前 言 这 本 实 验 教 材 是 为 生 物 科 学 与 生 物 技 术 专 业 的 细 胞 生 物 学 教 学 而 编 写, 适 用 于 该 专 业 五 年 制 本 科 等 学 生 使 用 细 胞 生 物 学 实 验 课 的 教 学 目 的, 主 要 是 通 过 基 本 技 能 训 练 及 观 察 分 析 实 验 结 果, 使 学 生 了 解 掌 握 有 关 的 实 验 技 术 原 理 和 操 作 方 法, 进 而 提 高 学 生 动 手 实 践 观 察 分 析 和 解 决 问 题 的 能 力 基 于 生 物 技 术 专 业 的 学 生 已 完 成 基 本 的 实 验 操 作 训 练, 本 套 实 验 内 容 自 成 体 系, 着 眼 于 提 高 学 生 的 专 业 技 能 训 练, 及 观 察 分 析 问 题 和 科 学 思 维 能 力 的 培 养 全 部 实 验 采 用 活 细 胞 为 材 料, 由 学 生 自 己 动 手 取 材 和 实 验, 使 学 生 能 对 细 胞 获 得 主 动 的 认 识, 选 编 了 生 物 医 学 常 用 的 细 胞 生 物 学 科 研 技 术, 如 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 细 胞 的 冻 存 与 复 苏 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 基 因 表 达 载 体 的 构 建 基 因 的 表 达 与 定 位 检 测 等, 为 学 生 日 后 的 实 际 科 研 工 作 打 下 基 础 全 书 内 容 共 六 个 实 验, 分 三 次 授 课, 共 计 24 学 时, 与 理 论 课 授 课 内 容 相 辅 相 成, 互 为 补 充 所 有 实 验 由 学 生 自 己 动 手 操 作, 少 数 应 用 大 型 精 密 仪 器 的 内 容 进 行 示 教 本 教 材 由 细 胞 生 物 教 研 室 方 瑾 邵 阳 光 张 惠 丹 李 想 刘 芙 蓉 等 教 师 及 教 辅 人 员 参 与 编 写, 均 具 有 丰 富 的 理 论 和 实 验 课 教 学 经 验 由 于 经 验 不 足, 本 教 材 还 有 很 多 亟 需 改 进 之 处, 敬 请 使 用 者 批 评 指 正 中 国 医 科 大 学 细 胞 生 物 教 研 室 2006 年 9 月

目 录 实 验 一 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 和 计 数 1 实 验 二 细 胞 的 冻 存 与 复 苏 5 实 验 三 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 7 实 验 四 放 线 菌 素 D 诱 导 HL-60 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 11 实 验 五 含 有 目 的 基 因 真 核 表 达 pegfp-c1 载 体 的 构 建 15 实 验 六 目 的 基 因 在 真 核 系 统 中 的 表 达 及 细 胞 内 的 定 位 24

实 验 一 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 和 计 数 实 验 目 的 1. 了 解 培 养 中 的 动 物 细 胞 的 一 般 形 态 和 生 长 状 态 2. 掌 握 细 胞 计 数 的 基 本 方 法 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 培 养 中 HeLa 细 胞 NIH3T3 HL60 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 倒 置 显 微 镜 细 胞 计 数 板 普 通 光 学 显 微 镜 乳 头 吸 管 盖 片 3. 试 剂 0.3% 台 盼 兰 染 液 0.25% 胰 蛋 白 酶 -0.02%EDTA 混 合 消 化 液 实 验 原 理 体 外 培 养 的 细 胞 主 要 有 两 种 状 态 一 种 是 能 贴 附 在 培 养 支 持 物 上 的 细 胞, 如 HeLa 细 胞 NIH3T3 等, 叫 贴 壁 型 细 胞, 体 外 培 养 的 细 胞 大 多 属 于 这 种 细 胞 另 一 种 细 胞 并 不 贴 附 在 容 器 的 壁 上, 而 是 悬 浮 在 培 养 液 中 生 长, 如 HL60 细 胞, 叫 做 悬 浮 型 细 胞, 这 类 细 胞 主 要 是 血 液 原 性 或 癌 原 性 细 胞 在 细 胞 生 物 学 的 实 验 中, 往 往 要 进 行 活 细 胞 的 鉴 定 和 细 胞 的 计 数 调 整 细 胞 的 密 度, 是 进 行 实 验 不 可 缺 少 的 一 种 基 本 技 能 实 验 内 容 一 培 养 细 胞 形 态 观 察 1. 将 细 胞 培 养 瓶 从 37ºC 二 氧 化 碳 培 养 箱 ( 或 温 箱 ) 中 取 出, 瓶 口 稍 稍 向 上 倾 斜 以 免 瓶 内 液 体 接 触 瓶 塞 或 流 出 瓶 口, 注 意 观 察 细 胞 培 养 液 的 颜 色 和 清 澈 度 然 后, 将 细 胞 培 养 瓶 平 稳 地 放 在 倒 置 显 微 镜 载 物 台 上 2. 打 开 倒 置 镜 光 源, 用 10X 物 镜 观 察, 通 过 双 筒 目 镜 将 视 野 调 到 合 适 的 亮 度, 并 调 节 双 目 镜 的 光 瞳 间 距, 使 左 右 两 个 视 场 象 合 而 为 一 3. 调 节 载 物 台 高 度 进 行 对 焦, 在 看 到 细 胞 层 之 后, 用 细 调 节 器 将 物 像 调 清 楚, 注 意 观 察 细 胞 的 轮 廓 形 状 和 内 部 结 构 在 观 察 时, 经 常 使 用 的 是 十

