精 子 密 度 检 测 估 测 法 精 子 密 度 仪 法 和 CASA 法 主 观 性 强, 误 差 大 方 便 时 间 短 重 复 性 好 < 一 个 精 子 为 密 = 一 个 精 子 为 中 > 一 个 精 子 为 稀 原 精 液 200μL 3%NaCl 稀 释 10 倍 血 细 胞 计 数 法 最 准 确, 但 速 度 慢 猪 精 子 密 度 一 般 为 2~3 亿 /ml 生 产 上 主 要 以 精 子 密 度 仪 法 检 测 计 数 板 上 放 盖 玻 片 滴 上 1 滴 稀 释 精 液 计 数 5 个 中 方 格 精 子 将 该 数 乘 以 50 万
精 子 畸 形 率 检 测 畸 形 率 检 查 方 法 相 差 显 微 镜 直 接 观 察 伊 红 或 姬 姆 萨 等 染 色 后 普 通 显 微 镜 观 察 取 中 层 精 液 抹 片 固 定 液 固 定 20min 染 色 后 显 微 镜 观 查 Giemsa 染 色 90min 水 洗 并 风 干 置 1000 倍 油 镜 下 畸 形 率 要 求 观 察 精 子 > 300 个 要 求 : 一 般 要 求 不 超 过 18% 为 宜 影 响 : 畸 形 率 过 高 会 减 少 精 液 的 受 精 能 力 改 善 : 增 加 精 液 的 用 量 可 以 提 高 其 受 精 效 果
精 子 质 膜 完 整 性 检 测 1 2 3 4 精 子 质 膜 作 用 及 分 布 精 子 质 膜 染 料 分 类 精 子 不 同 区 域 质 膜 的 检 测 目 前 主 要 的 精 子 质 膜 检 测 方 法
精 子 质 膜 作 用 及 分 布 维 持 完 整 的 细 胞 内 环 境 作 用 受 精 过 程 中 起 到 信 号 识 别 与 传 导 作 用 精 子 质 膜 转 运 物 质 功 能 覆 盖 于 顶 体 外 膜 区 上 的 质 膜 分 布 覆 盖 于 精 子 头 部 非 顶 体 区 的 质 膜 覆 盖 于 尾 部 的 中 段 和 主 段 部 分 的 质 膜
精 子 质 膜 染 料 分 类 质 膜 染 料 分 类 非 荧 光 染 料 荧 光 染 料 伊 红 苯 胺 黑 染 色 伊 红 苯 胺 蓝 染 色 苔 盼 兰 吉 姆 萨 染 色 死 精 子 特 异 性 荧 光 染 料 活 精 子 特 异 性 荧 光 染 料 染 色 原 理 : 此 种 染 料 不 能 进 入 质 膜 完 整 功 能 的 精 子 内 部, 只 能 进 入 质 膜 受 损 的 精 子, 并 与 DNA 结 合 发 出 荧 光 碘 化 丙 锭 (PI) Hoechst33258 溴 化 乙 锭 (EB) 溴 乙 啡 锭 二 聚 体 (EthD-1) Yo-Pro-1 染 色 原 理 : 活 精 子 特 异 的 荧 光 染 料 是 膜 通 透 性 的 染 料, 只 能 进 入 细 胞 膜 完 整 的 精 子 Hoechst33342 SYBR-14 羧 基 荧 光 素 双 醋 酸 盐 (CFDA) 羧 基 二 甲 基 荧 光 素 双 醋 酸 盐 (CMFDA) Carboxy-SNARF-1 SYTO-17
精 子 不 同 区 域 质 膜 的 检 测 覆 盖 于 顶 体 外 膜 区 上 的 质 膜 覆 盖 于 精 子 头 部 非 顶 体 区 的 质 膜 覆 盖 于 尾 部 的 中 段 和 主 段 部 分 的 质 膜 通 常 与 顶 体 外 膜 完 整 性 的 检 测 联 合 起 来 进 行 荧 光 染 料, 例 如 碘 化 丙 锭 ( PI ) 溴 化 乙 锭 (EB) DAPI Hoechst 33258 等 非 荧 光 染 料, 例 如 伊 红 苯 胺 黑 染 色 伊 红 苯 胺 蓝 染 色 等 精 子 的 低 渗 肿 胀 实 验 (HOST) 检 