北 京 大 学 医 学 部 学 位 论 文 原 创 性 声 明 和 使 用 授 权 说 明 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 : 所 呈 交 的 学 位 论 文, 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下, 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的 成 果 除 文 中

硕 士 研 究 生 学 位 论 文 论 文 题 目 :5- 氮 杂 胞 苷 对 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 的 影 响 姓 名 : 邵 翠 萍 学 号 : 10889045 院 ( 部 ): 基 础 医 学 院 专 业 : 人 体 解 剖 与 组 织 胚 胎 学 系 导 师 : 李 英 教 授 完 成 时 间 二 一 一 年 五 月

北 京 大 学 医 学 部 学 位 论 文 原 创 性 声 明 和 使 用 授 权 说 明 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 : 所 呈 交 的 学 位 论 文, 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下, 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的 成 果 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外, 本 论 文 不 含 任 何 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 作 品 或 成 果 对 本 文 的 研 究 做 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体, 均 已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 本 声 明 的 法 律 结 果 由 本 人 承 担 论 文 作 者 签 名 : 导 师 签 名 : 年 月 日 学 位 论 文 使 用 授 权 说 明 本 人 完 全 了 解 北 京 大 学 医 学 部 关 于 收 集 保 存 使 用 学 位 论 文 的 规 定, 即 : 按 照 学 校 要 求 提 交 学 位 论 文 的 印 刷 本 和 电 子 版 本 ; 学 校 有 权 保 存 学 位 论 文 的 印 刷 本 和 电 子 版 本, 并 提 供 目 录 检 索 与 阅 览 服 务 ; 学 校 可 以 采 用 影 印 缩 印 数 字 化 或 其 他 复 制 手 段 保 存 论 文 ; 在 不 以 赢 利 为 目 的 的 前 提 下, 学 校 可 以 公 布 论 文 的 部 分 或 全 部 内 容 请 选 择 图 书 馆 发 布 时 间 : 即 时 发 布 一 年 后 发 布 二 年 后 发 布 ( 保 密 论 文 需 注 明, 并 在 解 密 后 遵 守 此 规 定 ) 论 文 作 者 签 名 : 导 师 签 名 : 年 月 日

目 录 中 文 摘 要... 1 英 文 摘 要... 3 缩 略 词 表... 5 文 献 综 述... 7 前 言... 20 实 验 材 料 及 方 法... 22 实 验 结 果... 29 讨 论... 41 结 论... 47 参 考 文 献... 48 个 人 简 历... 60 致 谢... 61

5- 氮 杂 胞 苷 对 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 的 影 响 研 究 生 : 邵 翠 萍 导 师 : 李 英 教 授 北 京 大 学 基 础 医 学 院 人 体 解 剖 与 组 织 胚 胎 学 系 中 文 摘 要 研 究 目 的 : 通 过 研 究 5- 氮 杂 胞 苷 (5-azacytidine, 5-AzaC) 对 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 的 影 响, 初 步 探 讨 5- 氮 杂 胞 苷 影 响 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 的 机 制, 为 分 析 5- 氮 杂 胞 苷 治 疗 的 女 性 肿 瘤 患 者 卵 母 细 胞 发 育 情 况 及 其 受 精 能 力 等 问 题 提 供 重 要 的 实 验 依 据 和 理 论 基 础 研 究 方 法 : 小 鼠 卵 巢 中 获 取 生 发 泡 (germinal vesicle,gv) 期 卵 母 细 胞, 分 别 在 含 有 0 2.5 5 10 25 50 100 250μM 5- 氮 杂 胞 苷 的 培 养 液 中 进 行 体 外 培 养, 其 中 0μM 5- 氮 杂 胞 苷 组 为 正 常 对 照 组, 其 余 为 实 验 组 观 察 统 计 其 体 外 培 养 3 小 时 生 发 泡 破 裂 (germinal vesicle breakdown,gvbd) 率 和 17-18 小 时 第 一 极 体 (the first polar body,pb1) 排 出 率 ; 双 光 子 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 检 测 体 外 培 养 7-8 小 时 ( 第 一 次 减 数 分 裂 中 期,MⅠ) 和 17-18 小 时 ( 第 二 次 减 数 分 裂 中 期, MⅡ) 染 色 体 形 态 和 排 列 情 况 ;Annexin-V 试 剂 盒 检 测 体 外 培 养 7-8 小 时 的 卵 母 细 胞 早 期 凋 亡 情 况 ; 实 时 定 量 PCR 检 测 体 外 培 养 7-8 小 时 的 小 鼠 卵 母 细 胞 发 育 成 熟 相 关 细 胞 因 子 (GDF 9 和 BMP 15) 和 凋 亡 相 关 因 子 (caspase3 caspase8 和 caspase9) 的 mrna 水 平 将 实 验 组 与 正 常 对 照 组 的 诸 项 指 标 进 行 统 计 学 分 析, 比 较 组 间 差 异 研 究 结 果 :1 5- 氮 杂 胞 苷 浓 度 10μM 时, 各 实 验 组 GVBD 发 生 率 PB1 排 出 率 与 正 常 对 照 组 相 比 显 著 升 高 (P<0.05); 2 5- 氮 杂 胞 苷 浓 度 5μM 时, 各 实 验 组 M Ⅰ MⅡ 期 出 现 染 色 体 错 位 的 卵 母 细 胞 百 分 率 与 正 常 对 照 组 相 比 显 著 升 高 (P<0.05);3 体 外 培 养 7-8 小 时, 发 生 早 期 凋 亡 的 小 鼠 卵 母 细 胞 细 胞 膜 上 出 现 明 显 的 绿 色 荧 光 信 号 ;4 5- 氮 杂 胞 苷 浓 度 为 10μM 时, 体 外 培 养 7-8 小 时, 发 生 1