倍 的 物 镜 4. 结 果 贴 壁 细 胞 一 般 有 两 种 形 态, 即 上 皮 细 胞 型 和 成 纤 维 细 胞 型 细 胞 上 皮 细 胞 型 细 胞 呈 扁 平 的 不 规 则 多 角 形, 圆 形 核 位 于 中 央, 生 长 时 常 彼 此 紧 密 连 接 成 单 层 细 胞 片, 如 HeLa 细 胞 成 纤 维 细 胞 型 细 胞 形 态 与 体 内 成 纤 维 细 胞 形 态 相 似, 胞 体 呈 梭 形 或 不 规 则 三 角 形, 中 央 有 卵 圆 形 核, 胞 质 向 外 伸 出 2~3 个 长 短 不 同 的 突 起, 细 胞 群 常 借 原 生 质 突 连 接 成 网, 细 胞 生 长 时 多 呈 放 射 状 或 漩 涡 状, 如 NIH3T3 贴 壁 细 胞 在 生 长 状 态 良 好 时, 细 胞 均 质 而 透 明, 细 胞 内 颗 粒 少, 看 不 到 空 泡, 细 胞 边 缘 清 楚, 培 养 基 内 看 不 到 悬 浮 的 细 胞 和 碎 片, 培 养 液 清 澈 透 明, 而 当 细 胞 内 颗 粒 较 多, 透 明 差, 空 泡 多, 细 胞 轮 廓 增 强 反 差 较 大 时, 表 明 细 胞 机 能 状 态 不 良, 生 长 较 差 当 培 养 瓶 内 培 养 基 混 浊 时, 应 想 到 细 菌 真 菌 污 染 的 可 能 悬 浮 细 胞 边 缘, 透 明 发 亮 时, 生 长 较 好 ; 反 之, 则 较 差 或 已 死 亡 由 于 培 养 基 内 有 PH 指 示 剂 的 存 在, 因 此 它 的 颜 色 往 往 可 以 间 接 地 表 明 细 胞 的 生 长 状 态 呈 橙 黄 色 时, 细 胞 一 般 生 长 状 态 较 好 ; 呈 淡 黄 色 时, 则 可 能 是 培 养 时 间 过 长, 营 养 不 足, 死 亡 细 胞 过 多 ; 如 呈 紫 红 色, 则 可 能 是 细 胞 生 长 状 态 不 好, 或 已 死 亡 实 际 上 一 种 细 胞 在 培 养 中 的 形 态 并 不 是 永 恒 不 变 的, 它 随 营 养 PH 生 长 周 期 而 改 变, 但 在 比 较 稳 定 的 条 件 下 形 态 是 基 本 一 致 的 在 贴 壁 细 胞 的 培 养 中, 镜 下 折 光 率 高, 圆 而 发 亮 的 一 般 被 认 为 是 分 裂 期 细 胞 肿 瘤 细 胞 有 重 叠 生 长 的 特 征 二 培 养 细 胞 的 计 数 及 活 细 胞 的 鉴 定 1. 准 备 计 数 板 用 95% 酒 精 棉 球 擦 干 净 计 数 板, 把 盖 片 覆 在 计 数 板 上 面 2. 制 备 细 胞 悬 液 将 培 养 瓶 中 的 培 养 液 倒 入 干 净 试 管 中, 向 培 养 瓶 中 加 入 0.25% 胰 蛋 白 酶 -0.02%EDTA 混 合 消 化 液 1ml, 静 置 3~5 分 钟, 待 见 到 细 胞 变 圆, 彼 此 不 连 接 为 止 将 试 管 中 的 培 养 液 倒 回 培 养 瓶 中, 并 轻 轻 进 行 吹 打, 制 成 细 胞 悬 液 3. 染 色 取 细 胞 悬 液 0.5ml, 加 入 0.3% 台 盼 兰 染 液 0.5ml, 混 合 后 染 色 3~5 分 钟 4. 滴 加 悬 液

将 悬 液 摇 匀 后, 沿 盖 片 边 缘 缓 缓 滴 加 少 许 已 染 色 的 细 胞 悬 液 于 细 胞 计 数 板 的 斜 面 上, 使 液 体 自 然 充 满 整 个 计 数 室 小 室 内 有 气 泡 或 液 体 过 多 使 盖 片 漂 移 时, 要 重 新 滴 加 5. 计 数 在 普 通 光 学 显 微 镜 10X 物 镜 下 计 数 四 个 大 格 内 的 细 胞 数, 压 线 者 数 上 不 数 下, 数 左 不 数 右 6. 结 果 按 下 式 进 行 细 胞 浓 度 的 计 算 : 4 大 格 中 细 胞 总 数 10 41 稀 释 倍 数 = 细 胞 数 /ml 悬 液 4 4 大 格 中 细 胞 总 数 - 染 色 细 胞 数 10 42 稀 释 倍 数 = 活 细 胞 数 /ml 悬 液 4 注 1 由 于 四 大 格 中 每 一 大 格 体 积 为 0.1mm 3,1ml=10,000 大 格, 因 此,1 大 格 细 胞 数 10 4 = 细 胞 数 /ml 注 2 染 色 标 本 在 15 分 钟 内 计 数, 因 为 台 盼 兰 染 液 可 使 死 细 胞 迅 速 染 色, 拖 延 计 数 时 间 活 细 胞 也 被 着 色 进 行 细 胞 计 数 时 应 力 求 准 确, 因 此, 在 科 研 中, 往 往 将 计 数 板 两 侧 都 加 上 细 胞 悬 液, 并 同 时 滴 加 几 块 计 数 板 ( 或 反 复 滴 加 一 块 计 数 板 数 次 ), 最 后 取 计 数 的 平 均 值 作 业 一 下 面 是 某 贴 壁 细 胞 培 养 数 天 后 观 察 计 数 的 结 果 : 瓶 培 养 基 镜 下 观 察 计 数 清 晰 度 颜 色 细 胞 界 限 胞 内 颗 粒 空 泡 碎 片 总 死 甲 混 浊 黄 不 清 多 多 大 满 视 野 6 10 4 5 10 4 乙 清 橙 黄 清 楚 少 少 无 9 10 4 2 10 2 丙 清 黄 清 楚 较 多 有 有 2 10 6 5 10 4 丁 清 紫 红 不 清 多 多 多 2 10 4 1 10 4

1. 根 据 上 表 分 析 各 瓶 细 胞 的 生 长 情 况 : A 细 胞 生 长 状 态 良 好 ; B 培 养 时 间 太 短 ; C 细 胞 污 染 可 能 性 大 ; D 细 胞 与 环 境 生 长 不 适 ; E 细 胞 营 养 不 足 甲 ( ) 乙 ( ) 丙 ( ) 丁 ( ) 2. 根 据 你 的 判 断 应 采 取 的 措 施 是 : A 将 细 胞 弃 去 ; B 立 即 换 新 鲜 培 养 液 ; C 立 即 传 代 ; D 放 置 继 续 观 察 ; E 换 到 新 的 培 养 瓶 中 甲 ( ) 乙 ( ) 丙 ( ) 丁 ( ) 二 作 图 将 你 观 察 到 的 培 养 细 胞 作 一 草 图 三 计 算 将 你 计 算 的 每 毫 升 悬 液 中 的 细 胞 总 数, 死 活 细 胞 的 百 分 比 例 计 算 出 来

实 验 目 的 1. 了 解 冻 存 与 复 苏 的 原 理 ; 实 验 二 细 胞 的 冻 存 与 复 苏 2. 熟 悉 细 胞 冻 存 与 复 苏 的 方 法 步 骤 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 对 数 生 长 期 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 吸 管, 离 心 管, 冻 存 管 ( 塑 料 活 玻 璃 安 瓶 ), 培 养 瓶, 记 号 笔, 纱 布 小 口 袋, 温 度 计, 砂 轮 3. 试 剂 消 化 液, 培 养 液, 甘 油 ( 优 质 无 色 或 DMSO), 75% 酒 精, 热 水 实 验 原 理 目 前 长 时 间 保 存 细 胞 的 方 法 是 将 细 胞 低 温 冻 结 保 存 在 液 氮 中 (-196 ), 保 存 时 间 可 长 达 一 年 甚 至 几 年, 用 时 解 冻, 大 多 数 细 胞 仍 能 生 长 繁 殖, 为 妥 善 起 见, 细 胞 冻 存 一 年 后 应 复 苏 培 养 后 再 冻 存 冻 存 细 胞 时 应 加 入 保 护 剂, 否 则, 细 胞 内 外 的 水 会 结 成 冰 晶, 使 细 胞 发 生 机 械 损 伤 加 入 保 护 剂 后, 可 使 冰 点 降 低, 在 缓 慢 冻 结 的 条 件 下, 细 胞 内 的 水 分 在 冻 结 前 渗 出 到 细 胞 外, 避 免 冰 晶 的 损 伤 目 前 常 用 的 保 护 剂 为 甘 油 和 二 甲 基 亚 砜 (DMSO), 它 们 对 细 胞 无 毒, 分 子 量 小 溶 解 度 大, 易 穿 透 细 胞, 使 用 浓 度 甘 油 为 10%~20%, 二 甲 基 亚 砜 5%~15%, 常 用 为 10% 另 外, 冻 存 液 中 还 要 加 入 培 养 液, 以 提 供 营 养, 渗 透 压,pH 细 胞 复 苏 指 融 化 冻 存 的 细 胞, 重 新 培 养 解 冻 细 胞 速 度 要 快, 使 之 迅 速 通 过 最 易 损 伤 的 -5~0 实 验 内 容 一 细 胞 冻 存 1. 细 胞 悬 液 制 备

