表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 Pyrosequencing 测 序 与 定 量 之 相 得 益 彰 Sample & Assay Technologies
定 量 数 据 打 开 遗 传 研 究 的 新 视 野 测 序 技 术 的 发 展 大 大 扩 展 了 我 们 对 于 生 物 信 息 是 如 何 被 编 码 于 DNA 核 苷 酸 序 列 中 的 了 解 这 种 了 解 同 时 也 引 发 了 新 的 疑 问 : 微 妙 的 序 列 改 变, 特 别 是 在 非 编 码 区 域, 有 什 么 重 大 意 义? 调 控 元 件 的 相 互 作 用 会 在 什 么 时 候 对 基 因 的 表 达 产 生 影 响? 非 序 列 形 式 的 信 息 如 我 们 通 常 所 说 的 表 观 遗 传 信 息 如 何 参 与 促 进 了 发 育 编 程 和 细 胞 分 化? 最 后, 这 些 问 题 的 答 案 将 以 何 种 形 式 推 进 应 用 科 学 的 发 展? 这 些 问 题 都 是 遗 传 研 究 的 新 视 野 研 究 人 员 正 在 揭 开 DNA 的 遗 传 和 表 观 遗 传 修 饰 中 所 储 存 并 遗 传 的 新 层 次 的 生 物 信 息 这 一 信 息 的 鉴 定 需 要 同 时 兼 具 应 用 灵 活 性 和 可 获 得 定 量 数 据 的 新 一 代 的 研 究 工 具 焦 磷 酸 测 序 技 术 及 QIAGEN PyroMark 产 品 通 过 将 遗 传 变 异 的 检 测 和 定 量 整 合 到 一 个 强 大 的 系 统 中, 焦 磷 酸 测 序 及 PyroMark 平 台 比 其 它 定 向 DNA 短 序 列 的 分 析 方 案 更 胜 一 筹 对 于 一 系 列 应 用 而 言, 这 意 味 着 投 入 的 费 用 和 时 间 更 少 ( 图 1) 焦 磷 酸 测 序 的 优 势 包 括 : 可 定 量 等 位 基 因, 即 使 是 低 频 率 等 位 基 因 可 检 测 未 知 的 序 列 变 异 同 一 台 仪 器, 甚 至 同 一 次 运 行 的 分 析 多 功 能 性 内 置 的 分 析 对 照 保 证 了 数 据 的 准 确 性 和 可 靠 性 快 速 获 得 直 接 且 明 确 无 疑 的 序 列 数 据 直 观 的 软 件, 可 进 行 强 大 的 分 析 和 用 户 设 计 分 析 表 观 遗 传 学 在 定 量 单 个 及 多 个 相 邻 CpG 位 点 的 甲 基 化 方 面, 有 着 无 比 优 越 的 性 能 兽 医 学 灵 敏 检 测 多 种 病 原 体 感 染, 在 育 种 项 目 中 进 行 快 速 的 基 因 分 型 群 体 研 究 对 群 体 遗 传 结 构 进 行 统 计 学 上 可 靠 的 定 量, 即 使 是 病 毒 等 快 速 变 化 的 目 标 植 物 遗 传 学 测 序 及 定 量 区 分 纯 合 性, 杂 合 性, 以 及 多 倍 体 物 种 的 不 同 杂 合 状 态 药 物 遗 传 学 从 头 测 序 和 内 置 的 对 照 利 于 新 标 记 的 发 现 和 验 证 法 医 学 法 医 学 分 子 标 记 的 测 序 及 定 量 增 强 了 物 证 鉴 定 试 验 的 辨 别 能 力, 特 别 是 高 度 降 解 的 DNA 癌 症 研 究 开 展 各 种 分 析 的 应 用 灵 活 性, 以 全 面 鉴 定 与 疾 病 相 关 的 遗 传 和 表 观 遗 传 因 素 进 化 研 究 可 靠 的 测 序 适 用 于 系 统 发 育 比 较, 高 检 测 灵 敏 度 以 追 踪 育 种 试 验 的 性 状 改 变 图 1. 焦 磷 酸 测 序 在 不 同 研 究 领 域 的 优 势 2 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
焦 磷 酸 测 序 反 应 级 联 卓 越 的 试 剂 和 灵 敏 的 技 术 实 现 了 对 序 列 变 异 的 定 量 步 骤 1 扩 增 DNA 片 段, 作 为 焦 磷 酸 测 序 模 板 的 一 条 链 被 生 物 素 标 记 经 过 变 性 处 理, 分 离 出 生 物 素 标 记 的 单 链 PCR 扩 增 子, 并 与 测 序 引 物 杂 交 步 骤 2 杂 交 的 引 物 和 单 链 模 板 与 DNA 聚 合 酶 ATP 硫 酸 化 酶 (ATP sulfurylase) 荧 光 素 酶 (luciferase) 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 (apyrase) 以 及 底 物 腺 苷 5 酰 硫 酸 (APS) 和 荧 光 素 (luciferin) 共 同 孵 育 步 骤 3 第 一 个 三 磷 酸 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 (dntp) 加 到 反 应 中 如 果 dntp 与 模 板 链 上 的 碱 基 互 补, 则 DNA 聚 合 酶 催 化 其 加 在 测 序 引 物 上 每 个 掺 入 事 件 伴 随 着 焦 磷 酸 (PPi) 的 释 放, 它 的 摩 尔 量 与 掺 入 的 核 苷 酸 相 同 步 骤 4 ATP 硫 酸 化 酶 在 腺 苷 5 酰 硫 酸 (APS) 存 在 的 情 况 下 将 PPi 转 化 成 ATP 此 ATP 驱 动 荧 光 素 酶 介 导 的 荧 光 素 转 化 成 氧 化 