早 期 凋 亡 的 小 鼠 卵 母 细 胞 百 分 率 与 正 常 对 照 组 相 比 显 著 升 高 (P<0.05);5 5- 氮 杂 胞 苷 浓 度 为 10μM 时, 体 外 培 养 7-8 小 时, 小 鼠 卵 母 细 胞 发 育 成 熟 相 关 细 胞 因 子 (GDF 9 和 BMP 15) 和 凋 亡 相 关 因 子 (caspase3 caspase8 和 caspase9) 的 mrna 水 平 与 正 常 对 照 组 相 比 显 著 升 高 (P<0.05) 结 论 :1 5- 氮 杂 胞 苷 促 进 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 过 程 中 GVBD 的 发 生 和 PB1 的 排 出, 最 低 有 效 浓 度 为 10μM, 可 能 与 其 促 进 了 小 鼠 卵 母 细 胞 发 育 成 熟 相 关 细 胞 因 子 GDF 9 和 BMP 15 的 表 达 相 关 ;2 5- 氮 杂 胞 苷 可 引 起 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 过 程 中 MⅠ MⅡ 期 染 色 体 排 列 出 现 异 常, 最 低 有 效 浓 度 为 5μM;3 5- 氮 杂 胞 苷 促 进 小 鼠 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 过 程 中 早 期 凋 亡 的 发 生, 可 能 与 其 促 进 了 凋 亡 相 关 因 子 caspase3 caspase8 和 caspase9 的 表 达 相 关 关 键 词 :5- 氮 杂 胞 苷 ; 小 鼠 卵 母 细 胞 ; 早 期 凋 亡 ; 体 外 成 熟 2

Effects of 5-azacytidine on the maturation of mouse oocytes in vitro Master candidate: Cui-Ping Shao Supervisor: Prof. Ying Li Department of histology and embryology Peking University Health Science Center Abstract Objective: To investigate the effects of 5-azacytidine on the maturation and development of mouse oocytes in vitro and to explore the related mechanism. To provide important clues for analysis of the oocytes development and fertility of the 5-AzaC treated female cancer patients. Methods: GV-stage oocytes collected from mouse ovary were cultured in vitro in medium supplemented with 0 2.5 5 10 25 50 100 250μM 5-azacytidine respectively. 5-azacytidine is 0μM in the control group. We evaluated oocytes maturation by observing the rates of germinal vesicle breakdown (GVBD) and the first polar body (PB1) extrusion. The morphous and aligment of chromosomes at metaphaseⅠ(mⅠ) and metaphaseⅡ(mⅡ) were detected by using fluorescence staining and two-photon laser scanning microscopy. The early apoptosis of oocytes was investigated by Annexin-V apoptosis staining and the mrna levels of cytokines (GDF 9 and BMP 15) and related apoptotic factors (caspase 3, caspase 8 and caspase 9) were monitored by Quantitative-real-time PCR analysis. Results: 1. The rates of germinal vesicle breakdown (GVBD) and the first polar body (PB1) extrusion significantly increased when the concentration of 5-azacytidine 10μM compared with the control (P <0.05); 2. The rates of chromosome misalignments of mouse oocytes at MⅠand MⅡin vitro were significantly increased in the experimental groups when the concentration of 5-azacytidine 5μM compared with the control (P <0.05); 3. After 7-8h in vitro maturation (IVM), early apoptotic oocytes have a clear green fluorescence signal in the membrane; 4. The ratio of early 3

stage of apoptosis of mouse oocytes in 10μM 5-azacytidine were dramatically increased after 7-8h IVM compared with the control (P <0.05); 5. The mrna levels of cytokines (GDF 9 and BMP 15) and related apoptotic factors (caspase 3, caspase 8 and caspase 9) of mouse oocytes in 10μM 5-azacytidine were dramatically increased after 7-8h IVM compared with the control (P <0.05). Conclusion: 1. 5-azacytidine ( 10μM) promoted the occurrence of GVBD and extrusion of PB1 of mouse oocytes IVM when the concentration 10μM, which may be related to the increased expression of GDF 9 and BMP 15; 2. 5-azacytidine ( 5μM) induced chromosome misalignments at MⅠand MⅡof mouse oocytes IVM; 3. 5-azacytidine increased early apoptosis of mouse oocytes IVM which may be related to the increased expression of caspase 3, caspase 8 and caspase 9. [Keywords]: 5-azacytidine; Mouse oocytes; Early apoptosis; In vitro maturation 4