选 对 数 生 长 期 细 胞,10ml 培 养 瓶 面, 几 乎 成 单 层 时 可 冻 存 一 管 ; 收 集 细 胞 24 小 时 前 换 液 一 次 ; 按 传 代 方 法 制 成 细 胞 悬 液 2. 收 集 细 胞 将 细 胞 悬 液 移 入 无 菌 离 心 管 中,1000rpm, 离 心 5 分 钟, 去 上 清 3. 冻 存 液 将 培 养 液 和 甘 油 按 9:1 的 比 例 配 成 10% 的 冻 存 液, 取 1~1.5ml 到 离 心 管 中, 轻 轻 吹 打 使 细 胞 悬 混 4. 装 瓶 用 吸 管 吸 取 细 胞 悬 液 1.5ml, 装 入 安 瓶 中, 尽 量 不 使 液 体 碰 到 安 瓶 口 5. 封 口 将 安 瓶 在 火 焰 最 热 处 封 好, 如 用 冻 存 管 将 盖 儿 拧 紧 即 可 6. 标 记 用 记 号 笔 记 好 细 胞 名 称, 冻 存 年 月 日 7. 冻 结 和 保 存 将 安 瓶 装 在 纱 布 袋 中, 置 4 2~4 小 时,-20 2~4 小 时, 液 氮 的 气 相 部 分 -130 ~-180, 浸 入 液 氮 液 氮 量 一 定 要 充 分, 以 使 温 度 恒 定 二 细 胞 复 苏 1. 用 大 镊 子 取 出 液 氮 中 的 安 瓶, 投 入 盛 有 37~42 的 水 中, 不 时 摇 动, 使 之 快 速 通 过 -5~0 2. 在 超 净 台 中, 用 砂 轮 擦 安 瓶 颈 并 用 酒 精 棉 球 消 毒, 打 开 安 瓶, 吸 出 细 胞 悬 液 装 入 培 养 瓶 中, 并 以 10 稀 释, 放 CO 2 培 养 箱 中 进 行 培 养, 第 二 天 换 新 鲜 培 养 液, 以 换 掉 冻 存 剂

实 验 目 的 1. 了 解 原 代 培 养 的 原 理 实 验 三 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 ( 一 ) 细 胞 的 原 代 培 养 2. 初 步 掌 握 哺 乳 动 物 细 胞 的 原 代 培 养 的 基 本 操 作 过 程, 为 生 物 工 程 在 医 学 上 的 应 用 打 下 基 础 3. 掌 握 无 菌 操 作 技 术 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 胎 大 鼠 2. 器 材 和 仪 器 手 术 器 械, 平 皿, 培 养 瓶, 吸 管, 离 心 管 灭 菌 后 备 用 ; 煤 气 灯, 烧 杯, 超 净 工 作 台, 二 氧 化 碳 培 养 箱, 倒 置 显 微 镜 3. 试 剂 含 10% 小 牛 血 清 的 1640 培 养 液,0.01mol/LPBS,0.25% 胰 蛋 白 酶 -0.02 %EDTA 混 合 消 化 液,75% 乙 醇 实 验 原 理 细 胞 培 养 (Cell culture) 是 模 拟 机 体 内 生 理 条 件, 将 细 胞 从 机 体 中 取 出, 在 人 工 条 件 下 使 其 生 存 生 长 繁 殖 和 传 代, 进 行 细 胞 生 命 过 程 细 胞 癌 变 细 胞 工 程 等 问 题 的 研 究 近 年 来, 广 泛 地 应 用 于 分 子 生 物 学 遗 传 学 免 疫 学 肿 瘤 学 细 胞 工 程 等 领 域, 发 展 成 一 种 重 要 生 物 技 术, 并 取 得 显 著 成 就 由 体 内 直 接 取 出 组 织 或 细 胞 进 行 培 养 叫 原 代 培 养 原 代 培 养 细 胞 离 体 时 间 短, 性 状 与 体 内 相 似, 适 用 于 研 究 一 般 说 来, 幼 稚 状 态 的 组 织 和 细 胞, 如 : 动 物 的 胚 胎 幼 仔 的 脏 器 等 更 容 易 进 行 原 代 培 养 实 验 内 容 1. 取 材 用 颈 椎 脱 位 法 使 胎 大 鼠 迅 速 死 亡 然 后, 把 整 个 动 物 浸 入 盛 有 75% 乙 醇 的 烧 杯 中 数 秒 钟 消 毒, 取 出 后 放 在 大 平 皿 中 携 入 超 净 台 用 消 过 毒 的

剪 刀 剪 开 用 碘 酒 和 乙 醇 再 次 消 毒 后 的 皮 肤, 剖 腹 取 出 肝 脏 或 肾 脏, 置 于 无 菌 平 皿 中 2. 切 割 用 灭 菌 的 PBS 液 将 取 出 的 脏 器 清 洗 三 次, 然 后 用 眼 科 手 术 剪 刀 仔 细 将 组 织 反 复 剪 碎, 直 到 成 1mm 3 左 右 的 小 块, 再 用 PBS 清 洗, 洗 到 组 织 块 发 白 为 止 移 入 无 菌 离 心 管 中, 静 置 数 分 钟, 使 组 织 块 自 然 沉 淀 到 管 底, 弃 去 上 清 3. 消 化 接 种 培 养 吸 取 0.25% 胰 蛋 白 酶 一 0.02%EDTA 混 合 消 化 液 1ml, 加 入 离 心 管 中, 与 组 织 块 混 匀 后, 加 上 管 口 塞 子,37 水 浴 中 消 化 8~10 分 钟, 每 隔 几 分 钟 摇 动 一 下 试 管, 使 组 织 与 消 化 液 充 分 接 触, 静 止, 吸 去 上 清, 向 离 心 管 中 加 入 5~10ml 含 10% 小 牛 血 清 的 1640 培 养 基, 用 吸 管 吹 打 混 匀, 移 入 二 个 培 养 瓶 中, 置 于 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 培 养 4. 结 果 细 胞 接 种 后 一 般 几 小 时 内 就 能 贴 壁, 并 开 始 生 长, 如 接 种 的 细 胞 密 度 适 宜,5 天 到 一 周 即 可 形 成 单 层 实 验 目 的 1. 了 解 传 代 培 养 的 原 理 及 一 般 方 法 2. 熟 悉 传 代 培 养 的 操 作 步 骤 3. 进 一 步 掌 握 无 菌 操 作 技 术 ( 二 ) 细 胞 的 传 代 培 养 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 原 代 培 养 的 HeLa 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 培 养 瓶, 吸 管, 离 心 管 灭 菌 后 备 用 ; 煤 气 灯, 超 净 工 作 台, 二 氧 化 碳 培 养 箱, 倒 置 显 微 镜 3. 试 剂 含 10% 小 牛 血 清 的 1640 培 养 液,0.01mol/LPBS,0.25% 胰 蛋 白 酶 -0.02 %EDTA 混 合 消 化 液