荧 光 素, 并 产 生 可 见 光, 其 数 量 与 ATP 的 量 成 正 比 荧 光 素 酶 催 化 反 应 所 产 生 的 光 被 电 荷 偶 联 装 置 (CCD) 芯 片 所 检 测, 在 原 始 数 据 输 出 (Pyrogram ) 中 可 见 一 个 峰 每 个 峰 的 高 度 ( 光 信 号 ) 与 掺 入 的 核 苷 酸 数 目 成 正 比 Pyrogram 步 骤 5 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 持 续 降 解 未 掺 入 的 核 苷 酸 和 ATP 当 降 解 完 成, 另 一 个 核 苷 酸 加 入 到 反 应 中 步 骤 6 dntp 的 加 入 是 依 次 进 行 的 值 得 一 提 的 是, 脱 氧 腺 苷 α 硫 代 三 磷 酸 (datpαs) 被 作 为 天 然 的 脱 氧 腺 苷 三 磷 酸 (datp) 的 替 代 物, 因 为 它 能 被 DNA 聚 合 酶 高 效 使 用, 而 不 被 荧 光 素 酶 识 别 随 着 过 程 的 延 续, 互 补 DNA 链 延 伸, 而 核 酸 序 列 则 根 据 Pyrogram 图 中 的 信 号 峰 来 确 定 图 2. 焦 磷 酸 测 序 反 应 级 联 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 3
定 量 表 观 遗 传 学 DNA 甲 基 化 分 析 标 准 的 甲 基 化 分 析 方 法 只 提 供 了 定 性 或 半 定 量 的 数 据, 在 考 量 表 观 遗 传 DNA 甲 基 化 对 细 胞 周 期 和 代 谢 的 影 响 方 面 时 可 能 会 导 致 得 出 不 正 确 的 结 论 没 有 甲 基 化 水 平 的 定 量, 是 不 可 能 将 生 理 功 能 相 关 的 甲 基 化 与 背 景 甲 基 化 区 分 开 来 的 焦 磷 酸 测 序 通 过 准 确 定 量 单 个 连 续 的 CpG 位 点 上 的 甲 基 化 频 率 ( 图 3 和 图 4) 有 效 解 决 了 这 种 局 限 性 焦 磷 酸 测 序 本 身 能 检 测 并 定 量 甲 基 化 水 平 上 的 细 微 改 变 这 种 方 法 的 其 他 优 势 还 包 括 以 结 果 的 序 列 背 景 来 提 供 内 置 的 质 量 控 制, 以 及 可 将 结 果 与 预 期 的 甲 基 化 水 平 进 行 比 较 的 能 力 亚 硫 酸 氢 盐 处 理 的 内 置 对 照 省 去 了 人 工 评 估 未 转 化 的 DNA 水 平, 并 预 防 了 假 阳 性 甲 基 化 检 测, 从 而 确 保 了 结 果 的 可 靠 性 这 些 特 征 让 焦 磷 酸 测 序 成 为 DNA 甲 基 化 分 析 的 金 标 准 此 项 技 术 已 经 用 在 :DNA 甲 基 化 与 肿 瘤 类 型 和 基 因 表 达 相 关 联 的 研 究, 测 量 去 甲 基 试 剂 处 理 后 的 细 胞 反 应, 以 及 评 估 与 肿 瘤 发 生 遗 传 印 记 和 暴 露 在 环 境 毒 素 下 相 关 的 甲 基 化 状 态 的 变 化 (1) 图 3. 焦 磷 酸 测 序 分 析 RASSF1A 基 因 中 的 CpG 甲 基 化 模 式 4 个 肿 瘤 样 品 中 5 个 不 同 的 CpG 位 点 的 甲 基 化 水 平 的 变 异 在 不 同 时 间 运 行 两 个 重 复 样 品, 仍 表 现 出 很 高 的 重 复 性 图 4. 以 焦 磷 酸 测 序 定 量 甲 基 化 的 线 性 未 甲 基 化 的 基 因 组 DNA 与 甲 基 化 DNA(EpiTect 对 照 DNAs) 的 不 同 混 合 物 经 PCR 后, 产 物 用 于 焦 磷 酸 测 序 分 析 混 合 物 中 甲 基 化 DNA 的 已 知 比 例 ( ) 与 焦 磷 酸 测 序 所 报 告 的 甲 基 化 比 例 ( ) 之 间 有 密 切 的 相 关 性 (r2=0.9962) 图 中 展 示 了 p16 基 因 中 单 个 CpG 位 点 的 甲 基 化 定 量 4 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
定 量 表 观 遗 传 学 DNA 纯 化 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 PCR 扩 增 焦 磷 酸 测 序 甲 基 化 定 量 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 反 应 中 重 要 的 质 量 控 制 利 用 焦 磷 酸 测 序 技 术 来 鉴 定 DNA 序 列 的 甲 基 化 程 度, 首 先 将 DNA 与 亚 硫 酸 氢 钠 共 同 孵 育 这 样, 未 甲 基 化 的 胞 嘧 啶 残 基 转 化 成 尿 嘧 啶, 而 甲 基 化 的 胞 嘧 啶 保 持 不 变, 产 生 了 两 种 可 以 区 分 的 不 同 序 列 亚 硫 酸 氢 盐 处 理 的 内 对 照 也 整 合 到 分 析 中 模 板 序 列 中 后 面 不 是 鸟 嘌 呤 的 胞 嘧 啶 不 会 被 甲 基 化, 因 此 通 过 亚 硫 酸 氢 盐 的 处 理 和 PCR 后 转 化 成 胸 腺 嘧 啶 ( 表 1) 如 果 所 有 模 板 的 这 些 位 置 都 显 示 出 胸 腺 嘧 啶, 而 不 是 胞 嘧 啶, 即 可 确 认 实 现 了 完 全 的 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 QIAGEN EpiTect 亚 硫 酸 氢 盐 处 理 试 剂 盒 采 用 了 独 特 的 DNA 保 护 技 术, 可 在 促 进 DNA 完 整 转 化 的 同 时 尽 可 能 减 少 被 处 理 DNA 的 降 解 表 1. 