mirna-141-3p 和 mirna-346 在 大 鼠 腺 垂 体 中 靶 基 因 的 识 别 与 验 证 The identification and verification of target genes of mirna-141-3p and mirna-346 in the rat

mir NA- 141-3p 和 mir NA- 346 在 大 鼠 腺 垂 体 中 靶 基 因 的 识 别 与 验 证 分 类 号 : S814.1 单 位 代 码 :10183 研 研 究 生 学 号 :2012852020 密 级 : 公 开 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 mirna-141-3p 和 mirna-346 在 大 鼠 腺 垂 体 中 靶 基 因 的 识 别 与 验 证 The identification and verification of target genes of mirna-141-3p and mirna-346 in the rat adenohypophysis 作 者 姓 名 : 许 橙 专 业 : 动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖 林 大 学 吉 研 究 方 向 : 动 物 繁 殖 学 指 导 教 师 : 张 嘉 保 教 授 培 养 单 位 : 动 物 科 学 学 院 2015 年 12 月

mirna-141-3p 和 mirna-346 在 大 鼠 腺 垂 体 中 靶 基 因 的 识 别 与 验 证 The identification and verification of target genes of mirna-141-3p and mirna-346 in the rat adenohypophysis 作 者 姓 名 : 许 橙 专 业 名 称 : 动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖 指 导 教 师 : 张 嘉 保 教 授 学 位 类 别 : 农 学 硕 士 答 辩 日 期 :2015 年 12 月 4 日

未 经 论 文 本 人 的 书 面 授 权, 依 法 和 保 管 本 论 文 书 面 版 本 电 子 版 本 的 任 何 单 位 和 个 人, 均 不 得 对 本 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 进 行 任 何 形 式 的 复 制 修 改 发 行 出 租 改 编 等 有 碍 作 者 著 作 权 的 商 业 性 使 用 ( 但 纯 学 术 性 使 用 不 在 次 限 ) 否 则, 应 承 担 侵 权 的 法 律 责 任 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 : 所 呈 交 的 硕 士 学 位 论 文, 是 本 人 在 指 导 教 师 的 指 导 下, 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的 成 果 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外, 本 论 文 不 包 含 任 何 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 作 品 成 果 对 本 文 的 研 究 做 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体, 均 已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 结 果 由 本 人 承 担 学 位 论 文 作 者 签 名 : 年 月 日

中 国 优 秀 博 硕 士 学 位 论 文 全 文 数 据 库 投 稿 声 明 研 究 生 院 : 本 人 同 意 中 国 优 秀 博 硕 士 学 位 论 文 全 文 数 据 库 出 版 章 程 的 内 容, 愿 意 将 本 人 的 学 位 论 文 委 托 研 究 生 院 向 中 国 学 术 期 刊 ( 光 盘 版 ) 电 子 杂 志 社 的 中 国 优 秀 博 硕 士 学 位 论 文 全 文 数 据 库 投 稿, 希 望 中 国 优 秀 博 硕 士 学 位 论 文 全 文 数 据 库 给 予 出 版, 并 同 意 在 中 国 博 硕 士 学 位 论 文 评 价 数 据 库 和 CNKI 系 列 数 据 库 中 使 用, 同 意 按 章 程 规 定 享 受 相 关 权 益 论 文 级 别 : 硕 士 博 士 学 科 专 业 : 动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖 论 文 题 目 :mirna-141-3p 和 mirna-346 在 大 鼠 腺 垂 体 中 靶 基 因 的 识 别 与 验 证 作 者 签 名 : 指 导 教 师 签 名 : 作 者 联 系 地 址 ( 邮 编 ): 年 月 日 吉 林 省 长 春 市 西 安 大 路 5333 大 学 实 验 动 物 作 者 联 系 电 话 :04836575

