取 代 组 织 中 的 水 分, 以 保 证 组 织 脱 水 彻 底, 并 避 免 组 织 过 度 收 缩 硬 化 脆 化 切 忌 直 接 用 高 浓 度 或 无 水 酒 精 脱 水 2 正 丁 醇 是 较 好 的 脱 水 剂 兼 透 明 剂 (1) 优 点 :1 很 少 引 起 组 织 收 缩 变 硬 变 脆 2 可 与 石 蜡 混 合, 因 此 可 以 省 去 二 甲 苯 透 明 这 一 步 骤, 直 接 进 行 浸 蜡 包 埋 (2) 缺 点 :1 脱 水 能 力 较 弱, 因 此 脱 水 时 间 较 长 2 价 格 较 贵 ( 三 ) 脱 水 方 法 1 酒 精 脱 水 过 程 2~3mm 厚 的 组 织 块 5mm 左 右 厚 的 组 织 块 (1)50% 酒 精 6~8h 6~12h (2)70% 酒 精 6~8h 6~12h (3)80% 酒 精 4~6h 6~8h (4)95% 酒 精 2~4h 3~6h (5)95% 酒 精 2~4h 3~6h (6)100% 酒 精 1~2h 2~4h (7)100% 酒 精 1~2h 2~4h 9
注 意 事 项 : (1) 对 于 易 硬 易 脆 的 组 织, 如 肝 脾 肌 肉 等, 以 及 柔 嫩 的 胚 胎 组 织, 应 以 30% 或 35% 酒 精 开 始, 并 缩 小 梯 度 差, 如 增 加 60% 90% 酒 精 等 (2) 在 无 水 酒 精 中 脱 水 时 间 应 严 格 掌 握, 不 能 脱 水 过 久, 否 则 又 硬 又 脆, 切 片 难 以 成 功 (3) 脱 水 时 间 与 组 织 大 小 质 地 固 定 剂 的 种 类 有 关 2 正 丁 醇 酒 精 脱 水 过 程 1~3mm 厚 的 组 织 块 (1)50% 酒 精 6~12h 50% 蒸 馏 水 (2)50% 酒 精 5~8h 20% 正 丁 醇 30% 蒸 馏 水 (3)50% 酒 精 4~6h 35% 正 丁 醇 15% 蒸 馏 水 (4)45% 酒 精 3~5h 45% 正 丁 醇 10% 蒸 馏 水 (5)40% 酒 精 3~4h 55% 正 丁 醇 5% 蒸 馏 水 (6)25% 酒 精 2~3h 75% 正 丁 醇 (7)15% 酒 精 1~2h 85% 正 丁 醇 (8)5% 酒 精 1~2h 95% 正 丁 醇 (9)100% 正 丁 醇 Ⅰ 1~2h (10)100% 正 丁 醇 Ⅱ 1~2h (11) 100% 正 丁 醇 Ⅲ 1~2h 10
实 验 四 组 织 透 明 浸 蜡 与 包 埋 一 组 织 透 明 组 织 经 过 固 定 冲 洗 和 脱 水 后, 欲 制 成 石 蜡 切 片, 则 必 须 用 石 蜡 包 埋 而 酒 精 不 能 与 石 蜡 混 合, 即 石 蜡 无 法 渗 入 组 织 内 取 代 酒 精 因 此, 必 须 经 过 一 种 既 可 与 酒 精 混 合, 又 可 与 石 蜡 混 合 的 试 剂 ( 透 明 剂 ), 先 取 代 组 织 中 的 酒 精, 而 使 组 织 成 为 透 明 状 态, 然 后 液 体 石 蜡 浸 入 组 织 内 取 代 透 明 剂 当 石 蜡 降 温 凝 固 后, 便 十 分 顺 利 地 达 到 埋 藏 组 织 的 目 的 ( 一 ) 常 用 透 明 剂 透 明 剂 都 是 石 蜡 的 溶 剂, 如 二 甲 苯 甲 苯 苯 香 柏 油 氯 仿 等 二 甲 苯 为 最 常 用 的 