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 和 PCR 后 产 生 的 序 列 原 始 序 列 亚 硫 酸 氢 盐 处 理 后 PCR 扩 增 后 未 甲 基 化 的 DNA A-C-G-T-C-G-T-C-A A-U-G-T-U-G-T-U-A A-T-G-T-T-G-T-T-A 甲 基 化 的 DNA A-C-G-T-C-G-T-C-A A-C-G-T-C-G-T-U-A A-C-G-T-C-G-T-T-A 灵 活 的 甲 基 化 分 析 模 式 甲 基 化 程 度 的 分 析 利 用 了 焦 磷 酸 测 序 数 据 的 定 量 性 质 与 Sanger 测 序 不 同, 在 生 成 的 Pyrogram 图 上 的 峰 值 高 度 代 表 了 每 个 待 分 析 的 CpG 位 点 上 胞 嘧 啶 与 胸 腺 嘧 啶 的 比 值, 这 反 映 出 甲 基 化 DNA 的 比 例 检 测 分 析 的 设 计 是 灵 活 的 它 既 可 以 以 正 向 或 反 向 进 行, 也 可 以 在 上 链 或 下 链 进 行 此 外, 相 邻 的 CpG 位 点 可 在 同 一 次 运 行 内 独 立 分 析, 这 实 现 了 对 序 列 范 围 内 甲 基 化 的 模 式 评 估, 同 时 保 留 了 位 点 特 异 的 甲 基 化 程 度 的 细 节 ( 图 5) 图 5. 多 个 相 邻 的 CpG 位 点 的 分 析 在 单 次 焦 磷 酸 测 序 运 行 中 定 量 9 个 独 立 的 CpG 位 点 的 甲 基 化 ( 以 灰 色 突 出 显 示 ) 分 析 序 列 背 景 中 位 点 特 异 的 信 息 代 表 了 广 泛 的 序 列 甲 基 化 模 式 注 意 含 有 胞 嘧 啶 的 内 置 质 量 控 制 位 点 ( 以 黄 色 突 出 显 示 ) 转 化 成 胸 腺 嘧 啶, 说 明 被 处 理 DNA 的 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 充 分 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 5
灵 敏 的 遗 传 检 测 插 入 / 缺 失 和 SNP 分 析 遗 传 检 测 是 许 多 应 用 的 重 要 组 成 部 分 例 如, 开 发 有 效 的 治 疗 药 物 需 要 有 关 基 因 多 态 性 如 何 影 响 代 谢 方 面 的 信 息 ; 了 解 疾 病 的 遗 传 分 布 包 括 了 连 锁 突 变 的 鉴 定 ; 甚 至, 法 医 DNA 物 证 的 分 析 依 赖 序 列 变 异 的 准 确 检 测 许 多 突 变 类 型 已 经 在 这 些 应 用 中 得 以 利 用, 流 行 病 学 药 物 遗 传 学 和 畜 牧 业 等 领 域 中 越 来 越 多 的 新 遗 传 标 记 也 在 不 断 地 验 证 当 中 相 应 地, 出 现 了 多 种 分 析 方 法 来 检 测 这 种 遗 传 变 异 这 使 得 不 同 方 法 和 不 同 研 究 人 员 所 获 得 的 结 果 之 间 的 比 较 更 为 复 杂 最 理 想 的 是 能 有 一 种 单 一 技 术 普 遍 适 用 于 所 有 应 用 从 而 使 结 果 得 以 标 准 化 焦 磷 酸 测 序 恰 好 具 备 这 种 多 功 能 性 由 于 焦 磷 酸 测 序 反 应 中 引 物 替 换 的 灵 活 性, 几 乎 所 有 遗 传 标 记, 无 论 是 正 在 使 用 的 还 是 有 待 鉴 定 的, 都 能 够 被 分 析 可 变 位 点 的 等 位 基 因 能 准 确 定 量, 杂 合 性 也 能 轻 松 分 辨 ( 图 6 图 7) 此 外, 由 于 焦 磷 酸 测 序 带 来 了 序 列 信 息, 可 评 估 各 种 类 型 的 遗 传 变 异 插 入 / 缺 失 单 核 苷 酸 多 态 性 单 个 串 联 重 复 以 及 可 变 的 基 因 拷 贝 数 并 能 够 在 单 次 运 行 中 分 析 多 个 相 邻 的 序 列 变 异 图 6. 三 等 位 基 因 SNP 的 分 析 常 用 方 法 很 难 检 测 三 四 等 位 基 因 SNP 这 一 系 列 的 Pyrogram 图 说 明 了 焦 磷 酸 测 序 检 测 三 等 位 基 因 SNP 的 简 易 性 ( 红 框 ) C T 和 G 在 焦 磷 酸 测 序 反 应 中 连 续 分 布, 只 有 掺 入 的 核 苷 酸 会 引 起 信 号 峰 结 果 是 每 个 等 位 基 因 的 纯 合 样 品 的 不 同 峰 模 式 ( 左 侧 的 三 幅 Pyrogram 图 ), 或 杂 合 样 品 的 复 合 峰 模 式 ( 右 侧 的 三 幅 Pyrogram 图 ) 6 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