中 文 摘 要 mirna-141-3p 和 mirna-346 在 大 鼠 腺 垂 体 中 靶 基 因 的 识 别 与 验 证 微 小 RNA(microRNA) 是 一 类 来 自 真 核 生 物 自 身 基 因 组 的, 是 由 其 前 体 经 过 酶 的 切 割 产 生 的, 长 度 多 数 为 19~25 nt 的 非 编 码 小 分 子 RNA 主 要 通 过 作 用 于 靶 基 因 mrna 的 3 UTR 区, 抑 制 靶 基 因 mrna 翻 译 或 者 使 靶 基 因 mrna 降 解 研 究 表 明, mirna 调 控 1/3 以 上 的 编 码 基 因 大 量 文 献 报 道 发 现 mirna 对 肿 瘤 的 发 生 心 血 管 系 统 的 疾 病 神 经 系 统 疾 病 的 发 生 有 调 节 作 用 如 :mir-181a 的 表 达 对 胃 癌 细 胞 有 重 要 影 响 还 有 大 量 实 验 表 明, 有 些 mirna 对 胚 胎 的 发 育 胚 胎 干 细 胞 分 化 也 有 一 定 的 调 控 作 用 如 :mirna-7 与 垂 体 的 发 育 有 关 联 说 明 mirna 与 生 物 的 繁 殖 有 密 切 的 关 系 因 此, 对 mirna 的 识 别 及 功 能 分 析 已 成 为 当 前 分 子 生 物 学 研 究 热 点 腺 垂 体 是 机 体 最 重 要 的 内 分 泌 器 官, 能 够 分 泌 对 生 长 代 谢 和 繁 殖 起 到 重 要 作 用 的 多 种 激 素 腺 垂 体 所 分 泌 的 促 性 腺 激 素 包 括 促 卵 泡 素 和 黄 体 生 成 素, 这 两 种 激 素 通 过 协 同 作 用, 调 节 雄 性 动 物 睾 丸 中 多 种 细 胞 的 发 育 以 及 性 腺 类 固 醇 激 素 合 成 与 分 泌, 对 繁 殖 有 着 重 要 作 用 所 以, 我 们 可 以 通 过 对 促 卵 泡 素 (FSH) 和 黄 体 生 成 素 (LH) 的 调 控 作 用 来 完 成 对 动 物 繁 殖 的 影 响 然 而, 机 体 如 何 调 控 垂 体 促 卵 泡 素 受 体 (FSHR) 的 表 达, 研 究 并 不 明 确 而 mirna 是 调 节 基 因 表 达 的 重 要 因 素 因 此, 识 别 与 鉴 定 对 促 卵 泡 激 素 受 体 靶 向 的 mirna, 有 助 于 解 析 促 卵 泡 激 素 对 垂 体 功 能 的 调 控 本 实 验 通 过 采 集 21 日 龄 6 月 龄 清 洁 级 雄 性 Wistar 大 鼠 腺 垂 体 组 织, 提 取 总 RNA 并 鉴 定 特 异 性 mirna 基 因 芯 片 检 测 技 术 分 析 两 个 不 同 时 期 的 mirna 与 基 因 芯 片 结 果 比 较, 发 现 mirna-141-3p 和 mirna-346 表 达 量 存 在 差 异, RT-qPCR 结 果 与 芯 片 结 果 一 致 值 得 注 意 的 是, 利 用 TargetScan 软 件 预 测 发 现 mirna-141-3p 和 mirna-346 可 能 作 用 于 靶 基 因 FSHR, 根 据 FSHR (Rattus norvegicus) 3 UTR 野 生 型 载 体 序 列 信 息 设 计 突 变 引 物, 将 靶 序 列 CAGTGTT(78-85) 突 变 为 GTCACAA GGCAGAC (127-133) 突 变 为 CCGTCTG, I