测 原 理 : 低 渗 溶 液 中, 有 生 物 活 性 的 精 子 质 膜 会 使 水 分 子 进 入 质 膜 中, 直 到 精 子 内 外 环 境 达 到 平 衡 为 止 水 的 内 流 使 精 子 尾 部 的 质 膜 膨 胀 并 且 尾 部 会 发 生 弯 曲 但 是 精 子 质 膜 损 伤 或 失 去 生 物 活 性, 水 能 够 自 由 通 过 质 膜, 在 胞 质 内 不 会 积 聚 液 体 从 而 不 会 出 现 肿 胀 和 尾 部 弯 曲 通 过 相 差 显 微 镜 可 以 观 测 到 精 子 质 膜 对 低 渗 液 的 反 应
精 子 质 膜 检 测 方 法 利 用 流 式 细 胞 仪 检 测 利 用 显 微 镜 进 行 检 测 A B C 红 箭 头 所 指 区 域 为 被 PI 染 色 的 死 精 子 ; 蓝 箭 头 所 指 区 域 为 被 SYBR-14 染 色 活 精 子 ; A: 被 PI 染 色 的 死 精 子, 为 红 色 ; B: 被 SYBR-14 染 色 活 精 子, 为 绿 色, 膜 功 能 完 整 ; C: 被 SYBR-14/PI 染 色, 绿 色 为 膜 完 整 的 活 精 子, 红 色 为 死 精 子
线 粒 体 功 能 检 测 1 2 检 测 线 粒 体 的 染 料 分 类 精 子 线 粒 体 检 测 方 法
检 测 线 粒 体 的 染 料 分 类 染 料 名 称 染 色 特 性 优 缺 点 R123 (Rhodamine123) MITO (MitoTrackerGreen FM) JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1 ',3,3'- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) 能 渗 透 并 沉 积 在 正 常 线 粒 体 上 发 出 绿 色 荧 光 如 果 线 粒 体 损 坏 则 不 发 绿 色 荧 光 MITO 在 水 溶 液 中 不 发 荧 光, 而 当 积 聚 在 线 粒 体 内 时 会 发 绿 色 荧 光 线 粒 体 膜 电 位 低 时, 发 绿 色 荧 光 ; 膜 电 位 高 时 发 橙 色 荧 光 在 精 子 头 部 和 尾 部 有 非 特 异 性 染 色, 可 检 测 线 粒 体 有 无 功 能, 不 能 区 别 膜 电 位 高 低 MITO 在 精 子 头 部 有 非 特 异 性 染 色 J C-1 染 色 的 特 异 性 最 好, 仅 在 线 粒 体 部 位 发 黄 色 或 绿 色 荧 光 精 子 运 动 能 力 与 线 粒 体 的 活 性 密 切 相 关, 整 个 精 子 代 谢 所 需 的 能 量 主 要 由 线 粒 体 提 供
精 子 线 粒 体 检 测 方 法 检 测 方 法 : 1. 荧 光 显 微 镜 2. 流 式 细 胞 仪 最 适 合 的 荧 光 染 料 :J C-1 荧 光 显 微 镜 检 测 : a: R123 染 色, 在 精 子 头 部 和 尾 部 有 非 特 异 性 染 色, 可 检 测 线 粒 体 有 无 功 能, 不 能 区 别 膜 电 位 高 低 b: J C-1 染 色, 其 特 异 性 最 好, 仅 在 线 粒 体 部 位 发 黄 色 或 绿 色 荧 光 c: MITO 染 色, 在 精 子 头 部 有 非 特 异 性 染 色 A B C 流 式 细 胞 仪 检 测 : A:R123/PI 染 色, 箭 头 指 发 绿 色 荧 光 精 子 ; B: J C-1 /PI 染 色, 顶 端 箭 头 指 发 橙 色 荧 光 精 子 ; 底 端 箭 头 指 发 绿 色 荧 光 精 子 ; C: MITO /PI 染 色, 箭 头 指 发 绿 色 荧 光 精 子 ; A-C, 未 被 箭 头 标 记 的 精 子 属 于 死 精 子, 被 PI 标 记