灵 敏 的 遗 传 检 测 DNA 纯 化 PCR 扩 增 焦 磷 酸 测 序 等 位 基 因 频 率 分 析 多 功 能 性 指 尖 轻 点 即 可 实 现 无 论 待 分 析 的 分 子 标 记 或 突 变 是 什 么, 焦 磷 酸 测 序 模 板 的 制 备 以 及 生 成 序 列 信 息 的 后 续 分 析 都 很 简 单 快 速, 节 省 了 时 间 和 宝 贵 的 资 源 然 而, 焦 磷 酸 测 序 在 遗 传 检 测 上 的 优 势 在 于 其 产 量 由 于 结 果 只 是 样 品 中 DNA 的 真 实 序 列, 用 户 可 在 同 一 个 运 行 中 分 析 指 定 区 域 内 的 多 个 突 变 点, 甚 至 多 种 变 异 类 型 ( 图 8) 此 外, 直 观 的 结 果 也 易 于 阐 释 焦 磷 酸 测 序 可 实 现 从 头 测 序, 再 加 上 可 变 位 点 周 围 的 序 列 作 为 内 置 对 照, 成 为 验 证 新 发 现 分 子 标 记 的 可 靠 方 法 高 通 量 有 助 于 快 速 编 辑 建 立 这 些 分 子 标 记 的 参 考 数 据 库 所 需 的 群 体 数 据 这 个 特 征 让 焦 磷 酸 测 序 成 为 开 发 药 物 遗 传 学 和 法 医 遗 传 标 记 的 强 大 且 通 用 的 工 具 (2) 图 7. 定 量 突 变 分 析 Pyrogram 图 中 峰 高 与 样 品 中 等 位 基 因 的 频 率 成 正 比 因 此, 它 能 准 确 测 定 如 血 液 样 品 中 突 变 的 比 例 图 8. 单 个 焦 磷 酸 测 序 反 应 中 定 量 的 两 种 突 变 类 型 DNA 序 列 的 Pyrogram 图 反 映 了 插 入 - 缺 失 突 变 (ATCTGCCC) 以 及 包 含 单 碱 基 对 替 换 (C vs. T) 的 体 细 胞 突 变 可 变 区 域 以 蓝 色 突 出 显 示, 等 位 基 因 频 率 显 示 在 上 方 的 指 示 位 点 补 偿 的 直 方 图 ( 下 图 ) 显 示 出 每 个 核 苷 酸 加 入 时 所 掺 入 的 核 酸 数 量 深 蓝 色 柱 代 表 等 位 基 因 之 间 保 守 的 核 苷 酸 位 置, 箭 头 空 心 柱 代 表 定 量 的 变 异 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 7
准 确 的 基 因 分 型 微 生 物 鉴 定 和 药 物 抗 性 分 型 序 列 信 息 为 微 生 物 基 因 分 型 应 用 提 供 了 可 靠 的 数 据 不 过, 评 估 微 生 物 基 因 中 差 异 区 域 的 传 统 方 法 很 耗 时, 可 能 还 需 要 物 种 特 异 的 探 针 或 进 行 凝 胶 电 泳, 或 易 受 未 知 突 变 的 影 响 ( 如 杂 交 ) 焦 磷 酸 测 序 是 一 种 快 速 而 准 确 的 替 代 方 法 由 于 此 技 术 通 过 合 成 DNA 模 板 的 新 拷 贝 来 测 序, 所 以 结 果 提 供 了 明 确 无 疑 的 信 息, 用 户 可 核 对 可 变 位 点 周 围 的 序 列, 以 确 保 分 析 正 确 的 DNA 区 域 一 套 引 物 一 次 运 行 同 时 可 鉴 定 多 个 物 种 与 杂 交 技 术 不 同, 焦 磷 酸 测 序 可 利 用 单 个 保 守 的 测 序 引 物 来 实 现 对 大 量 物 种 的 鉴 定 ( 图 9) 因 此, 从 多 个 微 生 物 物 种 提 取 的 DNA 可 在 同 一 个 焦 磷 酸 测 序 运 行 中 进 行 测 序 PyroMark IdentiFire SW 1.0 软 件 方 便 了 本 地 测 序 数 据 库 的 编 辑, 导 入 的 焦 磷 酸 测 序 结 果 可 与 之 快 速 比 对 原 始 数 据 匹 配 的 阳 性 检 出, 以 及 每 个 阳 性 检 出 的 一 致 性 百 分 比 都 以 详 细 的 鉴 定 报 告 显 示 这 些 可 靠 的 数 据 可 在 短 时 间 内 提 供 焦 磷 酸 测 序 可 在 不 到 一 个 小 时 内 平 行 读 取 最 多 96 个 样 品 的 一 段 DNA 差 异 区 域 ( 图 10) 取 决 于 不 同 的 分 析 设 计, 获 得 的 序 列 可 用 于 区 分 微 生 物 物 种 类 型 和 菌 株, 或 检 测 赋 予 抗 生 素 和 抗 病 毒 药 物 抗 性 的 遗 传 突 变 图 9. 基 于 焦 磷 酸 测 序 的 细 菌 鉴 定 PCR 引 物 是 根 据 保 守 区 域 设 计 的, 测 序 引 物 恰 好 位 于 一 段 研 究 透 彻 的 高 变 区 ( 蓝 色 ) 的 上 游 一 套 引 物 足 以 区 分 上 述 物 种 ( 以 及 此 次 比 对 中 未 包 括 的 其 它 物 种 ) 8 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