以 野 生 型 载 体 为 模 板,PCR 扩 增 FSHR 基 因 的 3'UTR 突 变 序 列, 将 其 克 隆 到 pmir-rb-report 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体 中 由 于 mirna 作 用 于 靶 基 因 必 须 通 过 3 UTR 进 行, 因 此 我 们 将 事 先 构 建 好 的 报 告 基 因 载 体 与 mirna 进 行 共 转 染 实 验, 观 察 相 对 荧 光 值 的 变 化 ( 是 否 下 调 ) 来 证 明 mirna 与 靶 基 因 的 作 用 关 系 根 据 双 荧 光 素 酶 报 告 中 的 基 因 表 达 分 析 结 果,FSHR 野 生 型 载 体 的 报 告 荧 光 并 没 有 在 rno-mir-141-3p mimic 的 作 用 下 明 显 下 调 ;rno-mir-346 mimic 对 FSHR 野 生 型 载 体 的 报 告 荧 光 有 明 显 下 调 作 用, 相 应 结 合 位 点 突 变 后, 突 变 型 载 体 中 的 报 告 荧 光 与 野 生 型 比 有 所 恢 复 ;rno-mir-141-3p mimic 和 rno-mir-346 mimic 同 时 处 理, 对 野 生 型 载 体 的 报 告 荧 光 有 一 定 的 下 调 作 用 在 体 外,rno-miR-141-3p 可 能 不 能 通 过 FSHR 上 相 应 的 3UTR 位 点 调 控 报 告 基 因 的 表 达 ;rno-mir-346 有 可 能 通 过 FSHR 上 相 应 的 3 UTR 位 点 调 控 报 告 基 因 的 表 达 综 上 所 述, 该 试 验 为 mirna-141-3p 和 mirna-346 可 能 通 过 对 FSHR 的 转 录 后 调 控 研 究 提 供 了 理 论 依 据, 并 对 进 一 步 研 究 mir-141-3p 和 mir-346 对 垂 体 的 发 育 生 殖 以 及 激 素 分 泌 等 功 能 可 能 产 生 的 调 控 作 用 提 供 重 要 参 考 关 键 词 : 大 鼠 ; 腺 垂 体 ; 微 小 RNA; 繁 殖 调 控 ; 促 卵 泡 素 受 体 基 因 II

Abstract The identification and verification of the target genes of mirna-141-3p and mirna-346 in rat anterior pituirtary MicroRNAs(miRNAs) are a family of non-coding RNA with the length of 19-25 nucleotides. MiRNAs are known to play important roles in the regulation of a varity of celluar processes by downregulating the expression of specific target mrnas after binding to complementary sequences present in the mrna 3 untranslated region (3 UTR). MiRNAs also take part in many biological processes that occur during development and diseases,such as tumors, diseases of the cardiovascular system and nervous system disfunction. It s reported, mir-181a contribute to gastric cancer and mirna-7 are associated with the development of the pituitary. Above all, the study mirna has become more and more important. Anterior pituitary is one of the most important endocrine organs,which secrets lots of hormones involved in growth, metabolic and reproduction. Anterior pituitary secrets kinds of gonadotropins including follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone(lh). They regulate the development of a variety of cells in the testis and the synthesis and secretiongonadal of steroid hormone, that play an important role to reproduction. However, the regulation of expression of follicle-stimulating hormone receptor(fshr) is still unknown. Therefore, the identification of mirnas that targeting FSHR in the anterior pituitary will help us understand more about the regulation of anterior pituitary by FSH. Our study focus on exploring the interaction between mirna and FSHR. Male Wistar rat pituitary (clean grade) tissues were harvested in 21days and 6 months. Total RNA were extracted. After using microrna array detection, we analysed the difference between mirnas in these two periods, and found that the expressions of mirna-141-3p and mirna-346 showed difference in different periods, the RT-PCR results confirmed our conclusion. Remarkably, we noticed that FSHR is the potential target of mirna-141-3p and mirna-346 identified using TargetScan software. We designed the primers to introduce mutation according to FSHR 3 UTR wildtype sequence, we changed CAGTGTT(78-85) into GTCACAA and changed GGCAGAC III