缩 略 词 表 缩 略 词 英 文 名 称 中 文 名 称 5-AzaC AS BAMB I BMP 15 BWS CGs COC CSF DMR DNMTs DO Emi2 FBS FSH GDF 9 GV GVBD HTF IVF IVM KL LH LSCM MAPK MDS 5-azacytidine Angelman syndrome bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor bone morphogenetic protein 15 Beckwith-Wiedemann Syndrome cortical granules cumulus oocyte complex cytostatic factor differential methylation region DNA methyltransferases denuded oocyte endogenous meiotic inhibitor 2 fetal bovine serum follicle-stimulating hormone growth differentiation factor 9 germinal vesicle germinal vesicle breakdown human tubular fluid medium in-vitro fertilization in-vitro maturation Kit ligand luteotropic hormone laser scanning confocal microscope mitogen activated protein kinase myelodysplastic syndrome 5- 氮 杂 胞 苷 安 格 尔 曼 综 合 征 骨 形 成 蛋 白 和 激 活 素 的 跨 膜 抑 制 剂 骨 形 态 发 生 蛋 白 15 贝 - 威 综 合 征 皮 质 颗 粒 卵 丘 - 卵 母 细 胞 复 合 体 细 胞 静 止 因 子 差 异 性 甲 基 化 区 域 DNA 甲 基 化 转 移 酶 裸 卵 内 源 性 减 数 分 裂 抑 制 因 子 2 胎 牛 血 清 卵 泡 刺 激 素 生 长 分 化 因 子 9 生 发 泡 生 发 泡 破 裂 人 输 卵 管 培 养 液 体 外 受 精 体 外 成 熟 Kit 配 体 促 黄 体 素 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 骨 髓 增 生 异 常 综 合 症 5

MM MPF MTOCs MⅠ MⅡ OMI PB1 PB2 PI3K PI PIP3 PKB PMSG PN PWS PS PMⅠ SRS 北 京 大 学 硕 士 学 位 论 文 multiple myeloma maturation promoting factor microtubule organizing centers metaphase of the first meiosis metaphase of the second meiosis oocyte maturation inhibitor the first polar body the second polar body phosphoinositide3-kinase phosphatidylinosistol phosphatidylinositoltri-phosphate protein kinase B Pregnant Mare Serum Gonadotrophin pronucleus Prader-Willi syndrome phosphatidylserine premetaphaseⅠ Silver-Russell syndrome 多 发 性 骨 髓 瘤 细 胞 成 熟 促 进 因 子 微 管 组 装 中 心 第 一 次 减 数 分 裂 中 期 第 二 次 减 数 分 裂 中 期 卵 母 细 胞 成 熟 抑 制 因 子 第 一 极 体 第 二 极 体 磷 脂 酰 肌 醇 3- 激 酶 磷 酸 化 磷 脂 酰 肌 醇 磷 酸 化 磷 脂 酰 肌 醇 三 磷 酸 蛋 白 激 酶 B 孕 马 血 清 促 性 腺 激 素 原 核 帕 - 魏 综 合 征 磷 脂 酰 丝 氨 酸 第 一 次 减 数 分 裂 前 中 期 塞 尔 沃 - 鲁 塞 尔 综 合 征 6