透 明 剂 (1) 优 点 :1 透 明 能 力 强 一 般 30min 即 可 2 除 用 于 组 织 块 透 明 外, 也 可 用 于 组 织 切 片 的 透 明, 而 且 切 片 不 易 褪 色 (2) 缺 点 :1 易 于 使 组 织 收 缩 变 硬 变 脆 2 易 于 挥 发, 并 有 一 定 毒 性 (3) 注 意 :1 浸 入 二 甲 苯 之 前, 先 经 二 甲 苯 无 水 酒 精 等 量 混 合 液 过 渡, 以 减 少 组 织 的 收 缩 2 肌 肉 肌 腱 软 骨 皮 肤 眼 球 等 一 般 不 用 二 甲 苯 透 明, 因 使 组 织 过 硬, 难 于 切 片 3 二 甲 苯 含 水 时, 出 现 乳 白 色 混 浊, 可 放 入 少 量 硫 酸 铜 吸 水 ( 二 ) 透 明 方 法 第 一 步 : 无 水 酒 精 与 二 甲 苯 等 量 混 合 液 5~10min; 第 二 步 : 二 甲 苯 Ⅰ 10~15min; 第 三 步 : 二 甲 苯 Ⅱ 10~15min 注 意 : 至 组 织 块 呈 均 匀 半 透 明 状 即 可, 不 可 超 时 11
二 组 织 浸 蜡 与 包 埋 浸 蜡 是 石 蜡 包 埋 的 重 要 步 骤 组 织 经 脱 水 透 明 后, 将 其 移 入 已 熔 化 的 石 蜡 中, 使 石 蜡 浸 入 组 织 内, 并 取 代 透 明 剂 当 温 度 降 低 后, 石 蜡 凝 固, 组 织 块 即 包 埋 于 石 蜡 中 ( 一 ) 浸 蜡 1 浸 蜡 方 法 方 法 一 : 软 蜡 软 蜡 硬 蜡 硬 蜡 包 埋 48~50 54~56 56~58 60~62 方 法 二 : 软 蜡 软 蜡 硬 蜡 硬 蜡 硬 蜡 包 埋 54~56 54~56 56~58 56~58 60~62 2 渗 蜡 时 间 (60 ) 组 织 块 1 1 2~3mm 1 1 4~5mm 组 织 方 法 一 (min) 方 法 二 (min) 方 法 一 (min) 方 法 二 (min) 肝 肾 10 20 40 10 10 20 30 15 20 50 15 20 20 30 肌 肉 10 10 30 10 10 10 20 10 15 35 10 10 20 20 消 化 管 10 15 40 10 10 20 25 15 20 45 10 15 25 30 胰 10 10 25 5 10 10 20 10 15 30 10 10 15 20 淋 巴 器 官 10 15 35 10 10 15 25 10 15 40 10 15 20 25 大 血 管 10 15 35 10 15 15 20 15 20 40 10 15 20 30 子 宫 膀 胱 10 15 35 10 10 15 25 10 25 40 10 15 15 35 神 经 组 织 10 15 35 10 10 15 25 10 25 40 10 15 15 35 皮 肤 20 20 50 15 20 25 30 20 20 60 15 15 30 40 垂 体 10 15 20 10 10 10 15 10 15 35 10 10 15 25 骨 髓 5 10 20 5 5 10 15 10 10 25 5 10 15 15 睾 丸 15 30 60 15 15 30 45 20 40 60 20 20 35 45 ( 二 ) 包 埋 包 埋 即 组 织 经 过 固 定 脱 水 透 明 及 浸 蜡 后, 在 浸 蜡 过 程 中 使 石 蜡 渗 入 组 织 内 达 到 饱 和 程 度, 并 连 同 溶 化 的 石 蜡 一 并 倾 入 特 制 的 包 埋 框 内, 冷 却 后, 便 凝 固 成 定 型 的 蜡 块 组 织 包 埋 成 蜡 块 后, 获 得 了 一 定 的 硬 度 和 韧 度, 使 其 能 切 成 薄 片 12