实 验 原 理 体 外 培 养 的 原 代 细 胞 或 细 胞 株 要 在 体 外 持 续 地 培 养 就 必 须 传 代, 以 便 获 得 稳 定 的 细 胞 株 或 得 到 大 量 的 同 种 细 胞, 并 维 持 细 胞 种 的 延 续 培 养 的 细 胞 形 成 单 层 汇 合 以 后, 由 于 密 度 过 大 生 存 空 间 不 足 而 引 起 营 养 枯 竭, 将 培 养 的 细 胞 分 散, 从 容 器 中 取 出, 以 1:2 或 l:3 以 上 的 比 率 转 移 到 另 外 的 容 器 中 进 行 培 养, 即 为 传 代 培 养 细 胞 一 代 指 从 细 胞 接 种 到 分 离 再 培 养 的 一 段 期 间, 与 细 胞 世 代 或 倍 增 不 同 在 一 代 中, 细 胞 培 增 3~6 次 细 胞 传 代 后, 一 般 经 过 三 个 阶 段 : 游 离 期 指 数 增 生 期 和 停 止 期 常 用 细 胞 分 裂 指 数 表 示 细 胞 增 殖 的 旺 盛 程 度, 即 细 胞 群 的 分 裂 相 数 / 100 个 细 胞 一 般 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.2%~0.5%, 肿 瘤 细 胞 可 达 3~5% 细 胞 接 种 2~3 天 分 裂 增 殖 旺 盛, 是 活 力 最 好 时 期, 称 指 数 增 生 期 ( 对 数 生 长 期 ), 适 宜 进 行 各 种 试 验 实 验 内 容 1. 将 长 成 单 层 的 原 代 培 养 细 胞 或 HeLa 细 胞 从 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 取 出, 在 超 净 工 作 台 中 倒 掉 瓶 内 的 培 养 液, 加 入 少 许 消 化 液 ( 以 液 面 盖 住 细 胞 为 宜 ), 静 置 5~10 分 钟 2. 在 倒 置 镜 下 观 察 被 消 化 的 细 胞, 如 果 细 胞 变 圆, 相 互 之 间 不 再 连 接 成 片, 这 时 应 立 即 在 超 净 台 中 将 消 化 液 倒 掉, 加 入 3~5ml 新 鲜 培 养 液, 吹 打, 制 成 细 胞 悬 液 3. 将 细 胞 悬 液 吸 出 2ml 左 右, 加 到 另 一 个 培 养 瓶 中 并 向 每 个 瓶 中 分 别 加 3ml 左 右 培 养 液, 盖 好 瓶 塞, 送 回 二 氧 化 碳 培 养 箱 中, 继 续 进 行 培 养 4 结 果 一 般 情 况, 传 代 后 的 细 胞 在 2 小 时 左 右 就 能 附 着 在 培 养 瓶 壁 上,2~4 天 就 可 在 瓶 内 形 成 单 层, 需 要 再 次 进 行 传 代 ( 三 ) 器 材 及 液 体 的 准 备 和 无 菌 操 作 的 注 意 事 项 1. 器 材 和 液 体 的 准 备 细 胞 培 养 用 的 玻 璃 器 材, 如 : 培 养 瓶 吸 管 等 在 清 洗 干 净 以 后, 装 在 铝 盒 和 铁 筒 中,120,2 小 时 干 烤 灭 菌 后 备 用 ; 手 术 器 材 瓶 塞 配 制 好

的 PBS 液 用 灭 菌 锅 15 磅,20 分 钟 蒸 气 灭 菌 ;1640 培 养 液 小 牛 血 清 消 化 液 用 G6 滤 器 负 压 抽 滤 后 备 用 2. 无 菌 操 作 中 的 注 意 事 项 在 无 菌 操 作 中, 一 定 要 保 持 工 作 区 的 无 菌 清 洁 为 此, 在 操 作 前 要 认 真 地 洗 手 并 用 75% 乙 醇 消 毒 操 作 前 20~30 分 钟 起 动 超 净 台 吹 风 操 作 时, 严 禁 说 话, 严 禁 用 手 直 接 拿 无 菌 的 物 品, 如 瓶 塞 等, 而 要 用 器 械, 如 止 血 钳 镊 子 等 去 拿 培 养 瓶 要 在 超 净 台 内 才 能 打 开 瓶 塞, 打 开 之 前 用 乙 醇 将 瓶 口 消 毒, 打 开 后 和 加 塞 前 瓶 口 都 要 在 酒 精 灯 上 烧 一 下, 打 开 瓶 口 后 的 操 作 全 部 都 要 在 超 净 台 内 完 成 操 作 完 毕 后, 加 上 瓶 塞, 才 能 拿 到 超 净 台 外 使 用 的 吸 管 在 从 消 毒 的 铁 筒 中 取 出 后 要 手 拿 末 端, 将 尖 端 在 火 上 烧 一 下, 戴 上 胶 皮 乳 头, 然 后 再 去 吸 取 液 体 总 之, 在 整 个 无 菌 操 作 过 程 中 都 应 该 在 酒 精 灯 的 周 围 进 行 作 业 1. 原 代 细 胞 和 传 代 细 胞 培 养 有 哪 些 区 别? 2. 怎 样 才 能 既 迅 速, 又 保 证 无 菌 操 作