文 献 综 述 5- 氮 杂 胞 苷 (5-azacytidine, 5-AzaC), 又 名 阿 扎 胞 苷, 是 20 世 纪 60 年 代 捷 克 斯 洛 伐 克 的 化 学 家 研 制 的 化 学 治 疗 药 1 1980 年 发 现 5- 氮 杂 胞 苷 是 通 过 抑 制 DNA 甲 基 化 来 发 挥 抗 肿 瘤 作 用 的 2 2004 年, 美 国 FDA 批 准 5- 氮 杂 胞 苷 用 于 治 疗 骨 髓 异 常 增 生 综 合 征 (myelodysplastic syndrome,mds) 3, 成 为 历 史 上 第 一 个 进 入 临 床 应 用 的 DNA 甲 基 化 转 移 酶 (DNA methyltransferases,dnmts) 抑 制 剂 5- 氮 杂 胞 苷 现 已 被 用 于 乳 腺 癌 急 性 非 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 肠 癌 黑 色 素 瘤 儿 童 白 血 病 等 多 种 肿 瘤 的 治 疗, 是 一 种 广 泛 应 用 的 有 效 化 疗 药 物 目 前, 关 于 5- 氮 杂 胞 苷 促 进 肿 瘤 细 胞 凋 亡 的 研 究 已 经 比 较 深 入 4, 尽 管 已 有 学 者 开 始 关 注 其 对 哺 乳 动 物 正 常 体 细 胞 形 态 和 蛋 白 质 表 达 等 方 面 的 作 用 5-7,5- 氮 杂 胞 苷 对 生 殖 系 统 影 响 的 研 究 却 还 刚 刚 起 步 众 所 周 知, 生 殖 细 胞 的 正 常 发 育 和 成 熟 对 于 保 证 正 常 受 精 胚 胎 形 成 都 是 至 关 重 要 的 生 殖 细 胞 的 发 生 及 胚 胎 发 育 与 体 内 外 环 境 密 切 相 关 特 别 是 卵 母 细 胞, 其 发 育 过 程 中 极 易 受 到 各 种 体 内 外 因 素 的 影 响 8, 很 多 遗 传 病 都 是 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 中 各 种 因 素 导 致 染 色 体 分 离 异 常 或 不 分 离 造 成 的 9 近 年 来, 人 类 的 生 殖 健 康 问 题 日 益 严 重 并 越 来 越 受 到 关 注 WHO 统 计 资 料 显 示, 不 孕 不 育 夫 妇 占 已 婚 育 龄 夫 妇 的 比 率 高 达 14-15%, 我 国 情 况 也 不 容 乐 观, 平 均 每 6 对 夫 妇 就 有 1 对 有 生 育 问 题 IVF(in-vitro fertilization) 技 术 的 出 现 及 更 新 给 全 世 界 不 孕 不 育 夫 妇 带 来 了 福 音 10, 但 试 管 婴 儿 成 功 率 目 前 仍 徘 徊 在 20-30% 的 较 低 水 平, 许 多 不 孕 不 育 妇 女 的 激 素 水 平 正 常, 也 无 生 殖 管 道 阻 塞 等 器 质 性 病 变, 却 不 明 原 因 地 出 现 生 殖 障 碍 目 前 认 为, 环 境 因 素 是 造 成 不 孕 不 育 的 一 个 很 重 要 但 是 又 被 人 们 普 遍 忽 视 的 因 素 环 境 因 素 不 仅 包 括 人 们 所 处 的 生 长 饮 食 及 我 们 通 常 所 认 为 的 环 境, 还 包 括 用 药 等 各 方 面 的 因 素 11 有 研 究 发 现,5- 氮 杂 胞 苷 可 以 引 起 胚 胎 基 因 组 甲 基 化 水 平 的 广 泛 降 低 12, 但 关 于 其 对 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 影 响 的 研 究 却 极 少, 目 前 国 内 外 尚 未 见 研 究 报 道 现 对 卵 母 细 胞 发 育 过 程, 卵 母 细 胞 在 发 育 过 程 中 所 受 到 的 各 种 调 节, 以 及 5- 氮 杂 胞 苷 的 研 究 现 状 作 一 综 述 7

一 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 发 育 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 的 发 育 要 经 历 一 个 漫 长 的 时 期, 包 括 了 卵 母 细 胞 的 生 长 和 成 熟 两 个 过 程 如 图 1 所 示, 胚 胎 形 成 时 期, 产 生 于 卵 黄 囊 后 壁 胚 外 中 胚 层 的 原 始 生 殖 细 胞 向 生 殖 嵴 迁 移, 并 随 生 殖 腺 分 化, 形 成 卵 原 细 胞 之 后 不 断 进 行 有 丝 分 裂, 达 到 一 定 数 目 后, 开 始 第 一 次 减 数 分 裂 经 历 细 线 期 偶 线 期 粗 线 期 的 变 化 后, 在 胎 儿 出 生 前 后, 卵 母 细 胞 发 育 阻 滞 于 第 一 次 减 数 分 裂 前 期 (prophase I) 的 双 线 期 13 发 情 期 后, 在 体 内 促 黄 体 素 (luteotropic hormone,lh) 的 刺 激 作 用 下, 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 重 新 启 动, 完 成 第 一 次 减 数 分 裂, 并 排 出 第 一 极 体 (the first polar body,pb1) 成 熟 卵 泡 内 的 卵 母 细 胞 排 出, 等 待 受 精 卵 母 细 胞 受 精 以 后 迅 速 完 成 第 二 次 减 数 分 裂, 排 出 第 二 极 体 (the second polar body,pb2) 14,15, 形 成 受 精 卵 图 1 卵 母 细 胞 发 育 过 程 卵 泡 是 卵 巢 功 能 的 基 本 单 位, 由 一 层 或 多 层 颗 粒 细 胞 围 绕 卵 母 细 胞 所 构 成 16,17 卵 泡 在 胚 胎 时 期 形 成, 在 卵 泡 刺 激 素 (follicle-stimulating hormone, FSH) 的 作 用 下 18, 如 图 2 所 示, 分 别 经 历 了 原 始 卵 泡 窦 前 卵 泡 早 期 囊 状 卵 泡, 成 为 成 熟 卵 泡 成 熟 卵 泡 中 的 卵 母 细 胞 虽 然 已 经 生 长 完 全 ( 小 鼠 中 直 径 为 75 微 8