(127-133) into CCGTCTG. We acquired FSHR mutant 3 UTR from wildtype template by PCR and inserted into pmir-rb-report dual luciferase report carrier. It s known that 3 UTR contains mirna s binding site.we co-tranfered mirna with luciferase reporter to identify the interaction between mirnas and their target. Our results showed that rno-mir-141-3p mimic did not down-regulate FSHR reporter, while rno-mir-346 mimic down-regulate FSHR reporter significantly. The down-regulation could be rescued by introducing mutant binding sites. We concluded that rno-mir-346 could regulate the expression of FSHR by binding 3 UTR in vivo, while rno-mir-141-3p was unable to regulate by the same way. In summary, we discovered that both mirna-141-3p and mirna-346 involved in the post-transcription regulation of FSHR. Meanwhile, our study provided a theoretical basis for further study the effect of mir-141-3p and mir-346 on pituitary development, hormone secretion and reproductive function. Keywords: Rat, Adenohypophysis, microrna, Regulatory of reproduction, FSHR IV

目 录 引 言... 1 第 一 篇 文 献 综 述... 3 第 1 章 microrna 的 研 究 进 展... 3 1.1 mirna 的 发 现 及 概 念... 3 1.2 mirna 与 靶 基 因 的 作 用 机 制... 3 1.3 mirna 的 生 物 学 特 性... 4 1.4 mirna 的 功 能... 5 1.5 mirna 的 检 测 方 法... 8 1.6 mirna 靶 基 因 的 预 测... 9 1.7 mirna 靶 基 因 验 证... 9 第 2 章 垂 体 mirna... 12 2.1 垂 体 与 动 物 繁 殖 的 关 系... 12 2.2 垂 体 mirna 的 研 究 进 展... 13 2.3 本 研 究 的 目 的 意 义... 16 第 二 篇 研 究 内 容... 17 第 1 章 大 鼠 腺 垂 体 mirna-141-3p 和 mirna-346 表 达 规 律 分 析... 17 1.1 实 验 材 料... 17 1.2 实 验 方 法... 19 1.3 结 果... 22 1.4 讨 论... 27 1.5 小 结... 29 第 2 章 mirna-141-3p 和 mirna-346 靶 基 因 识 别 及 验 证... 31 2.1 实 验 材 料... 31 V

2.2 实 验 方 法... 32 2.3 结 果... 38 2.4 讨 论... 43 2.5 小 结... 43 结 论... 44 参 考 文 献... 45 导 师 简 介... 53 作 者 简 介... 54 致 谢... 55 VI

英 文 缩 写 词 表 英 文 缩 写 英 文 全 称 中 文 全 称 及 注 释 mirna cdna Dicer RT-qPCR RT-PCR EDTA FSH GH LB LH LNA mirna mrna MSH PBS PCR PRL RISC SNP OD UTR microrna complementary DNA Double-stranded RNA-specific Endoribonuclease Realtime fluorescence quantitative PCR Reverse transcription PCR Ethylene diamine tetra acetate Follicle stimulating hormone Growth hormone Luria bertani medium Luteinizing hormone Locked nucleic acid MicroRNA Messenger RNA Melanocyte stimulating hormone Phosphate Buffered Solution Polymerase chain reaction Prolactin RNA-induced silencing complex Single nucleotide polymorphism Optical Density Untranslating region 微 小 RNA 互 补 DNA 双 链 RNA 特 异 内 切 酶 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 转 录 RCR 乙 二 胺 四 乙 酸 促 卵 泡 素 生 长 激 素 LB 培 养 基 促 黄 体 素 锁 核 酸 小 RNA 信 使 核 糖 核 酸 黑 素 细 胞 刺 激 素 磷 酸 盐 缓 冲 液 聚 合 酶 链 反 应 促 乳 素 RNA 诱 导 沉 默 复 合 体 单 核 苷 酸 多 态 性 吸 光 度 非 翻 译 区 VII