石 蜡 包 埋 一 般 用 硬 蜡 为 好 夏 天 气 温 较 高, 可 用 熔 点 60~62 的 石 蜡 ; 冬 天 气 温 较 低, 可 用 熔 点 56~58 的 石 蜡 1 石 蜡 包 埋 过 程 (1) 组 织 浸 蜡 进 入 最 后 蜡 杯 后, 即 开 始 包 埋 的 准 备 (2) 装 好 金 属 包 埋 框 将 金 属 框 摆 放 在 保 温 台 上 (3) 将 包 埋 蜡 置 于 电 炉 上 溶 化, 并 保 持 在 65 左 右 (4) 点 燃 酒 精 灯, 准 备 好 无 齿 镊 子, 标 签 等 (5) 将 溶 化 的 石 蜡 (65 左 右 ) 倾 注 入 包 埋 框 内, 倒 满 为 止 (6) 从 浸 蜡 杯 中 取 出 组 织 块, 迅 速 放 入 包 埋 框 内 注 意 切 面 朝 下 放, 并 将 其 放 在 包 埋 框 中 央 (7) 将 标 签 分 别 放 在 蜡 块 上 (8) 待 表 层 蜡 凝 结 后, 可 放 入 冷 水 中, 加 速 其 凝 固 (9) 待 蜡 块 完 全 冷 却 凝 固 后, 拆 除 包 埋 框, 取 出 蜡 块, 包 埋 即 完 成 2 石 蜡 包 埋 注 意 事 项 (1) 包 埋 用 的 石 蜡 必 须 纯 净 若 有 异 物 或 杂 质, 容 易 损 坏 切 片 刀 这 种 情 况 下 石 蜡 必 须 过 滤 (2) 包 埋 用 的 镊 子 要 随 时 烤 热 以 免 石 蜡 凝 结 后 粘 附 在 镊 子 上, 造 成 蜡 块 凝 固 不 均 匀 (3) 操 作 要 迅 速 组 织 从 浸 蜡 杯 中 取 出 后, 不 可 在 空 气 中 停 留 过 久, 否 则 组 织 表 面 的 石 蜡 已 凝 固, 若 包 埋 框 内 的 石 蜡 无 法 溶 化 组 织 表 面 的 石 蜡, 则 会 造 成 组 织 与 包 埋 蜡 的 分 离, 切 片 将 无 法 进 行 (4) 包 埋 用 的 石 蜡, 温 度 不 能 过 高 或 过 低 过 高 时 石 蜡 容 易 渗 出 框 外, 同 时 也 会 对 组 织 造 成 损 害 ; 过 低 则 很 快 凝 固, 操 作 来 不 及 (5) 包 埋 后 的 组 织 块 应 呈 半 透 明 状, 若 呈 白 色 不 透 明 状, 则 为 脱 水 不 彻 底 或 组 织 中 残 留 有 较 多 的 透 明 剂 (6) 若 包 埋 后 蜡 块 中 出 现 白 色 混 浊, 则 可 能 是 包 埋 蜡 温 度 过 低 或 石 蜡 不 纯 (7) 若 包 埋 后 发 现 浸 蜡 不 够 或 包 埋 不 好, 可 将 蜡 块 重 新 熔 化, 重 新 浸 蜡 包 埋 13