米 左 右, 人 类 为 100 微 米 左 右 ), 但 仍 然 处 于 第 一 次 减 数 分 裂 前 期, 在 LH 刺 激 作 用 下, 才 可 以 恢 复 减 数 分 裂 研 究 显 示, 将 卵 母 细 胞 从 卵 泡 内 移 除, 可 以 使 其 恢 复 减 数 分 裂, 这 说 明 卵 泡 颗 粒 细 胞 有 使 卵 母 细 胞 阻 滞 于 减 数 分 裂 前 期 的 作 用 19 在 人 体 内, 新 生 儿 两 侧 卵 巢 有 70-200 万 个 原 始 卵 泡,7-9 岁 时 约 有 30 万 个, 青 春 期 约 有 4 万 个, 至 40-50 岁 时 仅 剩 下 几 百 个 从 青 春 期 (13-14 岁 ) 至 更 年 期 (45-55 岁 ) 约 30-40 年 的 生 育 时 间 内, 卵 巢 在 垂 体 周 期 性 分 泌 的 促 性 腺 激 素 的 影 响 下, 每 隔 28 天 左 右 有 1 个 卵 泡 发 育 成 熟 并 排 出 1 个 卵 母 细 胞, 左 右 卵 巢 交 替 排 卵 正 常 女 性 一 生 中 约 排 卵 400-500 余 个, 其 余 约 99.9% 的 有 腔 卵 泡 均 在 发 育 的 不 同 阶 段 退 化 为 闭 锁 卵 泡 (atresic follicle) 20 图 2 哺 乳 动 物 卵 泡 发 育 过 程 卵 泡 由 颗 粒 细 胞 层 ( 蓝 色 ) 围 绕 卵 母 细 胞 ( 黄 色 ) 构 成 在 原 始 卵 泡 (primary follicles) 和 窦 前 卵 泡 (preantral follicles) 中 的 卵 母 细 胞 尚 未 获 得 进 行 减 数 分 裂 的 能 力, 从 卵 泡 中 移 除 后 无 法 发 育 成 熟 ; 在 早 期 囊 状 卵 泡 (early antral follicles) 中 的 卵 母 细 胞 具 有 减 数 分 裂 潜 能, 从 卵 泡 移 除 后 可 以 发 育 成 熟 在 FSH 的 刺 激 作 用 下, 早 期 窦 前 卵 泡 继 续 生 长 成 为 成 熟 卵 泡, 在 LH 峰 的 作 用 下 排 出 卵 母 细 胞 卵 母 细 胞 的 成 熟 是 指 卵 母 细 胞 恢 复 并 完 成 第 一 次 减 数 分 裂, 进 入 并 停 滞 于 第 二 次 减 数 分 裂 中 期 (metaphase of the second meiosis,mⅡ) 的 过 程 其 形 态 学 上 的 变 化 主 要 包 括 生 发 泡 的 破 裂 (germinal vesicle breakdown,gvbd) 和 第 一 极 体 (the 9