获 能 和 顶 体 检 测 一 获 能 检 测 精 子 膜 的 获 能 状 态 的 改 变 很 容 易 引 起 顶 体 反 应 的 提 前 发 生, 以 及 精 子 受 精 能 力 的 丧 失 二 顶 体 检 测 1. 顶 体 反 应 是 精 子 成 功 穿 入 卵 母 细 胞 所 必 需 的 过 程 2. 顶 体 内 富 含 多 种 蛋 白 水 解 酶 ( 顶 体 酶 ), 在 精 子 穿 过 卵 子 放 射 冠 透 明 带 等 受 精 过 程 中 发 挥 主 要 作 用
获 能 检 测 采 用 金 霉 素 ( CTC) 进 行 获 能 检 测 CTC 进 入 精 子 可 以 结 合 游 离 的 钙 离 子, 这 些 CTC-Ca 2+ 复 合 物 能 够 结 合 在 质 膜 的 疏 水 区 并 且 在 荧 光 显 微 镜 下 激 发 出 黄 绿 色 荧 光 1 F 型, 整 个 精 子 头 部 有 均 一 荧 光, 为 未 获 能, 顶 体 完 整 的 精 子 ; 2 B 型, 精 子 头 部 顶 体 后 区, 在 靠 近 尾 部 的 部 分 无 荧 光 或 非 常 弱 的 荧 光, 而 头 前 部 为 均 一 荧 光, 为 获 能 且 顶 体 完 整 的 精 子 ; 3 AR 型, 整 个 精 子 头 部 无 荧 光 或 非 常 弱 的 荧 光, 为 顶 体 不 完 整 的 精 子, 即 发 生 了 顶 体 反 应 的 精 子 或 顶 体 缺 损 的 精 子 1 2 3
顶 体 检 测 流 式 细 胞 仪 检 测 精 子 的 活 力 和 顶 体 状 态 A) 荧 光 显 微 镜 下 观 察 精 子 的 活 力 和 顶 体 状 态 B) C) A) 绿 箭 头 所 指 区 域 属 于 PI 标 记 精 子, 为 死 精 子 ; B) 蓝 箭 头 所 指 代 表 FITC-PNA 标 记 精 子, 为 顶 体 反 应 精 子 ; C) 黑 箭 头 所 指 代 表 未 发 生 顶 体 反 应 活 精 子 A) H33342 标 记 所 有 精 子 细 胞 核 呈 现 蓝 色 荧 光 ; B) PI 标 记 死 精 子 的 细 胞 核 呈 现 红 色 荧 光 ; C) 发 生 顶 体 反 应 或 顶 体 膜 破 损 的 精 子 被 FITC-PNA 标 记, 呈 现 绿 色 顶 体
染 色 质 完 整 性 检 测 吖 啶 橙 (AO) 染 色, 进 行 染 色 质 结 构 试 验 (SCSA) 1 1 1 1 原 理 : DNA 的 变 性 位 点 具 有 感 光 性, 用 异 源 性 的 染 料 AO 染 色, 在 荧 光 的 激 发 下, 插 入 没 变 性 的 双 链 DNA 的 AO 染 料 发 绿 色 荧 光, 而 与 变 性 的 单 链 DNA 结 合 的 AO 染 料 发 红 色 荧 光 3 3 3 3 2 2 2 2 1. 插 入 没 变 性 的 双 链 DNA 的 AO 染 料 发 绿 色 荧 光 ; 2. 与 变 性 的 单 链 DNA 结 合 的 AO 染 料 发 红 色 荧 光 ; 3. 黄 色 跟 橙 色 为 正 在 变 性 的 DNA
透 明 带 结 合 检 测 检 测 方 法 目 前 检 测 精 子 结 合 透 明 带 能 力 有 两 种 方 法 : 透 明 带 结 合 检 测 (ZBA) 半 透 明 带 检 测 (HZA) ZBA 卵 母 细 胞 与 精 子 共 同 培 养, 然 后 使 用 相 差 显 微 镜 或 者 荧 光 显 微 镜 计 算 结 合 到 透 明 带 上 的 精 子 数 量 HZA 利 用 显 微 操 作 方 法 将 卵 母 细 胞 切 割 两 半, 并 去 掉 细 胞 质 然 后 两 半 透 明 带 分 别 与 对 照 组 和 实 验 组 的 精 液 样 本 孵 育, 最 后 使 用 相 差 显 微 镜 计 算 结 合 的 精 子 数 量
