乙酰胆碱受体自身抗体ELISA检测试剂盒使用说明

乙 酰 胆 碱 受 体 自 身 抗 体 ELISA 检 测 试 剂 盒 使 用 说 明 预 期 用 途 RSR 公 司 乙 酰 胆 碱 受 体 自 身 抗 体 (AChRAb)ELISA 检 测 试 剂 盒 仅 用 于 人 类 血 清 中 AChRAb 的 定 量 检, 需 专 业 技 术 人 员 操 作 针 对 乙 酰 胆 碱 受 体 (AChR) 的 自 身 抗 体 可 导 致 重 症 肌 无 力 患 者 神 经 肌 肉 接 头 功 能 的 缺 陷 这 些 抗 体 的 检 测 在 疾 病 诊 断 及 治 疗 中 具 有 重 要 的 价 值 参 考 文 献 R.Hewer et al A sensitive non-isotopic assay for acetylcholine receptor autoantibodies Clinica Chimica Acta 2006 364: 159-166 检 测 原 理 RSR s AChRAb ELISA 检 测 是 基 于 人 类 血 清 中 的 AChRAb 与 各 种 AChR 单 克 隆 抗 体 均 可 结 合 于 乙 酰 胆 碱 受 体 相 似 的 位 点 上 面, 这 些 单 克 隆 抗 体 包 括 MAb1( 包 被 于 微 孔 板 ) 和 / 或 MAb2 及 MAb3( 被 生 物 素 标 记 ) 在 没 有 AChRAb 存 在 的 情 况 下, 包 被 于 微 孔 板 的 MAb1,AChR 和 生 物 素 标 记 的 MAb2 及 MAb3 之 间 可 形 成 免 疫 复 合 物 MAb2- 和 MAb3- 生 物 素 结 合 量 随 后 可 通 过 添 加 链 霉 亲 和 素 - 过 氧 化 物 酶 (SA-POD) 的 量 来 决 定 的, 它 与 生 物 素 特 异 性 的 结 合 弃 去 未 结 合 的 链 霉 亲 和 素 - 过 氧 化 物 酶, 加 入 底 物 TMB, 形 成 蓝 色 复 合 物 加 入 终 止 剂 终 止 反 应, 微 孔 板 由 蓝 色 变 为 黄 色, 在 波 长 450nm 读 取 吸 光 度 在 AChRAb 存 在 的 情 况 下, MAb1- AChR-MAb2-/MAb3- 生 物 素 复 合 物 的 形 成 受 到 抑 制, 导 致 SA-POD 结 合 量 减 少, 继 而 在 450nm 吸 光 度 减 少 待 测 血 清 中 AChRAb 浓 度 越 高,MAb- 生 物 素 结 合 的 抑 制 作 用 越 明 显 当 使 用 试 剂 盒 标 准 品 时, 检 测 范 围 是 0.45-20 nmol/l 结 合 毒 素 量 血 清 样 本 的 贮 存 和 制 备 待 测 血 清 应 该 在 分 离 后 迅 速 检 测 或 零 下 20 度 分 装 贮 存 每 份 样 本 需 要 100μL 血 清 ( 实 验 建 议 进 行 复 孔 ) 尽 量 避 免 反 复 冻 融, 防 止 储 存 温 度 过 高 避 免 使 用 脂 血 溶 血 的 样 本, 不 宜 使 用 血 浆 进 行 检 测 需 要 时, 在 室 温 下 解 冻 测 试 血 清 并 轻 轻 混 匀 当 血 清 含 有 絮 状 物 或 者 颗 粒 时, 需 要 离 心 以 去 除 颗 粒 物 质 ( 推 荐 速 度 :10-15,000g, 离 心 5 分 钟 ), 请 勿 省 略 离 心 处 理 步 骤 IFU 符 号 符 号 含 义 欧 洲 委 员 会 符 合 性 说 明 书