first polar body,pb1) 的 排 出 如 图 3 所 示, 在 卵 母 细 胞 从 生 发 泡 (germinal vesicle, GV) 期 发 育 到 MⅡ 的 过 程 中, 染 色 体 在 第 一 次 减 数 分 裂 中 期 (metaphase of the first meiosis,mⅠ) 和 第 二 次 减 数 分 裂 中 期 (MⅡ) 均 排 列 在 赤 道 板 (metaphase plate) 上 图 3 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 过 程 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 主 要 包 括 了 以 下 三 个 基 本 部 分 : 核 成 熟 恢 复 和 完 成 减 数 分 裂 到 第 二 次 减 数 分 裂 中 期 的 核 成 熟 ; 胞 质 成 熟 经 历 受 精 和 支 持 胚 胎 发 育 的 细 胞 质 成 熟 ; 基 因 成 熟 获 得 正 确 的 基 因 组 印 记 的 基 因 成 熟 1. 卵 母 细 胞 的 核 成 熟 卵 母 细 胞 的 核 成 熟 在 形 态 学 上 主 要 表 现 为 生 发 泡 的 破 裂 (GVBD) 和 第 一 极 体 (PB1) 的 排 出 (1) 生 发 泡 破 裂 ( GVBD) 成 熟 期 的 卵 母 细 胞 在 LH 刺 激 作 用 下 恢 复 减 数 分 裂 在 光 镜 下 可 见 细 胞 核 膜 破 裂, 核 仁 消 失, 核 内 物 质 与 核 质 混 合, 此 过 程 即 为 生 发 泡 破 裂 (GVBD) 21 GV 期 卵 母 细 胞 细 胞 核 由 颗 粒 性 染 色 质 丝 围 绕 核 仁 形 成 网 状 结 构, 其 间 有 许 多 空 隙 在 卵 母 细 胞 发 育 过 程 中, 空 隙 消 失, 核 仁 发 生 致 密 化, 核 孔 越 来 越 大, 密 度 增 大, 而 核 周 隙 则 逐 渐 变 窄, 越 来 越 难 以 分 辨 GVBD 发 生 时, 染 色 质 向 核 膜 侧 扩 散 迁 移, 核 仁 越 来 越 小, 同 时 核 膜 打 折 核 仁 的 消 失 早 于 核 膜 的 破 裂 GVBD 标 志 着 卵 母 细 10

胞 减 数 分 裂 的 恢 复 和 开 始 22,23 北 京 大 学 硕 士 学 位 论 文 一 些 研 究 表 明,GVBD 伴 随 着 卵 泡 的 生 长 过 程 而 发 生 24 也 有 报 道 认 为,GVBD 的 发 生 并 不 依 赖 于 卵 母 细 胞 的 生 长, GVBD 后 也 并 非 所 有 卵 母 细 胞 都 能 成 熟 和 排 出 第 一 极 体 在 体 外 培 养 过 程 中, 卵 母 细 胞 获 得 GVBD 的 能 力 和 从 MI 到 MII 期 的 进 程 是 分 离 的 25 (2) 第 一 极 体 (PB1) 排 出 未 成 熟 的 卵 母 细 胞, 胞 核 在 细 胞 中 央, 在 成 熟 过 程 中, 细 胞 核 逐 渐 迁 移 到 动 物 极 质 膜 下, 且 体 积 变 大, 生 发 泡 破 裂 (GVBD) 后, 减 数 分 裂 重 启 伴 随 着 卵 母 细 胞 第 一 次 减 数 分 裂 的 完 成, 卵 母 细 胞 在 动 物 极 附 近 排 出 第 一 极 体, 随 之, 卵 母 细 胞 发 育 至 第 二 次 减 数 分 裂 中 期 (MII 期 ), 等 待 受 精 第 一 极 体 的 排 放, 标 志 着 卵 母 细 胞 的 核 已 成 熟 26, 27 2. 卵 母 细 胞 的 胞 质 成 熟 从 哺 乳 动 物 卵 巢 的 卵 泡 中 获 取 的 卵 母 细 胞, 在 体 外 条 件 下 可 自 发 地 完 成 核 成 熟, 并 且 可 以 进 行 观 察 和 记 录 28 而 卵 母 细 胞 的 胞 质 成 熟 不 仅 有 细 胞 器 超 微 结 构 的 改 变, 而 且 还 发 生 了 诸 多 渐 变 的 细 胞 质 内 部 的 生 理 生 化 变 化, 但 缺 乏 直 观 的 标 记 细 胞 核 和 细 胞 质 的 成 熟 具 有 不 同 步 性, 但 同 时 又 具 有 相 互 协 调 和 相 互 促 进 的 作 用 第 一 极 体 的 排 出 早 于 细 胞 质 的 成 熟, 核 成 熟 后 经 过 一 段 时 间 的 发 育 后 才 能 达 到 胞 质 成 熟 卵 母 细 胞 的 胞 质 成 熟 质 量 对 于 受 精 和 胚 胎 发 育 都 起 着 决 定 性 的 作 用 29 (1) 线 粒 体 卵 母 细 胞 中 含 有 丰 富 的 线 粒 体 30, 线 粒 体 的 活 化 与 重 组 影 响 着 卵 母 细 胞 的 胞 质 成 熟 31,32, 线 粒 体 的 成 熟 状 况 决 定 着 卵 母 细 胞 发 育 成 熟 质 量 受 精 等 关 键 33 环 节 在 大 部 分 未 成 熟 卵 子 的 细 胞 质 中, 线 粒 体 簇 较 小, 线 粒 体 呈 周 边 分 布 在 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 中, 线 粒 体 数 量 增 加, 并 且 从 胞 质 皮 质 区 向 胞 质 内 部 迁 移 34 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 过 程 中, 线 粒 体 簇 变 大, 着 色 变 深, 发 育 潜 能 较 高 的 卵 子 的 线 粒 体 在 细 胞 质 中 多 呈 均 匀 分 布, 发 育 潜 能 较 低 的 卵 子 中, 线 粒 体 仍 维 持 周 边 分 布 胞 质 未 成 熟 时, 线 粒 体 不 能 在 胞 质 中 重 新 分 布, 这 与 卵 子 较 低 的 发 育 潜 能 密 切 相 关 35 卵 母 细 胞 发 育 过 程 中 线 粒 体 外 迁 和 增 殖, 为 卵 母 细 胞 和 卵 丘 细 胞 的 物 质 交 换 提 供 能 量 物 质 研 究 显 示, 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 胞 质 内 的 线 粒 体 在 细 胞 发 育 的 不 同 阶 段, 数 目 不 同 随 着 卵 母 细 胞 的 成 熟, 线 粒 体 数 目 呈 现 逐 渐 增 多 11