准 确 的 基 因 分 型 DNA 纯 化 PCR 扩 增 焦 磷 酸 测 序 基 因 分 型 和 鉴 定 追 踪 药 物 抗 性 的 发 展 RNA 可 对 多 个 样 品 同 时 进 行 常 见 药 物 抗 性 突 变 的 分 析 检 测 ( 图 11) 由 于 焦 磷 酸 测 序 可 报 告 位 点 的 真 实 序 列, 单 个 分 析 就 能 检 测 一 系 列 可 能 突 变, 包 括 新 的 意 想 不 到 的 突 变 仪 器 及 优 化 的 分 析 设 计 让 焦 磷 酸 测 序 技 术 能 够 检 出 频 率 低 于 5% 的 序 列 变 异, 某 些 情 况 下 可 能 检 测 更 低 频 率 此 外, 多 个 基 因 拷 贝 的 杂 合 变 异 可 能 会 导 致 不 同 的 抗 性 模 式, 这 类 变 异 也 能 进 行 可 靠 的 定 量 可 观 察 DNA 序 列 背 景 的 突 变, 使 得 用 户 能 对 该 分 析 进 行 验 证 再 加 上 获 得 结 果 的 时 间 短 及 使 用 便 利, 这 种 分 析 灵 活 性 和 检 测 灵 敏 度 让 焦 磷 酸 测 序 成 为 以 培 养 及 杂 交 法 为 基 础 的 抗 性 筛 选 的 有 益 补 充 甚 至 替 代 不 断 增 加 的 物 种 特 异 分 析 库 利 用 微 生 物 基 因 中 研 究 透 彻 的 高 变 区 的 特 征 序 列 进 行 广 义 鉴 定 的 策 略 已 有 报 道 的 同 时, 也 出 现 越 来 越 多 的 分 析 检 测 特 异 针 对 通 常 研 究 的 致 病 物 种 和 细 菌 菌 株, 病 毒 及 真 菌 PCR * * 96 - 图 10. 焦 磷 酸 测 序 所 节 省 的 时 间 从 RNA 分 离 到 数 据 分 析, 有 了 焦 磷 酸 测 序,RNA 病 毒 的 抗 性 获 得 突 变 的 检 测 在 一 个 工 作 日 内 就 能 轻 松 完 成 这 个 时 间 特 指 针 对 96 个 病 毒 样 品 的 一 个 44- 碱 基 长 度 区 域 的 测 序 图 11. 23S 基 因 的 突 变 分 析, 此 突 变 赋 予 幽 门 螺 杆 菌 Helicobacter pylori 以 抗 菌 抗 性 AAA GAA AGA 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 9
PyroMark 软 件 方 案 直 观 的 软 件, 专 为 满 足 您 的 需 求 而 设 计 PyroMark 系 统 的 应 用 和 补 充 软 件 有 着 用 户 友 好 的 界 面, 可 进 行 分 析 检 测 设 计 运 行 设 置 以 及 对 所 获 结 果 进 行 各 种 分 析 软 件 是 由 下 拉 菜 单 驱 动 的, 确 保 正 确 选 择 每 个 分 析 的 参 数 和 分 析 模 式, 让 用 户 能 即 时 启 动 焦 磷 酸 测 序 运 行 ( 图 12) 最 后, 软 件 还 包 括 了 灵 活 的 报 告 格 式 和 多 种 不 同 的 数 据 输 出 功 能 综 合 的 分 析 检 测 设 计 节 省 时 间 和 经 费 图 12. PyroMark Q24 软 件 的 序 列 分 析 灵 活 的 PyroMark 分 析 检 测 设 计 软 件 2.0 尽 可 能 减 少 了 反 复 试 验 设 计 和 分 析 优 化 所 浪 费 的 时 间 和 经 费 此 软 件 是 根 据 多 年 的 焦 磷 酸 测 序 和 PCR 优 化 方 面 的 专 业 知 识 来 构 建 的, 特 有 完 整 质 量 控 制 和 将 分 析 顺 利 导 入 任 何 PyroMark 仪 器 的 算 法 只 需 要 几 次 点 击, 软 件 就 能 设 计 出 PCR 及 测 序 引 物, 用 于 基 因 分 型 等 位 基 因 定 量 序 列 分 析 和 甲 基 化 分 析 ( 图 13) 对 于 后 者 的 应 用, 软 件 能 预 测 出 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 序 列, 并 突 出 显 示 CpG 位 点 和 作 为 对 照 的 非 CpG 胞 嘧 啶 ( 图 14) 图 13. PyroMark 分 析 设 计 软 件 的 PCR 和 测 序 引 物 设 计 高 质 量 和 高 通 量 甲 基 化 分 析 的 软 件 在 分 析 多 个 样 品, 且 每 个 样 品 有 多 个 甲 基 化 位 点 时, 软 件 的 帮 助 对 于 了 解 序 列 范 围 的 模 式 及 位 置 特 异 的 详 情 是 很 重 要 的 软 件 还 应 当 提 供 有 意 义 的 统 计 数 字 PyroMark Q24 软 件 或 适 用 于 PyroMark Q96 ID 和 PyroMark Q96 MD 的 PyroMark CpG SW 1.0 具 有 此 功 能 标 准 的 计 算 包 括 甲 基 化 频 率 质 量 评 估 每 孔 和 重 复 实 验 的 甲 基 化 平 均 值 多 个 连 续 位 点 的 统 计 学 甲 基 化 模 式, 以 及 与 预 期 甲 基 化 模 式 的 偏 离 结 果 显 示 为 易 于 理 解 的 图 形 和 数 字 图 14. PyroMark 分 析 设 计 软 件 所 预 测 的 亚 硫 酸 氢 盐 转 化 序 列 10 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