实 验 四 放 线 菌 素 D 诱 导 HL-60 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 实 验 目 的 1. 掌 握 基 因 组 DNA 提 取 方 法 2. 掌 握 凋 亡 细 胞 DNA 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 过 程 和 染 色 方 法 3. 熟 悉 DNA 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 的 带 形 4. 了 解 凋 亡 细 胞 的 形 态 及 生 化 特 征 5. 熟 悉 Hoechst33258 及 Giemsa 染 色 方 法 6. 熟 悉 荧 光 显 微 镜 下 凋 亡 细 胞 的 形 态 变 化 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 HL-60 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 微 量 加 样 器 枪 头 离 心 管 三 角 烧 瓶 电 泳 仪 电 泳 槽 高 速 冷 冻 离 心 机 水 浴 锅 涡 流 振 荡 器 微 波 炉 紫 外 透 射 仪 载 玻 片 3. 试 剂 放 线 菌 素 D 琼 脂 糖 TAE( 电 泳 缓 冲 液 ) 异 丙 醇 70% 乙 醇 DNA 提 纯 试 剂 盒 ( Nuclei lysis solution, RNAase solution, protein precipitation solution, DNA rehydration solution) DNA marker 溴 化 乙 锭 (EB) 6 loading buffer 染 液,Giemsa 染 液 工 作 液, 甲 醇,PBS 液 等 实 验 原 理 放 线 菌 素 D(actinomycin D) 是 抗 肿 瘤 类 抗 生 素, 其 主 要 作 用 是 通 过 与 DNA 结 合, 阻 断 依 赖 DNA 的 mrna 的 合 成, 从 而 阻 碍 蛋 白 质 合 成, 抑 制 瘤 细 胞 分 裂, 引 起 细 胞 凋 亡 细 胞 凋 亡 时, 其 核 染 色 质 的 DNA 出 现 缺 口 甚 至 断 裂, 致 使 染 色 质 凝 聚 边 缘 化 甚 至 呈 现 DNA 碎 片 利 用 与 DNA 结 合 的 荧 光 染 料 染 色 后, 在 荧 光 显 微 镜 下 即 可 观 察 到 上 述 变 化 Hoechst33258 为 与 A-T 结 合 的 特 异 性 DNA 染 料, 对 活 细 胞 和 固 定 细 胞 均 能 染 色 实 验 内 容

一 细 胞 基 因 组 DNA 提 取 1. 药 物 处 理 : 取 处 于 对 数 生 长 期 的 HL-60 细 胞 (5 10 5 个 /ml) 加 入 放 线 菌 素 D 至 终 浓 度 5ug/ml,37 孵 育 20 小 时 2. 收 集 细 胞 :4,1500 g, 离 心 5min, 弃 上 清 3. 清 洗 细 胞 : 加 入 600ulPBS 重 悬 细 胞,1500 g, 离 心 5min, 弃 上 清 4. 加 入 600ul Nuclei lysis solution, 来 回 吸 打 数 次 5. 加 入 3ul RNAase solution, 颠 倒 离 心 管 5 次, 混 合 样 品 6.37, 水 浴 30min, 室 温 静 置 5min 7. 加 入 200ul protein precipitation solution, 涡 振 20sec, 置 冰 中 5min 8.4,13000 g 离 心 5min 小 心 吸 上 清 于 另 一 离 心 管 中 9. 向 上 清 液 中 加 入 600ul 异 丙 醇, 颠 倒 混 合 4,13000 g, 离 心 5min 弃 上 清, 收 集 沉 淀 DNA 10. 加 入 600ul 70% 乙 醇, 颠 倒 数 次, 清 洗 DNA 4,13000 g, 离 心 2min 小 心 弃 上 清, 室 温 干 燥 沉 淀 10-15min 11. 加 入 10ul DNA rehydration solution,65, 水 浴 30-60min, 并 定 期 轻 柔 振 荡 离 心 管 使 沉 淀 溶 解 12. 溶 解 液 ( 即 DNA 提 取 样 品 )4 保 存 备 用 二 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 细 胞 凋 亡 1. 灌 制 琼 脂 糖 凝 胶 (1) 备 好 注 胶 槽, 插 上 梳 子 称 1g 琼 脂 糖, 加 100mlTAE, 微 波 炉 加 热 溶 解 (2) 向 胶 槽 中 注 入 温 热 的 1% 琼 脂 糖 胶, 胶 层 厚 度 约 3-5mm (3) 室 温 静 置 30-45min, 使 琼 脂 糖 胶 完 全 凝 结 小 心 拔 出 梳 子, 将 凝 胶 放 入 电 泳 槽, 使 梳 孔 端 靠 近 阴 极 ( 黑 色 ) (4) 向 电 泳 槽 中 加 入 TAE, 让 液 面 刚 好 没 过 凝 胶 约 1mm 2. 加 样, 电 泳 (1) 在 蜡 膜 上 分 别 加 3 滴 6 loading buffer, 每 滴 2ul (2) 从 4 冰 箱 中 取 出 制 备 好 的 未 经 放 线 菌 素 D 和 经 放 线 菌 素 D 处 理 的 DNA 样 品 各 10ul, 加 入 到 loading buffer 中 在 余 下 的 一 滴 loading buffer 中 加 5ul DNA marker 和 5ul 灭 菌 去 离 子 水, 反 复 吸 打, 充

分 混 合 (3) 用 加 样 器 分 别 把 上 述 样 品 缓 慢 加 至 琼 脂 糖 凝 胶 的 加 样 孔 中 (4) 盖 上 电 泳 槽 盖, 接 好 电 极 插 头, 打 开 电 源, 电 压 调 至 100-110V, 电 泳 45-60min (5) 将 电 压 调 至 零, 关 电 源, 拔 出 电 极 插 头, 打 开 电 泳 槽 盖 3. 染 色 观 察 (1) 取 出 凝 胶, 放 入 含 有 EB(0.5ug/ml) 的 溶 液 中, 室 温 浸 染 20min (2) 于 暗 室 中, 在 紫 外 灯 下 进 行 观 察 (3) 染 色 结 果 : 经 放 线 菌 素 D 处 理 的 细 胞 在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 呈 现 阶 梯 状 DNA 区 带 图 谱 (DNA ladder), 这 是 细 胞 凋 亡 的 重 要 生 化 特 征 而 未 经 处 理 的 细 胞 则 没 有 DNA 凋 亡 所 特 有 的 梯 形 条 带 DNA 断 裂 情 况 可 与 对 照 比 较, 断 裂 程 度 用 DNAmarker 所 显 条 带 度 量 三 凋 亡 细 胞 普 通 光 镜 下 形 态 观 察 Giemsa 染 色 法 1. 收 集 凋 亡 细 胞 悬 液 于 1.5ml 离 心 管 中,4,500rpm, 离 心 5min 2. 弃 上 清, 将 细 胞 重 悬 于 PBS 液 中, 制 成 细 胞 悬 液 3. 取 100ml 细 胞 悬 液, 涂 于 载 玻 片 上, 晾 干 4. 用 甲 醇 固 定 1min, 充 分 晾 干 5. 滴 加 Giemsa 染 液 ( 工 作 液 浓 度 ), 室 温 染 色 5min. 6. 用 流 水 轻 轻 洗 去 染 液, 室 温 晾 干 7. 用 二 甲 苯 浸 泡 3min, 去 除 杂 质, 待 载 片 透 明 后, 以 树 脂 封 片 8. 普 通 纤 维 镜 下 观 察 9. 结 果 观 察 :Giemsa 染 色 的 标 本, 细 胞 核 红 紫 色, 细 胞 质 蓝 色, 凋 亡 细 胞 的 核 染 色 质 固 缩 边 集, 染 色 较 深 或 核 破 裂 ; 细 胞 膜 皱 褶 卷 曲, 或 出 泡 芽 生, 形 成 凋 亡 小 体 四 凋 亡 细 胞 的 荧 光 显 微 镜 下 形 态 观 察 1. 培 养 细 胞, 诱 导 凋 亡 ( 在 超 净 台 进 行 ) 2. 收 集 细 胞 :1000g/min 离 心 5min, 其 上 清 3. PBS(37 ) 漂 洗 悬 浮 细 胞 4. 固 定 液 (4 ) 固 定 5min,500~1000g/min 离 心 5min, 弃 上 清 5. 蒸 馏 水 洗,500~1000g/min 离 心 5min, 弃 上 清