体 外 诊 断 医 疗 器 械 产 品 样 本 号, 目 录 编 号 批 号 参 阅 使 用 说 明 生 产 商 有 效 日 期 阳 性 质 控 阴 性 质 控 实 验 设 备 微 量 加 样 器 : 可 以 加 样 25μL,50μL 和 100μL 能 够 按 量 配 给 多 种 体 积 以 复 溶 或 稀 释 试 剂 的 方 法 EP 管 纯 净 水 可 以 检 测 96 孔 酶 标 板 的 酶 标 仪, 并 可 在 450nm 处 测 量 酶 标 板 振 荡 器, 可 以 500 振 / 分 钟 ( 不 是 轨 道 振 荡 器 ) ELISA 微 孔 板 盖 试 剂 盒 组 成 存 放 未 打 开 试 剂 盒 及 其 所 有 成 分 于 2-8oC Foetal type AChR 胎 儿 型 乙 酰 胆 碱 受 体 3 0.7mL 冻 干 粉 状 A 每 瓶 加 入 0.7mLAChR 复 溶 缓 冲 液 (C) 轻 轻 混 匀, 使 用 前 室 温 (20-25 o C) 放 置 5 分 钟 当 使 用 多 瓶 时, 将 其 合 在 一 起 充 分 混 匀 使 用 溶 解 后 可 在 2-8 0 C 保 存 6 小 时 1 B Adult type AChR 成 人 型 乙 酰 胆 碱 受 体 3 0.5mL 冻 干 粉 状 每 瓶 B 中 加 入 0.5mL 复 溶 的 胎 儿 型 乙 酰 胆 碱 受 体 (A), 形 成 胎 儿 型 和 成 人 A+B 型 乙 酰 胆 碱 受 体 混 合 液 (A+B), 轻 轻 混 匀, 使 用 前 室 温 (20-25 o C) 放 置 5 分 钟 当 使 用 多 瓶 时, 将 其 合 在 一 起 充 分 混 匀 使 用 溶 解 后 可 在 2-8 0 C 保 存 6 小 时 1 C Reconstitution Buffer for AChR 乙 酰 胆 碱 受 体 复 溶 缓 冲 液 1 5mL AChR MAb1 Coated wells AChR MAb1 包 被 微 孔 板 D 每 个 框 架 中 设 12 个 分 隔 条, 每 条 8 孔 ( 共 96 孔 ), 密 封 保 存 于 箔 袋 中 开 封 前 提 前 室 温 (20-25 ) 放 置 至 少 30 分 钟 微 孔 条 需 与 所 提 供 的 底 架 牢 固 结 合 开 封 后 未 使 用 的 任 何 微 孔 条 均 应 放 回 原 先 的 箔

E1-4 F1-2 G H 袋, 并 以 胶 带 密 封 将 箔 袋 置 于 装 有 干 燥 剂 的 自 封 式 塑 料 袋 中, 有 效 期 内 2-8 0 C 保 存 Calibrators 标 准 品 0.5,1.0,6.5 和 20nmol/l 结 合 毒 素 量 4 0.7mL Positive Controls 阳 性 对 照 I 和 II ( 浓 度 范 围 详 见 标 签 ) 2 0.7mL Negative Control 阴 性 对 照 3.0mL AChR MAb-Biotin(MAb2+MAb3) 生 物 素 标 记 的 MAb (MAb2+MAb3) 3 瓶 冻 干 粉 状 见 瓶 外 标 签, 每 瓶 中 加 入 定 量 的 生 物 素 复 溶 缓 冲 液 (I), 轻 轻 混 匀, 使 用 前 室 温 (20-25 o C) 放 置 5 分 钟 当 使 用 多 瓶 时, 将 其 合 在 一 起 充 分 混 匀 使 用 溶 解 后 可 在 有 效 期 内 2-8 0 C 保 存 Reconstitution Buffer for MAb-biotin MAb- 生 物 素 复 溶 缓 冲 液 I 15mL Streptavidin Peroxidase(SA-POD) 链 霉 亲 和 素 - 过 氧 化 物 酶 0.7mL J 浓 缩 型 用 SA-POD 稀 释 液 (K)1 比 20 稀 释 例 如,0.5mL(J)+9.5mL(K). 