体 外 受 精 检 测 卵 母 细 胞 体 外 受 精 (IVF) 技 术 已 经 很 成 熟, 可 以 利 用 IVF 技 术 来 检 测 精 子 的 受 精 能 力 优 点 u 更 能 够 接 近 体 内 的 受 精 过 程 u 更 好 的 检 测 精 子 的 真 实 质 量 缺 点 u 部 分 动 物 体 外 受 精 技 术 并 不 成 熟 u 费 时 费 力 u 实 验 条 件 复 杂 u 成 本 过 高
膜 的 完 整 性 与 受 精 能 力 之 间 具 有 显 著 但 可 变 的 相 关 性 r = 0.05(Almet al.,2001); r = 0.39~0.57(Januskauskas, 2001) 膜 活 力 与 受 精 能 力 之 间 具 有 可 变 的 相 关 性 r=0.15~0.83 (Kjaestad et al.,1993; Januskauskas et al.,2003) 活 力 受 精 能 力 顶 体 顶 体 与 受 精 能 力 之 间 具 有 显 著 的 可 变 的 相 关 性 r = 0.60-0.84 (Withfieldand Parkinson 1995;Januskauskaset al.,2000) 体 外 受 精 (IVF) 与 受 精 能 力 之 间 具 有 显 著 的 相 关 性 r = 0.35-0.59 (Zhang et al., 1997;Schneider et al.,1999) IVF HZA 精 子 与 透 明 带 的 结 合 能 力 与 受 精 能 力 之 间 具 有 显 著 的 相 关 性 r = 0.50 (Zhang et al.,1998) 实 验 室 评 估 与 精 子 质 量 受 精 之 间 的 关 系
精 液 品 质 分 析 及 受 精 效 果 变 化 的 原 因 实 验 室 差 异 实 验 室 对 精 子 分 析 评 估 时, 在 客 观 性 可 重 复 性 以 及 准 确 性 上 存 在 差 异 分 析 差 异 精 子 只 有 在 结 构 和 功 能 上 具 备 多 方 面 的 特 性 才 具 有 受 精 能 力 单 一 指 标 不 能 完 全 反 映 其 受 精 能 力, 需 多 指 标 同 时 进 行 生 产 操 作 差 异 母 畜 差 异 人 工 授 精 操 作 差 异 不 同 的 季 节 以 及 输 精 量 等 不 同, 都 会 造 成 受 精 结 果 的 差 异 母 畜 方 面, 体 质 年 龄 胎 次 的 不 同 以 及 饲 养 管 理 的 差 异, 均 会 影 响 到 人 工 授 精 的 效 果
展 望 精 子 检 测 的 主 要 目 的 就 是 快 速 准 确 地 确 定 其 受 精 能 力, 以 满 足 科 研 及 生 产 的 需 要 传 统 检 测 方 法 虽 然 比 较 简 单, 但 存 在 主 观 性 可 变 性 检 测 指 标 与 受 精 能 力 相 关 性 差 等 缺 点 因 此 应 推 广 新 技 术 用 于 精 液 检 测 精 子 需 要 同 时 具 备 多 种 特 性 和 功 能 才 能 具 有 受 精 能 力, 因 而 单 独 的 检 测 指 标 无 法 完 全 反 映 其 受 精 能 力 同 时 检 测 多 个 指 标, 才 能 更 好 地 反 映 精 子 的 受 精 能 力 精 子 质 量 评 估 未 来 的 研 究 方 向 仍 是 继 续 寻 找 有 效 的 预 测 精 子 受 精 能 力 的 检 测 指 标 与 方 法