6. 调 整 细 胞 数 至 0.5~0.2 10 6 /ml 7. 取 100µl 细 胞 悬 液, 加 入 1µl Hoechst33258 染 液, 染 色 10min 8. 将 10µl 染 色 的 悬 浮 细 胞 涂 于 载 玻 片, 加 盖 玻 片 9. 放 于 荧 光 显 微 镜 下 观 察 选 用 UV 激 发 滤 片 和 400-500nm 阻 断 滤 片 10. 结 果 观 察 : 细 胞 核 呈 蓝 色 凋 亡 细 胞 的 核 染 色 质 凝 聚 且 边 缘 化, 或 玻 珠 化, 并 可 呈 现 DNA 荧 光 碎 片 注 意 事 项 1. 对 大 片 段 DNA 不 能 振 荡, 应 轻 轻 反 复 翻 动 离 心 管, 以 免 机 械 剪 切 力 损 伤 DNA 链 2. 收 集 沉 淀 DNA( 特 别 是 凋 亡 细 胞 的 DNA) 时 需 格 外 小 心 ; 3. 样 品 加 入 样 孔 的 位 置 应 该 合 适 ; 4. 溴 化 乙 锭 为 较 强 的 致 突 变 剂, 应 带 乳 胶 手 套 操 作 ; 5. 紫 外 光 能 损 伤 眼 睛, 不 要 直 视 光 源 ; 6. 污 染 物 须 放 入 专 用 容 器 内, 妥 善 处 理 7.Hoechst33258 染 液 应 4 避 光 保 存 学 生 作 业 请 简 述 细 胞 凋 亡 的 生 化 特 征

实 验 五 含 有 目 的 基 因 真 核 表 达 pegfp-c1 载 体 的 构 建 一 PCR 反 应 扩 增 目 的 基 因 片 段 实 验 原 理 以 DNA 为 模 板, 在 4 种 核 苷 酸 存 在 的 条 件 下, 借 助 DNA 聚 合 酶 作 用 出 现 的 酶 促 合 成, 依 赖 于 在 加 热 条 件 下, 双 链 DNA 解 离 成 单 链 ( 变 性 ), 降 温 ( 复 性 ), 使 引 物 与 单 链 特 异 性 结 合, 同 时 使 4 种 核 苷 酸 在 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 发 生 以 引 物 为 起 点 进 行 聚 合 的 现 象, 使 DNA 链 不 断 延 伸, PCR 反 应 进 行 反 应 步 骤 包 括 : 变 性 ( 常 规 采 用 94 高 温 条 件 下 使 待 扩 增 的 模 板 DNA 氢 键 断 裂, 解 链 成 为 单 链 模 板 ) 退 火 ( 人 工 合 成 的 引 物 在 低 温 下 分 别 与 模 板 DNA 单 链 形 成 杂 交 链 ) 延 伸 ( 在 72 条 件 下,DNA 聚 合 酶 将 单 核 苷 酸 在 引 物 3' 端 掺 入, 延 模 板 3' 5' 方 向 延 伸, 合 成 新 的 DNA 链 ) 以 上 三 步 反 应 构 成 一 个 周 期, 每 一 周 期 产 生 的 DNA 均 可 成 为 下 一 个 循 环 的 模 板, PCR 产 物 以 指 数 方 式 增 加 实 验 材 料 质 粒 ( 模 板 ); Taq DNA 聚 合 酶 ; 引 物 ; dntp 混 合 物 ; PCR Buffer( Mg 2+ ); PCR 扩 增 仪 等 实 验 方 法 1. 按 下 列 组 分 配 制 PCR 反 应 液 : 10 PCR Buffer( Mg 2+ Plus) dntp 混 合 物 ( 各 2.5mM) 模 板 DNA( 质 粒 ) 引 物 1( 20uM) 引 物 2( 20uM) Taq DNA polymerase( 5U/ul) ddh 2 O 5 μl 4 μl 1 μl 1 μl 1 μl 0.25μl 37.75 μl

2. PCR 反 应 条 件 95 5min 95 30sec 55 30sec 30 Cycles 72 1min 72 10min 4 forever 3. 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 结 果 共 50μl 注 意 事 项 PCR 反 应 液 在 冰 中 配 制, 然 后 置 于 PCR 反 应 仪 上 进 行 PCR 反 应, 这 样 可 增 强 PCR 扩 增 的 特 异 性, 减 少 PCR 过 程 中 的 非 特 异 性 反 应, 能 得 到 良 好 的 PCR 结 果

二 凝 胶 回 收 PCR 反 应 片 段 实 验 原 理 从 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 中 回 收 纯 化 DNA 片 段 的 试 剂 盒 试 剂 盒 采 用 了 独 特 的 凝 胶 融 解 系 统, 结 合 DNA 制 备 膜 技 术, 具 有 高 效 快 速 的 特 点 本 试 剂 盒 纯 化 DNA 片 段 纯 度 高, 完 整 性 好 可 直 接 用 于 连 接 反 应, PCR 扩 增 实 验 材 料 PCR 产 物 电 泳 后 目 的 DNA 片 段 ; Biospin 胶 回 收 试 剂 盒 等 实 验 方 法 1. 将 含 有 目 的 DNA 片 段 的 琼 脂 糖 凝 胶 切 下, 并 放 入 2.0 ml 离 心 管 中 2. 按 1:3 的 比 例 ( 凝 胶 质 量 毫 克 数 : 融 胶 液 体 积 微 升 数 ) 加 入 Extraction Buffer ( 每 次 加 入 的 Extraction Buffer 最 大 体 积 不 宜 超 过 1.2ml) 例 如 :100mg 凝 胶 应 加 入 300μlExtraction Buffer 3. 于 恒 温 水 浴 或 金 属 浴 中 55 孵 育, 直 到 凝 胶 融 化 低 熔 点 凝 胶 可 于 50 孵 育, 一 般 孵 育 时 间 不 多 于 10 分 钟, 孵 育 过 程 中 每 隔 2-3 分 钟 混 匀 一 次 4. 可 选 : 按 1:1 的 比 例 ( 凝 胶 质 量 毫 克 数 : 异 丙 醇 体 积 微 升 数 ) 加 入 异 丙 醇, 并 混 合 均 匀 一 般 大 于 120bpDNA 片 段, 不 需 要 加 异 丙 醇 5. 将 混 合 液 全 部 转 移 到 Spin column 内, 于 6,000g 离 心 1 分 钟, 并 弃 去 接 液 管 内 液 体 如 混 合 液 体 积 大 于 750μl 可 先 转 移 750μl, 其 余 的 液 体 待 离 心 弃 液 后, 再 转 移 6. 向 Spin column 内 加 500μl Extraction Buffer, 于 12,000g 离 心 30-60 秒, 并 弃 去 接 液 管 内 液 体 7. 向 Spin column 内 加 650μl Wash Buffer, 于 12,000g 离 心 30-60 秒, 并 弃 去 接 液 管 内 液 体 8. 重 复 第 7 步 一 次 9. 再 次 于 12,000rpm 离 心 1 分 钟, 然 后 将 Spin column 转 移 到 无 菌 的 1. 5ml 离 心 管 中 如 不 进 行 该 步 离 心, 则 无 法 保 证 离 心 柱 内 残 液 被 彻 底 清 除