稀 释 后 有 效 期 内 2-8 贮 存 Diluent for SA-POD SA-POD 稀 释 液 K 15mL Peroxidase Substrate(TMB) 过 氧 化 物 酶 底 物 L 15mL Concentrated wash solution 浓 缩 洗 液 100mL M 浓 缩 型 使 用 前 用 纯 净 水 1 比 10 稀 释 例 如,100mL(M)+900mL 纯 净 水. 稀 释 后 有 效 期 内 2-8 贮 存 Stop solution 终 止 液 N 10mL 1 使 用 2-8 0 C 保 存 6 小 时 的 复 溶 AChR,450nm 吸 光 度 将 降 低 10-15% 实 验 步 骤 所 有 试 剂 使 用 前 需 室 温 放 置 (20-25 ) 至 少 30 分 钟 ; 在 步 骤 2,5,7,9 和 10 中 建 议 使 用

Eppendorf 移 液 器 加 入 100μL 样 本 至 1.5mLEP 管, 依 次 标 记 ( 样 本 包 括 : 标 准 品 (E1 1-4)- 可 省 略 ), 阳 性 对 照 (F1-2) 和 阴 性 对 照 (G) 以 及 待 测 血 清 ) 加 入 25μL 胎 儿 型 和 成 人 型 AChR 混 合 液 (A+B) 至 每 个 EP 管 ( 步 骤 1) 一 并 盖 紧 管 盖 确 保 每 管 中 所 有 液 体 都 在 管 底 部 ( 若 可 疑, 可 用 低 速 离 心 天 2 机 以 10-15,000g 离 心 10 秒 钟 ), 轻 轻 混 匀,2-8 孵 育 过 夜 (16-20 小 时 ) 步 骤 2 中 的 每 管 样 本 -AChR 混 合 物 在 漩 涡 混 合 器 中 轻 微 混 合 每 份 样 3 本 -AChR 混 合 物 成 对 取 50μL 加 入 微 孔 板 小 孔 中 (D), 留 两 孔 作 为 空 白 孔 二 天 盖 好 微 孔 板, 将 微 孔 板 至 于 ELISA 板 振 荡 器, 室 温 放 置 1 小 时 (500 振 / 分 ) 用 洗 板 机 抽 出 试 剂, 并 用 稀 释 好 的 洗 液 (M), 在 洗 板 机 上 进 行 三 次 洗 板 若 未 配 4 备 洗 板 机, 可 将 微 孔 板 框 架 在 适 当 的 容 器 上 快 速 翻 转, 以 去 除 孔 内 物 质, 然 后 手 洗 三 次, 再 将 倒 置 的 孔 板 在 清 洁 的 吸 水 纸 上 轻 轻 拍 打, 从 而 清 除 残 余 的 洗 涤 剂 每 孔 中 加 入 50μLMAb-Biotin(H) 复 溶 液 盖 好 微 孔 板, 将 微 孔 板 至 于 ELISA 5 板 振 荡 器, 室 温 放 置 1 小 时 (500 振 / 分 ) 6 重 复 洗 涤 步 骤 4 每 孔 中 加 入 100μL 稀 释 的 SA-POD(J) 盖 好 微 孔 板, 将 微 孔 板 至 于 ELISA 7 板 振 荡 器, 室 温 放 置 30 分 钟 (500 振 / 分 ) 8 用 洗 板 机 抽 