PyroMark 仪 器 PyroMark Q24 体 积 小, 功 能 大 PyroMark Q24 的 强 项 在 于 可 对 多 达 24 个 样 品 进 行 焦 磷 酸 测 序, 适 用 于 多 种 应 用 PyroMark Q24 软 件 提 供 三 种 分 析 类 型, 以 适 应 您 的 研 究 需 求 等 位 基 因 定 量 (AQ) 甲 基 化 分 析 (CpG) 和 序 列 分 析 (SQA) 因 此, 在 数 分 钟 内 您 就 能 鉴 定 DNA 甲 基 化 模 式 定 量 等 位 基 因 频 率 检 测 稀 有 突 变, 进 行 从 头 测 序, 检 测 与 特 定 表 型 连 锁 的 分 子 标 记, 并 分 析 疾 病 相 关 突 变 这 个 紧 凑 的 测 序 平 台 只 占 有 极 少 的 工 作 台 空 间, 同 时 却 可 简 化 所 有 流 程 步 骤, 从 PCR 产 物 到 序 列 变 异 的 检 测 和 定 量, 这 样 几 轮 运 行 在 一 个 工 作 日 内 就 能 完 成 此 外,PyroMark Q24 所 设 计 的 分 析 也 与 大 型 PyroMark 仪 器 兼 容, 让 您 自 由 选 择 在 这 种 小 平 台 上 验 证 新 的 分 析 检 测, 随 后 升 级 到 高 通 量 在 处 理 样 品 时, 仪 器 上 的 屏 幕 显 示 出 指 定 孔 中 的 实 时 测 序 信 息, 这 样 您 能 够 追 踪 运 行 的 进 展 所 有 收 集 的 数 据 同 时 储 存 在 仪 器 硬 盘 和 USB 储 存 棒 中 这 让 您 能 转 移 运 行 文 件 到 任 一 台 安 装 了 PyroMark Q24 软 件 副 本 的 计 算 机 上, 进 行 分 析 除 了 测 序 仪 器 和 软 件,PyroMark Q24 系 统 还 特 有 真 空 工 作 站, 以 快 速 制 备 焦 磷 酸 测 序 反 应 的 单 链 DNA 模 板 系 统 还 包 括 PyroMark Gold Q24 试 剂, 优 化 了 Pyrogram 图 的 峰 清 晰 度, 以 及 多 种 QIAGEN Quality 的 检 测 试 剂 盒 ( 图 15) 如 果 工 作 台 空 间 时 间 限 制 以 及 应 用 多 样 性 之 间 的 取 舍 在 您 的 实 验 室 中 是 个 问 题, 那 么 PyroMark Q24 提 供 了 能 满 足 多 个 研 究 和 检 测 项 目 需 求 的 优 化 方 案 图 15. PyroMark Q24 仪 器 和 PyroMark Q24 真 空 工 作 站 完 整 的 焦 磷 酸 测 序 系 统 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 11
PyroMark 仪 器 PyroMark Q96 ID 多 功 能, 高 通 量 需 要 大 样 品 量 的 应 用 适 合 在 PyroMark Q96 ID 上 进 行 这 些 应 用 包 括 微 生 物 鉴 定 和 药 物 抗 性 分 型,DNA 甲 基 化 水 平 的 群 体 范 围 参 考, 基 于 基 因 多 态 性 的 系 统 发 育 或 进 化 研 究,Y 染 色 体 单 体 型 分 析, 以 及 线 粒 体 异 质 性 的 评 估 以 确 定 肌 病 症 状 的 表 现 (3) 这 个 多 重 应 用 平 台 具 有 与 PyroMark Q24 相 同 的 多 功 能 性 有 了 96 孔 形 式 自 动 的 碱 基 检 出 功 能, 以 及 甲 基 化 分 析 和 分 析 设 计 的 专 用 软 件 方 案,PyroMark Q96 ID 能 够 处 理 需 要 真 实 序 列 信 息 和 定 量 遗 传 变 异 的 任 何 研 究 问 题 此 外,PyroMark Q96 ID 直 接 与 PyroMark IdentiFire SW 1.0 连 接, 利 用 专 为 焦 磷 酸 测 序 数 据 而 优 化 的 算 法 来 将 测 序 结 果 与 本 地 数 据 库 配 对 这 种 高 通 量 形 式 也 提 供 一 些 可 促 进 高 效 流 程 的 附 加 设 备 例 如, PyroMark Q96 真 空 工 作 站 能 平 行 制 备 96 个 纯 化 的 单 链 DNA 样 品, 直 接 用 于 焦 磷 酸 测 序, 省 去 了 冗 长 的 移 液 操 作 ( 图 16) 对 于 那 些 重 视 大 样 品 量 或 高 重 复 数 量 的 统 计 学 可 靠 性, 并 需 要 能 应 对 目 前 及 未 来 研 究 问 题 的 研 究 型 工 具 的 科 研 或 检 测 项 目 而 言,PyroMark Q96 ID 系 统 是 它 们 的 解 决 方 案 图 16. PyroMark Q96 ID 和 PyroMark Q96 真 空 工 作 站 平 行 制 备 及 分 析 96 个 样 品 12 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
PyroMark 仪 器 PyroMark Q96 MD 更 高 的 通 量, 更 好 的 灵 敏 度 在 考 虑 到 处 理 成 百 上 千 个 样 品 所 需 的 大 量 试 剂 时, 运 行 通 量 最 大 化 可 能 会 使 实 验 成 本 变 得 很 高 PyroMark Q96 MD 装 有 一 台 高 度 灵 敏 的 光 检 测 摄 像 头, 可 以 在 减 少 试 剂 量 的 情 况 下 对 小 量 的 DNA 模 板 进 行 准 确 测 序 这 使 得 焦 磷 酸 测 序 成 为 其 它 任 何 高 通 量 测 序 或 检 测 平 台 的 低 成 本 替 代 此 仪 器 还 有 一 种 全 自 动 的 形 式 自 动 化 PyroMark Q96 MD 精 确 的 机 械 臂 将 平 板 从 储 板 器 中 输 送 至 仪 器 的 反 应 仓, 集 成 的 储 板 器 能 容 纳 最 多 10 块 平 板 平 板 根 据 条 形 码 来 鉴 定, 允 许 自 动 追 踪 样 品 和 结 果 只 需 将 所 需 数 量 的 96 孔 板 加 载 到 自 动 模 块 中 即 可 离 开 ( 图 17) PyroMark Q96 MD 具 有 与 