引 言 引 言 1993 年,Lee 等 首 次 在 线 虫 体 内 发 现 了 一 小 段 长 度 为 22nt 非 编 码 小 RNA 分 子 lin-4,lin-4 是 能 够 调 控 胚 胎 后 期 发 育 的 基 因 但 是, 人 们 并 没 有 意 识 到 这 一 类 小 RNA 的 重 要 性, 直 到 2000 年, 与 之 相 似 的 let-7 被 Reinhart 等 人 在 线 虫 体 内 发 现, mirna 的 研 究 才 慢 慢 被 人 类 重 视, 其 在 生 命 活 动 中 的 作 用 也 逐 步 被 发 现 microrna(mirnas) 是 一 类 长 度 约 为 22nt 的 内 源 性 非 编 码 转 录 后 调 控 小 RNA 分 子, 主 要 通 过 对 靶 基 因 mrna 上 的 3 -UTR 区 产 生 作 用, 进 而 导 致 目 标 基 因 降 解 或 者 抑 制 目 标 基 因 mrna 的 翻 译 可 以 说, 大 部 分 基 本 生 物 学 进 程 都 在 mirna 的 调 控 下 得 以 完 成, 比 如, 肿 瘤 细 胞 的 产 生 和 生 物 的 发 育, 以 及 细 胞 的 分 裂 生 长 死 亡 等 实 验 表 明, 可 以 被 mirna 所 调 控 的 蛋 白 编 码 基 因 占 总 基 因 的 1/3 以 上, 以 mirna 为 介 导 的 基 因 调 控 在 生 物 的 生 长 以 及 发 育 过 程 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用, 这 使 得 mirna 成 为 分 子 生 物 学 研 究 热 点 垂 体 位 于 丘 脑 下 部 的 腹 侧, 由 腺 垂 体 和 神 经 垂 体 两 部 分 组 成, 它 是 动 物 最 重 要 的 内 分 泌 腺 它 分 泌 多 种 激 素, 如 生 长 激 素 促 甲 状 腺 激 素 促 性 腺 素 等, 这 些 激 素 对 动 物 繁 殖 有 重 要 作 用 目 前 关 于 mirna 对 垂 体 发 育 及 功 能 调 控 的 研 究 甚 少 因 此, 本 研 究 通 过 基 因 芯 片 技 术 分 析 在 大 鼠 腺 垂 体 组 织 中 差 异 表 达 的 mirna, 筛 选 出 大 鼠 腺 垂 体 中 倾 向 表 达 的 mirnas, 运 用 TargetScan 靶 基 因 预 测 软 件 分 析 预 测 它 的 靶 基 因, 发 现 mirna-346 和 mirna-141-3p 可 能 作 用 于 靶 基 因 FSHR 从 而 我 们 利 用 PCR 方 法, 根 据 FSHR(Rattus)3 UTR 野 生 型 载 体 序 列 信 息 设 计 突 变 引 物, 将 靶 序 列 CAGTGTT(78-85) 突 变 为 GTCACAA GGCAGAC (127-133) 突 变 为 CCGTCTG, 以 野 生 型 载 体 为 模 板,PCR 扩 增 FSHR 基 因 的 3'UTR 突 变 序 列, 将 其 克 隆 到 pmir-rb-report 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体 中 由 于 mirna 作 用 于 靶 基 因 必 须 通 过 3 UTR 进 行, 因 此 我 们 将 事 先 构 建 好 的 报 告 基 因 载 体 与 mirna 进 行 共 转 染 实 验, 观 察 相 对 荧 光 值 的 变 化 ( 是 否 下 调 ) 来 证 明 mirna 与 1