出 试 剂, 并 用 稀 释 好 的 洗 液 (M), 在 洗 板 机 上 进 行 三 次 洗 板 若 未 配 备 洗 板 机, 可 将 微 孔 板 框 架 在 适 当 的 容 器 上 快 速 翻 转, 以 去 除 孔 内 物 质, 然 后 用 稀 释 好 的 洗 液 手 洗 3 次, 纯 水 洗 1 次, 再 将 倒 置 的 孔 板 在 清 洁 的 吸 水 纸 上 轻 轻 拍 打, 从 而 清 除 残 余 的 洗 涤 剂 9 每 孔 加 入 100μLTMB(L), 避 光 室 温 放 置 30 分 钟, 无 需 振 荡 每 孔 加 入 50μL 终 止 液 (N), 在 震 荡 器 上 振 荡 约 5 秒 钟 确 保 每 孔 底 物 孵 10 育 时 间 相 同 用 酶 标 仪 在 450nm 处 读 数 每 孔 的 吸 光 度, 空 白 对 照 孔 仅 含 有 100μLTMB 11 底 物 (L) 和 50μL 终 止 液 (N) 结 果 分 析 标 准 曲 线 可 以 通 过 X 轴 的 标 准 品 浓 度 ( 包 括 阴 性 对 照 值 为 0.2nmol/L ( 线 性 域 )) 与 Y 轴 的 标 准 品 的 吸 光 度 ( 线 性 域 ) 建 立 患 者 血 清 中 AChRAb 浓 度 可 以 从 标 准 曲 线 读 出 此 说 明 书 数 据 是 由 线 性 / 线 性 4 参 数 曲 线 得 来 当 样 本 中 AChRAb 浓 度 过 高 时, 可 以 用 阴 性 对 照 (G) 来 稀 释 例 如 10ul 样 本 +90ul 阴 性 对 照, 相 当 于 10 倍 稀 释 其 他 稀 释 样 品 ( 例 如 100 倍 ) 可 以 从 10 倍 稀 释 液 制 备 或 视 情 况 而 定 一 些 血 清 的 稀 释 不 会 呈 线 性, 我 们 建 议 取 抑 制 率 为 50% 左 右 时 的 稀 释 倍 数 来 计 算 AChRAb 浓 度 使 用 标 准 曲 线 举 例 ( 仅 作 示 例, 不 用 于 实 际 结 果 计 算 ) 样 本 450 吸 光 度 浓 度 nmol/l 阴 性 对 照 G 1.970 0.2 2 E1 1.616 0.5 E2 1.329 1.0 E3 0.524 6.5 E4 0.144 20 阳 性 对 照 F1 0.469 7.5

阳 性 对 照 F2 1.124 1.6 2 见 上 结 果 分 析 结 果 也 可 通 过 AChR 结 合 抑 制 率 (%I) 来 表 达, 抑 制 率 可 以 通 过 下 述 公 式 计 算 出 : 100 (1-450nm 处 待 测 血 清 吸 光 度 /450nm 处 阴 性 对 照 (G) 吸 光 度 ) 上 述 I% 抑 制 率 值 可 以 用 下 述 公 式 转 换 成 nmol/l 毒 素 结 合 量 : 0.2 2 (0.067 I% 待 测 血 清 抑 制 率 ) 这 个 公 式 的 产 生 是 根 据 比 较 由 RSR ELISA 和 RIA 试 剂 盒 所 得 AChRAb 检 测 结 果 使 用 抑 制 率 I% 举 例 样 本 450nm 吸 光 度 抑 制 率 计 算 浓 度 nmol/l 阴 性 对 照 G 1.97 0 0.2 阳 性 对 照 F1 0.46 76.2 6.9 阳 性 对 照 F2 0.12 42.9 1.5 检 测 临 界 值 Cut off nmol/l 阴 性 <0.45 阳 性 0.45 性 能 评 价 临 床 特 异 性 用 本 试 剂 盒 对 302 名 健 康 志 愿 者 的 血 清 进 行 检 测, 所 有 样 本 的 AChRAb 检 测 结 果 均 为 阴 性 (100%) 临 床 灵 敏 度 用 本 试 剂 盒 对 83 名 诊 断 为 重 症 肌 无 力 病 的 患 者 的 血 清 样 本 进 行 检 测, 其 中 76 例 (92%)