PyroMark Q96 ID 相 似 的 系 统 组 件, 软 件 能 对 等 位 基 因 频 率 定 量 基 因 分 型 和 甲 基 化 分 析 检 测 并 定 量 几 乎 所 有 序 列 变 异 的 能 力, 再 加 上 更 好 的 灵 敏 度 和 自 动 化 选 项, 让 PyroMark Q96 MD 极 其 适 合 大 规 模 测 序 项 目, 如 多 倍 体 植 物 遗 传 学 和 药 物 遗 传 学 标 记 的 开 发, 以 及 灵 敏 的 测 序 项 目 如 低 产 量 样 品 的 甲 基 化 分 析 图 17. PyroMark Q96 MD Automated 和 PyroMark Q96 真 空 工 作 站 自 动 分 析 最 多 960 个 样 品 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 13
PyroMark 的 流 程 方 案 PyroMark 分 析 设 计 软 件 PyroMark PCR 试 剂 盒 PyroMark 真 空 工 作 站 PyroMark 仪 器 PyroMark 软 件 优 化 的 产 品 适 用 于 每 个 流 程 步 骤 PyroMark 产 品 线 的 各 组 成 部 分 均 经 过 设 计, 让 您 的 研 究 流 程 简 化 而 高 效 每 个 步 骤 都 由 软 件 试 剂 盒 试 剂, 以 及 为 焦 磷 酸 测 序 而 优 化 的 样 品 制 备 仪 器 来 支 持 在 开 始 时, 利 用 专 门 的 PyroMark 分 析 设 计 软 件 来 设 计 分 析, 生 成 适 合 指 定 DNA 区 域 的 PCR 及 测 序 引 物 然 后, 扩 增 待 分 析 的 DNA 序 列 QIAGEN 开 发 出 PyroMark PCR 试 剂 盒, 其 中 包 含 了 独 特 的 PCR 试 剂, 产 生 生 物 素 标 记 的 高 质 量 DNA, 确 保 Pyrogram 图 上 获 得 最 清 晰 最 强 的 峰 ( 图 18) PyroMark 真 空 工 作 站 平 行 分 离 出 所 有 样 品 的 DNA 模 板 探 针 上 的 Sepharose 基 质 微 珠 结 合 并 固 定 了 生 物 素 标 记 的 PCR 扩 增 子 通 过 一 系 列 将 探 针 浸 入 精 心 配 制 的 溶 液 的 步 骤, 变 性 并 清 洗 扩 增 子, 只 留 下 需 要 的 单 链 DNA 吸 附 在 微 珠 上 随 后 将 模 板 DNA 释 放 到 含 有 测 序 引 物 的 特 殊 设 计 24 孔 或 96 孔 板 中, 一 切 就 绪! 在 您 完 成 了 焦 磷 酸 测 序 之 后, 利 用 PyroMark 应 用 和 补 充 软 件 展 开 灵 活 多 样 的 分 析, 从 而 结 束 流 程 无 论 您 选 择 什 么 形 式 的 PyroMark 系 统 来 推 动 您 的 研 究 工 作 进 入 遗 传 和 表 观 遗 传 研 究 的 新 境 界, 您 绝 对 可 以 放 心, 您 购 买 的 是 符 合 QIAGEN 严 格 的 质 量 标 准 的 可 靠 而 强 大 的 研 究 工 具 图 18. PyroMark PCR 试 剂 盒 让 Pyrogram 图 的 峰 有 所 改 善 标 准 热 启 动 PCR( 下 图 ) 和 PyroMark PCR 试 剂 盒 ( 上 图 ) 扩 增 DNA 后 所 得 到 的 焦 磷 酸 测 序 结 果 不 仅 仅 是 峰 增 强 了, 产 生 的 等 位 基 因 定 量 也 更 可 靠, 如 图 所 示, 上 面 的 Pyrogram 图 中 对 计 算 的 频 率 百 分 比 的 质 量 评 估 为 通 过 ( 蓝 框 ), 而 下 面 的 Pyrogram 图 中 评 估 则 为 失 败 ( 红 框 ) 参 考 文 献 1. Dejeux, E., El abdalaoui, H., Gut, I.G., and Tost, J. (2009) Identification and quantification of differentially methylated loci by Pyrosequencing Technology. Methods Mol. Biol. 507, 189. 2. Divne, A.-M., Edlund, H., and Allen, M. (in press) Forensic analysis of autosomal STR markers using Pyrosequencing. Forensic Sci. Int. Genet. 3. Ballana, E. et al. (2009) Detection of unrecognized low-level mtdna heteroplasmy may explain the variable phenotypic expressivity of apparently homoplasmic mtdna mutations. Hum. Mutat. 29, 257. 14 www.qiagen.com 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011