引 言 靶 基 因 的 作 用 关 系 该 试 验 为 mirna-141-3p 和 mirna-346 可 能 通 过 对 FSHR 的 转 录 后 调 控 研 究 提 供 了 理 论 依 据, 并 对 进 一 步 研 究 mir-141-3p 和 mir-346 对 垂 体 的 发 育 生 殖 以 及 激 素 分 泌 等 功 能 可 能 产 生 的 调 控 作 用 提 供 重 要 参 考 2

第 一 篇 文 献 综 述 第 1 章 microrna 的 研 究 进 展 第 一 篇 文 献 综 述 第 1 章 microrna 的 研 究 进 展 1.1 mirna 的 发 现 及 概 念 1993 年,Lee 等 通 过 正 向 遗 传 学 方 法 对 线 虫 基 因 组 进 行 研 究 的 过 程 中, 偶 然 发 现 了 一 小 段 长 度 为 22nt 非 编 码 小 RNA 分 子 lin-4 [1] 从 此 开 启 了 人 类 探 索 mirna 的 征 程 研 究 发 现,lin-4 是 能 够 调 控 胚 胎 后 期 发 育 的 基 因, 主 要 通 过 在 翻 译 的 过 程 中 抑 制 核 蛋 白 lin-14 的 表 达, 降 低 lin-14 的 表 达 量, 从 而 调 节 线 虫 在 幼 虫 时 期 的 发 育 进 程 但 是, 研 究 人 员 当 时 并 没 有 意 识 到 这 一 类 小 RNA 的 重 要 性 直 到 2000 年, 与 之 相 似 的 let-7 被 Reinhart 等 人 在 线 虫 体 内 发 现 [2], 但 与 lin-4 不 同 的 是,let-7 在 进 化 的 过 程 中 更 具 有 保 守 性, 并 且 在 人 类 大 鼠 鸡 等 高 等 动 物 中 均 有 表 达 这 一 发 现 使 得 mirna 的 研 究 慢 慢 被 人 类 重 视,miRNA 在 生 命 活 动 中 的 作 用 也 逐 渐 被 人 们 所 熟 知 microrna( mirna ) 是 一 类 丰 富 的 主 要 用 于 调 控 基 因 表 达 的 非 编 码 的 小 RNA( 长 度 约 22nt), 其 在 转 录 后 调 节 诱 导 mrna 的 翻 译 或 者 抑 制, 从 而 使 其 降 解, 主 要 是 通 过 结 合 目 标 中 的 3 -UTR 区 来 达 到 目 的 [3-7] 可 以 说, 大 部 分 基 本 生 物 学 进 程 都 在 mirna 的 调 控 下 得 以 完 成, 比 如, 肿 瘤 细 胞 的 产 生 和 生 物 的 发 育, 以 及 细 胞 体 的 分 裂 生 长 死 亡 等 实 验 表 明, 可 以 被 mirna 所 调 控 的 蛋 白 编 码 基 因 占 总 基 因 的 1/3 以 上, 以 mirna 为 介 导 的 基 因 调 控 在 生 物 的 生 长 以 及 发 育 过 程 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用, 这 使 得 mirna 成 为 一 个 热 点 型 研 究 课 题 [8-13] 1.2 mirna 与 靶 基 因 的 作 用 机 制 mirna 对 靶 基 因 的 转 录 后 调 控 功 能 是 mirna 在 细 胞 内 生 物 学 的 主 要 功 能 目 前 的 研 究 表 明,miRNA 主 要 是 通 过 以 下 两 种 方 式 调 控 靶 基 因 : 第 一, 直 接 剪 切 靶 基 因 的 mrna 或 者 通 过 阻 断 靶 基 因 mrna 翻 译 来 调 控 这 种 方 式 不 会 影 响 到 mrna 的 稳 定 性, 只 会 对 蛋 白 表 达 水 平 产 生 影 响 蛋 白 质 表 达 水 平 在 mrna 的 降 3