的 趋 势 36,37 (2) 皮 质 颗 粒 (cortical granules,cgs) 皮 质 颗 粒 是 卵 母 细 胞 特 有 的 一 种 细 胞 器, 它 对 保 证 单 精 受 精 和 胚 胎 正 常 发 育 有 重 要 作 用 38 CGs 在 细 胞 中 的 分 布 和 数 量 随 卵 母 细 胞 的 生 长 发 育 呈 现 出 明 显 的 变 化 GV 期 卵 母 细 胞 中, 皮 质 颗 粒 在 胞 质 内 散 在 分 布, 随 着 卵 母 细 胞 的 成 熟, 其 数 量 不 断 增 加, 并 逐 渐 向 皮 质 迁 移 卵 母 细 胞 发 育 至 MⅡ 期 时, 皮 质 颗 粒 全 部 分 布 在 皮 质 区, 邻 近 质 膜 处 最 多 当 CGs 位 于 卵 母 细 胞 皮 质 下 则 为 胞 质 成 熟, 位 于 中 部 或 由 正 中 部 向 边 缘 迁 移 则 为 胞 质 未 成 熟 39,40 (3) 微 管 蛋 白 聚 合 和 纺 锤 体 形 成 纺 锤 体 是 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 过 程 中 的 重 要 组 成 部 分, 是 由 微 管 蛋 白 在 染 色 体 所 在 部 位 聚 合 形 成 的 中 部 宽 阔 两 极 缩 小 的 纺 锤 状 结 构 41 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 在 核 膜 破 裂 后 不 久, 微 管 组 装 中 心 (microtubule organizing centers,mtocs) 在 染 色 体 附 近 聚 集, 形 成 一 个 双 极 纺 锤 体 在 细 胞 分 裂 中 期, 纺 锤 体 结 构 最 为 典 型 纺 锤 体 形 成 异 常, 会 导 致 减 数 分 裂 异 常, 有 可 能 产 生 异 常 的 胚 胎 而 纺 锤 体 对 细 胞 质 和 周 围 环 境 的 改 变 非 常 敏 感 42 在 细 胞 分 裂 过 程 中, 纺 锤 体 对 卵 母 细 胞 染 色 体 的 平 衡 运 动 分 配 和 极 体 的 排 出 有 非 常 重 要 的 作 用 有 相 当 一 部 分 无 纺 锤 体 的 卵 母 细 胞 本 身 存 在 染 色 体 的 异 常 43 3. 基 因 印 记 的 建 立 基 因 组 印 记 是 表 观 遗 传 学 中 的 一 个 重 要 部 分, 是 父 源 和 母 源 等 位 基 因 的 差 异 性 表 达, 对 胚 胎 发 育 和 个 体 健 康 具 有 非 常 重 要 的 意 义 基 因 组 印 记 通 过 对 基 因 进 行 修 饰, 不 改 变 基 因 的 序 列, 而 是 通 过 改 变 基 因 转 录 来 调 节 基 因 的 表 达 基 因 印 记 的 机 制 主 要 是 等 位 基 因 DNA 差 异 性 甲 基 化, 富 含 CpG 岛 (cytidine-phosphate-guanosine islands) 的 差 异 性 甲 基 化 区 域 (differential methylation region,dmr) 就 是 印 记 的 修 饰 位 点 44 基 因 组 印 记 使 得 父 源 和 母 源 某 些 等 位 基 因 只 有 一 个 在 胚 胎 中 能 表 达, 例 如, 父 源 等 位 基 因 被 印 记 者, 其 转 录 被 抑 制, 仅 表 达 母 源 等 位 基 因, 即 称 为 父 源 印 记 ; 而 母 源 等 位 基 因 被 印 记 后, 仅 表 达 父 源 等 位 基 因, 称 为 母 源 印 记 基 因 组 印 记 的 建 立 特 异 性 的 发 生 在 原 始 生 殖 细 胞 分 化 为 成 熟 生 殖 细 胞 的 过 程 中 在 卵 母 细 胞 发 育 阶 段, 母 源 印 记 随 着 卵 母 细 胞 的 发 育 和 体 积 的 增 大 逐 步 印 记 结 合 到 基 因 组 上 虽 然 印 记 基 因 只 占 基 因 组 很 小 的 部 分, 但 对 胚 胎 发 育 和 胎 盘 12