实 验 五 组 织 切 片 贴 片 与 烤 片 一 磨 刀 可 用 手 工 方 法 在 专 用 磨 刀 石 上 进 行, 有 条 件 可 用 磨 刀 机 进 行 磨 刀 时 要 在 磨 刀 石 上 滴 加 水 或 润 滑 剂, 粗 磨 可 用 蒸 馏 水, 细 磨 用 石 蜡 油 润 滑 油 或 特 制 的 机 油 等 但 总 的 来 说, 用 油 剂 比 用 水 安 全, 因 水 与 切 片 刀 之 间 的 摩 擦 力 较 大, 掌 握 不 好 易 于 损 害 切 片 刀 注 意 :(1) 每 把 刀 均 有 各 自 的 刀 背 套 和 刀 柄, 不 能 混 用 (2) 在 磨 刀 石 上 磨 好 后, 再 在 胶 皮 上 磨 一 磨 ( 被 刀 ), 使 刀 口 更 加 平 整 锋 利 二 修 整 蜡 块 将 蜡 块 周 围 多 余 的 石 蜡 切 去 一 部 分, 使 蜡 块 成 梯 形, 然 后 粘 在 小 木 块 ( 持 蜡 器 ) 上 一 般 组 织 周 围 保 留 2~3mm 宽 的 蜡 即 可, 太 多 太 少 均 不 好 注 意 : 蜡 块 的 切 面 一 定 要 呈 长 方 形 或 正 方 形, 即 上 下 左 右 要 对 称 三 安 装 蜡 块 和 切 片 刀 将 持 蜡 器 和 切 片 刀 固 定 在 切 片 机 上 切 片 刀 倾 斜 角 为 12~15 度 ( 双 平 面 刀 ) 或 4~6 度 ( 平 凹 面 刀 或 双 凹 面 刀 ), 凹 面 朝 前 四 切 片 切 片 厚 度 一 般 为 5μm 左 右 将 切 好 的 切 片 置 于 盘 中, 反 光 面 朝 下 注 意 :(1) 切 片 时 用 力 要 均 匀 ;( 2 ) 温 度 过 高, 难 于 切 片 时, 用 冰 块 冷 却 蜡 块 切 面, 或 将 蜡 块 置 于 冰 箱 中 预 冷 后 再 切 片 五 摊 片 ( 展 片 ) 贴 片 和 烤 片 将 切 片 置 于 40 左 右 的 温 水 中, 让 其 自 然 展 开, 然 后 用 载 玻 片 从 水 中 捞 起 切 片, 切 片 则 粘 贴 在 载 玻 片 上 最 后, 将 其 置 于 37 的 温 箱 中, 烤 片 12~24h 14
实 验 六 组 织 切 片 染 色 组 织 切 片 需 要 用 特 殊 染 料 染 色, 以 增 大 反 差, 才 能 在 显 微 镜 下 观 察 常 用 的 染 料 有 苏 木 精 (hematoxylin) 伊 红 (esion) 用 这 两 种 染 料 联 合 染 色, 称 为 HE 染 色 或 常 规 染 色 一 染 色 液 的 配 制 1 Ehrlich 氏 苏 木 精 (1) 配 方 : 苏 木 精 2g 无 水 酒 精 100ml 冰 醋 酸 10ml 铝 化 钾 或 硫 酸 铝 钾 10g 蒸 馏 水 100ml 甘 油 100ml (2) 配 法 :1 将 铝 化 钾 或 硫 酸 铝 钾 溶 于 蒸 馏 水 ( 加 热 至 40~50 ); 2 将 苏 木 精 溶 于 无 水 酒 精, 再 加 入 冰 醋 酸 温 热 的 铝 化 钾 或 硫 酸 铝 钾 溶 液, 最 后 加 入 甘 油 ;3 配 制 完 后, 置 温 热 和 阳 光 充 足 处, 成 熟 3 个 月 2 伊 红 酒 精 溶 液 伊 红 Y 0.5~1g 80% 或 95% 酒 精 100ml 混 合 后 即 可 用 二 HE 染 色 步 骤 1 切 片 脱 蜡 : (1) 二 甲 苯 Ⅰ 5~10min 15