10. 向 Spin column 内 加 50μl Elution Buffer 去 离 子 水 或 TE 溶 液, 并 于 室 温 静 置 1 分 钟 可 根 据 实 验 的 实 际 需 要 决 定 Elution Buffer 用 量 11. 于 12,000g 离 心 1 分 钟,1. 5ml 离 心 管 内 溶 液 中 含 有 目 的 DNA 片 段 12. 回 收 的 DNA 可 直 接 用 于 各 类 下 游 分 子 生 物 学 实 验, 如 果 不 立 即 使 用, 请 保 存 于 -20 注 意 事 项 1. 使 用 前 按 瓶 身 标 签 标 明 体 积 加 入 无 水 乙 醇, 并 将 其 混 匀 2. 结 合 液 用 好 后 立 即 盖 好 盖 子 3. 本 试 剂 盒 最 适 洗 脱 液 体 积 为 50μl, 洗 脱 液 用 量 可 根 据 客 户 实 验 具 体 情 况 灵 活 调 整 常 见 问 题 及 对 策 没 有 回 收 到 DNA 片 段 如 在 洗 脱 后, 发 现 洗 脱 液 中 没 有 DNA 片 段, 请 检 查 是 否 按 瓶 身 标 签, 在 洗 涤 液 中 加 入 了 无 水 乙 醇 提 取 率 低 1) Extraction Buffer 为 酸 性 缓 冲 液, 如 融 胶 后, 其 ph 值 升 高 将 影 响 提 取 得 率 请 加 入 0.1 倍 体 积 的 3M 乙 酸 钾 (ph5.0) 2) 长 时 间 使 用 后 没 有 更 换 的 电 泳 缓 冲 液, 其 ph 值 较 高, 将 影 响 DNA 的 吸 附 请 更 换 新 的 电 泳 缓 冲 液 后, 再 进 行 电 泳, 然 后 切 胶 3) 在 洗 脱 前, 将 洗 脱 液 于 30~60 温 浴, 可 提 高 提 取 效 率 吸 光 度 测 量 结 果 问 题 吸 光 度 测 量 的 是 未 知 样 品 与 调 零 标 准 之 间 的 相 对 吸 光 度, 所 以 请 用 与 洗 脱 液 体 相 同 的 液 体, 对 测 量 样 品 进 行 稀 释 和 调 零 如 何 计 算 提 取 率 1) 由 于 回 收 前 样 品 中, 往 往 含 有 非 目 的 DNA 片 段 引 物 dntp 等, 所 以 不 能 用 测 回 收 前 后 吸 光 度 的 的 方 法 计 算 回 收 率 2) 可 将 回 收 前 后 DNA 片 段 一 起 电 泳, 使 用 凝 胶 成 像 系 统 拍 照 后, 用 配 套 的 软 件 进 行 电 泳 条 带 灰 度 对 比

3) 注 意, 电 泳 条 件 及 拍 摄 条 件 将 对 灰 度 对 比 结 果 造 成 很 大 影 响, 请 仔 细 操 作, 以 减 小 误 差 三 将 目 的 片 段 克 隆 到 pegfp-c1 载 体 中 实 验 原 理 在 设 计 引 物 时, 一 对 引 物 两 端 分 别 加 了 两 个 酶 切 位 点, 这 两 个 酶 切 位 点 与 pegfp-c1 载 体 多 克 隆 位 点 中 的 酶 切 位 点 相 吻 合, 且 位 置 和 方 向 都 合 适 这 样, 目 的 基 因 片 段 和 pegfp-c1 载 体 经 双 酶 切 后, 由 于 酶 切 位 点 一 致, 在 T4 DNA 连 接 酶 的 作 用 下 就 可 以 连 接 实 验 材 料 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 ; pegfp-c1 载 体 ; 限 制 性 核 酸 内 切 酶 ; 10 Ligation Buffer; T4 DNA Ligase; 冰 盒 等 实 验 方 法 1. 双 酶 切 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 和 pegfp-c1 载 体 反 应 体 系 : 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 Xμl 10 Kbuffer 10 μl EcoRI 2.5μl BamHI 2.5μl ddh 2 O 至 100μl pegfp-c1 载 体 Xμl 10 Kbuffer 10 μl EcoRI 2.5μl BamHI 2.5μl ddh 2 O 至 100μl 反 应 条 件 : 37 o C 2hrs 至 过 夜

2. 回 收 后 电 泳 检 测 浓 度, 然 后 进 行 连 接 反 应 反 应 体 系 : 10 Liga tion Buffer 1μl pegfp-c1 载 体 Xμl 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 Yμl T4 DNA Ligase 0.5μl ddh 2 O 至 10μl 反 应 条 件 : 室 温 2hrs, 或 者 4 o C 过 夜 注 意 事 项 1. 10 Ligation Buffer 用 之 前 要 震 荡 混 匀

pegfp-c1 载 体 图 谱 四 转 化 感 受 态 细 胞 实 验 原 理 转 化 过 程 所 用 的 受 体 细 胞 一 般 是 限 制 修 饰 系 统 缺 陷 的 变 异 株, 即 不 含 限 制 性 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 的 突 变 体 ( Rˉ, Mˉ), 它 可 以 容 忍 外 源 DNA 分 子 进 入 体 内 并 稳 定 地 遗 传 给 后 代 受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 ( 如 电 击 法, CaCl 2 ) 处 理 后, 细 胞 膜 的 通 透 性 发 生 了 暂 时 性 的 改 变, 成 为 能 允 许 外 源 DNA 分 子 进 入 的 感 受 态 细 胞 ( Competent cells ) 进 入 受 体 细 胞 的 DNA 分 子 通 过 复 制, 表 达 实 现 遗 传 信 息 的 转 移, 使 受 体 细 胞 出 现 新 的 遗 传 性 状 将 经 过 转 化 后 的 细 胞 在 筛 选 培 养 基 中 培 养, 即 可 筛 选 出 转 化 子 ( Trans formant), 即 带 有 异 源 DNA 分 子 的 受 体 细 胞 ) 实 验 材 料 待 转 化 的 重 组 质 粒 ; SOC 液 体 培 养 基 或 LB 液 体 培 养 基 ;JM109 或 DH5α 感 受 态 细 胞 ; 带 有 抗 生 素 ( Amp 或 Kan ) 的 LB 平 板 等 实 验 方 法 1. 100ul 感 受 态 细 胞 在 冰 中 融 化 2. 分 装 2 管, 50ul/ 管