的 功 能 却 有 着 极 其 重 要 的 作 用 印 记 错 误 的 发 生 有 可 能 导 致 胚 胎 发 育 异 常, 甚 至 胚 胎 死 亡 先 天 性 畸 形 肿 瘤 等 疾 病 已 经 证 实, 许 多 先 天 性 综 合 征 与 基 因 组 印 记 错 误 有 关, 这 其 中 就 包 括 了 塞 尔 沃 - 鲁 塞 尔 综 合 征 (Silver-Russell syndrome, SRS), 普 拉 德 - 威 利 综 合 征 (Prader-Willi syndrome,pws), 安 格 尔 曼 综 合 征 (Angelman syndrome,as), 贝 - 威 综 合 征 (Beckwith-Wiedemann Syndrome,BWS) 和 威 姆 肿 瘤 等 45 二 卵 母 细 胞 发 育 过 程 中 的 细 胞 因 子 调 节 机 制 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 是 一 个 多 种 因 素 相 互 协 调 作 用 的 过 程, 研 究 发 现, 在 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 过 程 中, 有 三 个 生 化 因 子 表 现 最 为 活 跃 : 成 熟 促 进 因 子 (maturation promoting factor,mpf) 细 胞 静 止 因 子 (cytostatic factor,csf) 卵 母 细 胞 成 熟 抑 制 因 子 (oocyte maturation inhibitor,omi) MPF 催 化 一 些 与 细 胞 分 裂 有 关 的 蛋 白 质 发 生 磷 酸 化, 促 使 细 胞 向 分 裂 期 转 化 ;CSF 促 进 或 维 持 MPF 生 物 活 性 的 充 分 发 挥, 保 证 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 的 顺 利 进 行 ;OMI 则 抑 制 卵 母 细 胞 的 成 熟 分 裂, 在 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 的 阻 滞 与 重 启 中 扮 演 重 要 角 色 46-48 此 外, 近 期 研 究 也 发 现, 一 些 卵 母 细 胞 特 有 的 细 胞 因 子, 如 生 长 分 化 因 子 9(growth differentiation factor, GDF 9) 和 骨 形 态 发 生 蛋 白 15(bone morphogenetic protein, BMP 15) 也 在 卵 母 细 胞 的 发 育 成 熟 中 起 到 了 关 键 性 的 调 节 作 用 49 1. 成 熟 促 进 因 子 (MPF) 1971 年,Masui 和 Markert 在 非 洲 爪 蟾 卵 细 胞 质 中 发 现 有 一 种 物 质 可 以 诱 导 卵 母 细 胞 成 熟, 这 种 活 性 物 质 被 称 为 MPF, 又 称 作 细 胞 促 分 裂 因 子 (mitosis-promoting factor) 或 M 期 促 进 因 子 (M phase promoting factor) 50 MPF 的 活 性 对 于 启 动 减 数 分 裂, 维 持 减 数 分 裂 中 期 的 休 止 以 及 促 使 MI 向 MII 的 转 变 均 具 有 重 要 作 用 MPF 由 催 化 亚 单 位 P34cdc2 和 调 节 亚 单 位 周 期 蛋 白 (cyclin) 组 成, 是 由 M 期 Cyclin-Cdk(Cyclin dependent protein kinase, 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 ) 和 周 期 蛋 白 形 成 的 复 合 物,MPF=p34cdc2+cyclinB/A 在 真 核 生 物 中,MPF 是 细 胞 周 期 进 程 中 调 节 减 数 分 裂 的 重 要 细 胞 因 子 p34cdc2 具 有 蛋 白 激 酶 活 性, 能 使 多 种 蛋 白 质 底 物 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 磷 酸 化 cyclinb 是 MPF 的 调 节 单 位, 其 表 达 因 细 胞 周 期 而 变 化, 从 而 调 节 MPF 的 活 性 51 从 卵 泡 中 获 得 的 卵 母 细 胞, 卵 母 细 胞 内 的 MPF 水 平 很 低, 大 部 分 处 于 G2 期 向 M 期 转 变 的 生 发 泡 期, 在 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 中, 两 次 减 数 分 裂 转 变 过 程 会 伴 随 MPF 活 性 的 下 降 52 MPF 的 催 化 亚 单 位 为 13