( 2) 二 甲 苯 Ⅱ 5~10min 2 复 水 脱 汞 :(3)100% 酒 精 Ⅰ 2~3min (4)100% 酒 精 Ⅱ 2~3min (5)95% 酒 精 Ⅰ 1~2min (6)95% 酒 精 Ⅱ 1~2min (7)80% 酒 精 1~2min (8)Lugol 碘 酒 脱 汞 3~5min( 不 含 汞 者 省 去 ) 配 法 : 碘 2g, 碘 化 钾 1g,70%~75% 酒 精 100ml (9)60% 酒 精 1~2min (10) 蒸 馏 水 洗 1~2min ( 11) 5% 硫 代 硫 酸 钠 1~2min 至 切 片 无 色 (12) 蒸 馏 水 洗 1~2min 3 染 细 胞 核 : (13)Ehrlich 氏 苏 木 精 10~15min (14) 自 来 水 洗 1~2min 4 分 色 : (15) 盐 酸 酒 精 10~30s 配 法 : 浓 盐 酸 0.5~1ml, 70%~95% 酒 精 100ml 5 蓝 化 : (16) 自 来 水 洗 5~10min( 至 切 片 呈 蓝 色 ) (17) 蒸 馏 水 洗 1~2min 6 脱 水 : (18)60% 酒 精 1~2min (19)70% 酒 精 1~2min (20)80% 酒 精 1~2min 7 染 细 胞 质 : (21)95% 酒 精 配 制 的 伊 红 1~2min 8 分 色 : (22)95% 酒 精 1~2min 9 脱 水 : (23)100% 酒 精 Ⅰ 2~3min (24)100% 酒 精 Ⅱ 2~3min 10 透 明 : (25) 二 甲 苯 Ⅰ 2~3min (26) 二 甲 苯 Ⅱ 2~3min 11 封 固 : 中 性 树 胶 封 片 12 镜 检 : 细 胞 核 为 蓝 色, 细 胞 质 为 红 色 16
三 染 色 注 意 事 项 1 切 片 脱 蜡 必 须 彻 底 若 气 温 过 低, 应 延 长 时 间 或 置 于 温 箱 中 脱 蜡 脱 蜡 时 间 宁 可 长 些, 不 能 过 短 2 切 片 脱 蜡 后, 经 100% 95% 酒 精 充 分 洗 去 二 甲 苯, 否 则 染 色 不 佳, 切 片 也 不 洁 净 3 染 色 时 间 要 灵 活 掌 握 苏 木 精 染 色 时, 若 染 料 为 新 配 或 温 度 低 时, 要 适 当 延 长 时 间 或 置 于 温 箱 中 进 行 伊 红 染 色 时, 若 为 水 溶 液, 时 间 要 长 些 (3~10min), 若 为 酒 精 溶 液 则 1~2min 即 可 染 色 不 能 过 浓, 否 则 对 比 不 佳, 但 太 淡 则 不 鲜 艳 如 果 伊 红 不 易 着 色, 可 滴 加 醋 酸 促 染 4 分 色 是 关 键 步 骤 之 一, 时 间 要 灵 活 掌 握, 见 切 片 发 红 即 可 若 分 色 过 度, 可 返 回 重 染 5 蓝 化 要 充 分 可 用 流 水 冲 洗, 但 不 要 直 接 冲 到 切 片 上 6 脱 水 要 彻 底, 否 则 置 于 二 甲 苯 后, 切 片 出 现 白 色 云 雾 状 水 珠, 则 无 法 透 明 若 出 现 这 种 情 况, 返 回 重 脱 水 但 95% 酒 精 中 停 留 时 间 不 能 过 久, 否 则 伊 红 易 于 脱 色 7 封 片 时, 盖 玻 片 要 从 一 侧 徐 徐 放 下, 太 快 容 易 产 生 气 泡 另 外, 中 性 树 胶 浓 度 要 适 中, 以 能 从 滴 管 中 自 由 滴 下 为 好 ; 量 不 要 太 多, 否 则 溢 出, 切 片 既 不 美 观, 又 易 弄 脏 17