订 购 信 息 产 品 规 格 货 号 PyroMark Q24 Instrument, software, and installation for Pyrosequencing 9001514 PyroMark Q96 ID Instrument, software, and installation for Pyrosequencing 9001525 PyroMark Q96 MD Instrument, software, and installation for Pyrosequencing 9001526 PyroMark Q96 MD Automated PyroMark Q24 Vacuum Workstation PyroMark Q96 Vacuum Workstation PyroMark Gold Q24 Reagents (5 x 24) PyroMark Gold Q96 Reagents (5 x 96) PyroMark PCR Kit (200) PyroMark Assay Design SW 2.0 PyroMark CpG SW 1.0 PyroMark IdentiFire SW 1.0 EpiTect Bisulfite Kit (48) Instrument, software, and installation for automated Pyrosequencing Workstation for preparing 24 samples in parallel from PCR product to single-stranded template (220V) Workstation for preparing 96 samples in parallel from PCR product to single-stranded template (220V) Enzyme Mixture, Substrate Mixture, and nucleotides for Pyrosequencing reactions on the PyroMark Q24 Enzyme Mixture, Substrate Mixture, and nucleotides for Pyrosequencing reactions on the PyroMark Q96 ID (5 x 96) or PyroMark Q96 MD (15 x 96) For 200 reactions: 2x PyroMark PCR Master Mix (includes HotStarTaq DNA Polymerase and optimized PyroMark Reaction Buffer containing 3 mm MgCl 2 and dntps), 10x CoralLoad Concentrate, 5x Q-Solution, 25 mm MgCl 2, and RNase-Free Water Software for convenient design of PCR and sequencing primers, optimized for Pyrosequencing analysis CpG methylation analysis software for PyroMark Q96 ID and PyroMark Q96 MD Software for comparing and matching Pyrosequencing data to a local database 48 EpiTect Bisulfite Spin Columns, Reaction Mix, DNA Protect Buffer, Carrier RNA, Buffers 9001527 9001518 9001529 970802 972804 978703 9019077 9019067 9019087 95104 可 提 供 更 大 包 装 规 格 ; 请 咨 询 可 提 供 多 种 许 可 软 件 ; 请 咨 询 关 于 最 新 的 许 可 信 息 和 产 品 特 定 的 免 责 声 明, 请 阅 读 相 关 的 QIAGEN 试 剂 盒 手 册 或 操 作 指 南 QIAGEN 试 剂 盒 手 册 和 操 作 指 南 可 在 www.qiagen.com 上 下 载, 或 向 QIAGEN 技 术 服 务 或 当 地 的 经 销 商 索 取 点 击 www.qiagen.com/goto/pyrosequencing, 探 索 序 列 法 检 测 和 定 量 的 更 多 应 用 Trademarks: QIAGEN, EpiTect, HotStarTaq, Pyrosequencing, PyroMark, Pyrogram (QIAGEN Group); Sepharose (GE Healthcare). For up-to-date licensing information and product-specific disclaimers, see the respective QIAGEN kit handbook or user manual. QIAGEN kit handbooks and user manuals are available at www.qiagen.com or can be requested from QIAGEN Technical Services or your local distributor. 2011 QIAGEN, all rights reserved. 表 观 遗 传 及 遗 传 分 析 的 新 标 准 03/2011 Sample & Assay Technologies 15
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