3. 加 入 转 化 的 DNA Xul 4. 冰 中 放 置 30min 5. 42 放 置 90sec 6. 冰 中 放 置 2~ 3min 7. 加 入 4 倍 体 积 的 SOC 液 体 培 养 基 或 LB 液 体 培 养 基 8. 37 振 荡 培 养 1hrs 9. 涂 平 板, 37 温 箱 培 养 12~ 16hrs 注 意 事 项 1. 加 入 DNA 的 量 要 小 于 10ng,DNA 的 量 过 高 影 响 转 化 效 率 2. SOC 培 养 基 可 以 用 LB 培 养 基 替 代, 但 是 转 化 率 低 于 使 用 SOC 培 养 基 3. 热 激 温 度 42 o C 一 定 要 准 确, 否 则 影 响 转 化 效 率 五 提 取 质 粒 并 进 行 酶 切 鉴 定 实 验 材 料 质 粒 提 取 试 剂 盒 ; 限 制 性 核 酸 内 切 酶 ; 离 心 机 ; 振 荡 培 养 箱 ; 电 泳 装 置 ; 冰 盒 ; 恒 温 水 浴 箱 等 实 验 方 法 1. 挑 取 含 有 目 的 DNA 重 组 体 的 单 个 菌 落 接 种 在 3ml L B( 含 有 Amp 或 Kan) 液 体 培 养 基 中,37,225rpm 培 养 12~ 16hrs 2. 提 取 质 粒 ⑴ 离 心 菌 液, 废 弃 上 清 ⑵ 加 入 250ul BufferP1, 使 菌 片 重 悬, 务 必 使 片 状 物 不 可 见 ⑶ 加 入 250ul BufferP2, 上 下 颠 倒 EP 管 4~ 6 次, 操 作 时 间 要 少 于 5min ⑷ 加 入 350ul BufferN3, 上 下 颠 倒 EP 管 4~ 6 次, 可 见 絮 状 沉 淀

⑸ 离 心 13000rpm, 10min ⑹ 离 心 后 的 上 清 液 移 入 Prep Spin Column ⑺13000rpm 离 心 30~ 60Secs, 弃 滤 液 ⑻ 加 入 0.5ml Buffer PB, 13000rpm 离 心 30~ 60Secs, 弃 滤 液 ⑼ 加 入 0.75ml Buffer PE,13000rpm 离 心 30~ 60Secs, 弃 滤 液 ⑽13000 rpm 再 离 心 1min, 弃 滤 液 ⑾ 将 Prep Spin Column 加 到 新 的 1.5ml EP 管 上 ⑿ 加 50ul Buffer EB 至 滤 膜 中 央, 室 温 静 置 1min,13000rpm 离 心 1min 即 获 得 所 需 质 粒 3. 酶 切 鉴 定 反 应 体 系 ( 20ul 体 系 ): 提 取 的 质 粒 2ul 10 KBuffer 2ul BamHI 0.5ul EcoRI 0.5ul ddh 2 O 15ul 反 应 条 件 : 37 o C 2-3hrs 4. 电 泳 : 观 察 酶 切 结 果

实 验 六 目 的 基 因 在 真 核 系 统 中 的 表 达 及 细 胞 内 的 定 位 一 磷 酸 钙 法 瞬 时 转 染 实 验 原 理 将 氯 化 钙,DNA 和 磷 酸 缓 冲 液 混 合, 形 成 包 含 DNA 且 极 小 的 不 溶 的 磷 酸 钙 颗 粒 ( 沉 淀 ) 磷 酸 钙 -DNA 复 合 物 粘 附 到 细 胞 膜 并 通 过 胞 饮 进 入 目 的 细 胞 的 细 胞 质 实 验 材 料 2 HBS(pH7.10);2M CaCl 2 ;TE (ph8.0); 质 粒 DNA; 培 养 的 真 核 细 胞 ;CO 2 培 养 箱 等 实 验 方 法 1. 转 染 的 前 一 天 在 35mm 培 养 皿 中 植 入 细 胞 ( 约 1 10 6 个 细 胞 ), 使 得 第 二 天 转 染 时 细 胞 汇 合 率 达 到 50-80%; 2. 转 染 前 1-4 小 时, 换 成 不 含 血 清 和 双 抗 的 培 养 基 ; 3. 在 1.5ml 无 菌 的 离 心 管 中 混 合 下 列 药 品 : 15.5 l 2M CaCl 2 最 多 10 g 质 粒 DNA 补 加 TE (ph 8.0) 至 125 l; 4. 在 无 菌 的 35mm 平 皿 中 加 入 125 l 2 HBS(pH7.10), 然 后 逐 滴 加 入 上 述 混 合 物, 一 边 加 一 边 充 分 混 合, 使 磷 酸 钙 沉 淀 均 匀, 室 温 放 置 20 分 钟, 这 时 溶 液 将 有 非 常 小 的 磷 酸 钙 沉 淀 颗 粒 形 成 ; 5.20 分 钟 后, 将 混 合 物 加 入 细 胞 中,37 C 培 养 箱 中 培 养 4-8 小 时 ; 6.4-8 小 时 后, 用 含 血 清 的 完 全 培 养 基 替 换 旧 培 养 基,37 C 培 养 箱 中 继 续 培 养 ; 7. 在 转 染 后 24-72 小 时 将 细 胞 置 于 荧 光 显 微 镜 下 观 察 目 的 蛋 白 的 表 达 注 意 事 项 1. 所 有 操 作 都 必 须 在 无 菌 条 件 下 进 行 ;

2.2 HBS 2M CaCl 2 和 TE 须 经 0.22 m 滤 器 滤 菌 分 装 后 使 用 ; 3. 沉 淀 的 大 小 和 质 量 对 于 磷 酸 钙 转 染 的 成 功 至 关 重 要 在 实 验 中 使 用 的 每 种 试 剂 都 必 须 小 心 校 准, 保 证 质 量, 因 为 甚 至 偏 离 最 优 条 件 十 分 之 一 个 ph 都 会 导 致 磷 酸 钙 转 染 的 失 败 二 荧 光 法 确 定 含 有 目 的 基 因 的 EGFP 融 合 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 实 验 原 理 绿 色 荧 光 蛋 白 (Green fluorecent protein,gfp) 最 早 是 在 海 洋 生 物 水 母 (Aequorea victoria) 中 发 现 的 GFP 蛋 白 的 多 肽 链 中 含 有 特 殊 的 生 色 团 结 构, 可 在 紫 外 光 源 下 发 出 稳 定 的 绿 色 荧 光, 而 且 这 种 荧 光 发 射 无 需 外 加 辅 助 因 子 或 进 行 任 何 特 殊 处 理 GFP 标 记 分 子 最 常 作 为 标 记 物 来 追 踪 结 合 分 子 的 表 达 水 平 和 定 位, 或 作 为 检 测 环 境 变 化 或 蛋 白 相 互 作 用 的 指 标 目 前 广 泛 用 于 分 子 和 细 胞 生 物 学 各 个 领 域 实 验 材 料 转 染 后 的 真 核 细 胞 ; 倒 置 荧 光 显 微 镜 实 验 方 法 取 转 染 后 24-72hrs 的 细 胞, 置 于 倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察 含 有 目 的 基 因 的 EGFP 融 合 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 注 意 事 项 GFP 处 于 低 PH 值 环 境 中 可 能 失 去 荧 光 效 应