AChR 自 身 抗 体 为 阳 性 检 测 下 限 将 本 试 剂 盒 的 阴 性 对 照 检 测 20 次, 计 算 平 均 值 和 标 准 差,2 个 标 准 差 条 件 下 的 检 测 下 限 为 0.25nmol/L 批 间 精 密 度 (n=20) 样 本 抑 制 率 (%) CV(%) nmol/l CV(%) 1 76.4 3.3 7.7 8.7 2 52.4 6.7 2.0 11.1 3 27.3 9.4 0.62 9.4 批 内 精 密 度 (n=20) 样 本 抑 制 率 (%) CV(%) nmol/l CV(%) 4 90.8 0.6 13.5 2.5 5 45.9 2.4 1.7 5.2 6 25.9 7.1 0.67 8.5 临 床 准 确 性 用 本 试 剂 盒 对 90 例 非 重 症 肌 无 力 病 的 自 身 免 疫 疾 病 患 者 血 清 进 行 检 测, 结 果 显 示 抗 体 对 甲 状 腺 球 蛋 白 (n=10), 甲 状 腺 过 氧 化 物 酶 (n=11), 双 链 DNA(n=9),TSH 受 体 (n=40), 谷 氨 酸 脱 酸 酶 (n=10), 21- 羟 化 酶 (n=10) 及 类 风 湿 因 子 (n=27) 对 本 实 验 结 果 无 影 响, 无 干 扰 另 外 有 两 个 样 本, 一 个 是 Graves 病 的 患 者 (TRAb 阳 性 )AChRAb 的 浓 度 为 0.74nmol/L (28% 抑 制 率 ), 另 一 个 是 系 统 性 红 斑 狼 疮 的 患 者 (dsdna 抗 体 阳 性 )AChRAb 浓 度 为 1.5nmol/L (44% 抑 制 率 ), 当 使 用 RSR AChRAb RIA 试 剂 盒 检 测 这 两 个 样 本 时, 其 结 果 为 阳 性 ( 分 别 为 1.3 和 1.5nmol/L) 再 有 二 个 是 类 风 湿 关 节 炎 的 患 者 ( 类 风 湿 因 子 阳 性 ) AChRAb 浓 度 分 别 为 0.77nmol/L (24% 抑 制 率 ) 和 0.61nmol/L (19% 抑 制 率 ) 当 使 用 RSR AChRAb RIA 时, 一 位 患 者 AChRAb 阳 性 干 扰 性 当 待 检 样 本 中 混 有 以 下 物 质 时, 对 检 测 结 果 并 无 干 扰 : 血 色 素 500mg/dL, 胆 红 素 20mg/dL, 脂 肪 乳 剂 3000mg/dL 以 下 检 测 漂 移 用 本 试 剂 盒 进 行 检 测 可 能 会 出 现 轻 微 的 漂 移, 其 中 各 步 骤 孵 育 时 间 是 关 键, 同 时 其 余 的 条 件 也 应 按 说 明 书 中 要 求, 以 保 证 最 佳 实 验 结 果 本 说 明 书 中 引 用 的 数 据 仅 有 指 导 作 用 我 们 推 荐 每 个 实 验 室 在 检 测 中 建 立 自 己 的 质 控 样 本 模 式, 同 时 也 应 该 建 立 自 己 的 TRAb 的 正 常 值 和 病 原 学 上 有 参 考 意 义 的 检 测 范 围 安 全 性 本 试 剂 盒 用 于 体 外 检 测, 需 由 专 业 技 术 人 员 根 据 说 明 书 进 行 操 作 请 关 注 标 签 上 注 明 的 有 效

期 和 组 份 的 稳 定 性 包 括 包 被 微 孔 板 及 稀 释 或 复 溶 试 剂 详 细 的 安 全 信 息 参 见 材 料 安 全 数 据 清 单 试 剂 盒 中 的 所 有 组 分 避 免 食 入, 吸 入, 注 射 和 直 接 接 触 到 皮 肤 眼 睛 衣 服 穿 用 防 护 衣 用 于 本 试 剂 盒 中 的 人 源 性 材 料 与 HIV1,HIV2,HCV 抗 体, 及 HBsAg 并 无 反 应, 且 已 经 得 到 验 证, 但 我 们 在 处 理 这 些 潜 在 的 感 染 也 应 该 多 注 意 如 果 存 在 污 染, 我 们 在 离 开 实 验 室 之 前 应 彻 底 的 洗 手 潜 在 的 污 染 废 物 包 括 样 本 在 内, 在 处 理 之 前 应 进 行 灭 菌 本 试 剂 盒 涉 及 的 非 人 源 性 的 材 料 ( 如 来 自 动 物 ) 已 经 证 实 均 来 自 健 康 的 动 物, 但 这 些 物 质 我 们 也 按 潜 在 的 感 染 源 进 行 处 理 试 剂 盒 中 有 一 些 组 分 包 括 少 量 叠 氮 化 钠 作 为 防 腐 剂 在 处 理 试 剂 盒 组 分 时, 要 用 大 量 的 水 冲 洗 排 水 系 统, 避 免 形 成 重 金 属 复 合 物 简 要 操 作 步 骤 所 有 的 试 剂 组 分 及 样 本 在 检 测 前 需 室 温 放 置 (20-25 o C) 一 天 二 天 加 样 在 1.5ml EP 管 中 分 别 加 入 100ul 标 准 品 ( 可 省 ), 阳 性 和 阴 性 对 照 及 患 者 血 清 加 样 加 入 25ul AChR( 胎 儿 型 和 成 人 型 混 合 物 )( 如 果 需 要 可 离 心 ), 混 匀 孵 育 2-8 0 C,16-20 小 时 加 样 除 去 空 白 孔, 每 孔 加 50ul 样 本 AChR 混 合 物, 复 孔 孵 育 ELISA 板 振 荡 器 上 室 温 放 置 1 小 时 (500 振 / 分 ) 弃 去 反 应 液 微 孔 板 洗 板 用 稀 释 好 的 洗 液 洗 板 3 次, 将 多 余 的 液 体 拍 干 加 样 除 去 空 白 孔, 每 孔 加 入 50ul 复 溶 的 AChR MAb- 生 物 素 孵 育 ELISA 板 振 荡 器 上 室 温 放 置 1 小 时 (500 振 / 分 ) 弃 去 反 应 液 微 孔 板 洗 板 用 稀 释 好 的 洗 液 洗 板 3 次, 将 多 余 的 液 体 拍 干 加 样 除 去 空 白 孔, 每 孔 中 加 入 100ul 稀 释 好 的 链 霉 亲 和 素 过 氧 化 物 酶 (J) 孵 育 ELISA 板 振 荡 器 上 室 温 放 置 30 分 钟 (500 振 / 分 ) 弃 去 反 应 液 微 孔 板 洗 板 用 稀 释 好 的 洗 液 洗 板 3 次, 纯 净 水 1 次 3, 将 多 余 的 液 体 拍 干 加 样 每 孔 中 加 入 100ulTMB(L), 孵 育 避 光 室 温 (20-25 0 C) 放 置 30 分 钟, 无 需 振 荡 加 样 每 孔 中 加 入 50ul 终 止 液 (N), 在 振 荡 器 上 振 荡 约 5 秒 钟 在 波 长 450nm 下 读 取 每 孔 的 OD 值 3 用 洗 板 机 可 省 略