学 校 编 码 :10384 分 类 号 密 级 学 号 :21620071152037 UDC 硕 士 学 位 论 文 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 突 变 Detection of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis with Probe Melting Analysis 张 轶 指 导 教 师 姓 名 : 李 庆 阁 教 授 专 业 名 称 : 细 胞 生 物 学 论 文 提 交 日 期 : 2010 年 6 月 论 文 答 辩 时 间 : 2010 年 7 月 学 位 授 予 日 期 : 答 辩 委 员 会 主 席 : 评 阅 人 : 2010 年 7 月
厦 门 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 呈 交 的 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 指 导 下, 独 立 完 成 的 研 究 成 果 本 人 在 论 文 写 作 中 参 考 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 的 研 究 成 果, 均 在 文 中 以 适 当 方 式 明 确 标 明, 并 符 合 法 律 规 范 和 厦 门 大 学 研 究 生 学 术 活 动 规 范 ( 试 行 ) 另 外, 该 学 位 论 文 为 ( ) 课 题 ( 组 ) 的 研 究 成 果, 获 得 ( ) 课 题 ( 组 ) 经 费 或 实 验 室 的 资 助, 在 ( ) 实 验 室 完 成 ( 请 在 以 上 括 号 内 填 写 课 题 或 课 题 组 负 责 人 或 实 验 室 名 称, 未 有 此 项 声 明 内 容 的, 可 以 不 作 特 别 声 明 ) 声 明 人 ( 签 名 ): 年 月 日
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厦 门 大 学 学 位 论 文 著 作 权 使 用 声 明 本 人 同 意 厦 门 大 学 根 据 中 华 人 民 共 和 国 学 位 条 例 暂 行 实 施 办 法 等 规 定 保 留 和 使 用 此 学 位 论 文, 并 向 主 管 部 门 或 其 指 定 机 构 送 交 学 位 论 文 ( 包 括 纸 质 版 和 电 子 版 ), 允 许 学 位 论 文 进 入 厦 门 大 学 图 书 馆 及 其 数 据 库 被 查 阅 借 阅 本 人 同 意 厦 门 大 学 将 学 位 论 文 加 入 全 国 博 士 硕 士 学 位 论 文 共 建 单 位 数 据 库 进 行 检 索, 将 学 位 论 文 的 标 题 和 摘 要 汇 编 出 版, 采 用 影 印 缩 印 或 者 其 它 方 式 合 理 复 制 学 位 论 文 本 学 位 论 文 属 于 : ( )1. 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 查 核 定 的 保 密 学 位 论 文, 于 年 月 日 解 密, 解 密 后 适 用 上 述 授 权 ( )2. 不 保 密, 适 用 上 述 授 权 ( 请 在 以 上 相 应 括 号 内 打 或 填 上 相 应 内 容 保 密 学 位 论 文 应 是 已 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 定 过 的 学 位 论 文, 未 经 厦 门 大 学 保 密 委 员 会 审 定 的 学 位 论 文 均 为 公 开 学 位 论 文 此 声 明 栏 不 填 写 的, 默 认 为 公 开 学 位 论 文, 均 适 用 上 述 授 权 ) 声 明 人 ( 签 名 ): 年 月 日
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目 录 摘 要...1 Abstract...3 第 一 章 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变...5 第 一 节 引 言... 5 1.1 结 核 分 枝 杆 菌 流 行 病 学 研 究... 5 1.2 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 机 制...6 1.3 结 核 分 枝 杆 菌 基 因 分 型 技 术...7 1.4 探 针 熔 解 分 析 方 法...8 第 二 节 材 料 与 方 法... 8 2.1 样 品 来 源... 8 2.2 基 因 组 DNA 提 取... 9 2.3 检 测 用 引 物 探 针 的 设 计... 9 2.4 探 针 靶 序 列 考 察... 9 2.5 引 物 筛 选 及 实 时 PCR 体 系 构 建...10 2.6 灵 敏 度 分 析...10 2.7 特 异 性 分 析...10 2.8 不 均 一 耐 药 检 测 能 力 分 析... 11 2.9 探 针 熔 解 分 析 法 检 测 1753 份 标 本... 11 2.10 DNA 测 序 分 析... 11 第 三 节 结 果 与 分 析... 11 3.1 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变 实 时 PCR 体 系 的 原 理... 11 3.2 探 针 靶 序 列 区 分 效 果 考 察...13 3.3 灵 敏 度 实 验...14 3.4 特 异 性 实 验...15 3.5 不 均 一 耐 药 检 测 能 力 分 析...16 3.6 1753 份 样 本 的 检 测...17 第 四 节 讨 论...31 第 二 章 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 氟 喹 诺 酮 类 耐 药 突 变...33 第 一 节 引 言...33 1.1 结 核 分 枝 杆 菌 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 机 制 及 检 测 方 法...33 第 二 节 材 料 与 方 法...34 2.1 样 品 来 源...34 2.2 基 因 组 DNA 提 取...35 1
2.3 检 测 用 引 物 探 针 的 设 计...35 2.4 探 针 靶 序 列 考 察...35 2.5 引 物 筛 选 及 实 时 PCR 体 系 构 建...36 2.6 灵 敏 度 分 析...36 2.7 特 异 性 分 析...36 2.8 不 均 一 耐 药 检 测 能 力 分 析...37 2.9 探 针 熔 解 分 析 法 检 测 1753 份 标 本...37 2.10 DNA 测 序 分 析...37 第 三 节 结 果 与 分 析...37 3.1 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 突 变 实 时 PCR 体 系 的 原 理...37 3.2 探 针 靶 序 列 区 分 效 果 考 察...38 3.3 灵 敏 度 实 验...39 3.4 特 异 性 实 验...40 3.5 不 均 一 耐 药 检 测 能 力 分 析...41 3.6 1753 份 标 本 的 检 测...42 第 四 节 讨 论...47 参 考 文 献...48 致 谢...53 2
CONTENTS CONTENTS Abstract (In Chinese)...1 Abstract (In English)...3 Chapter Ⅰ : Detection of Rifampin-resistant Mycobaterium tuberculosis with Probe Melting Analysis...5 SectionⅠIntroduction...5 1.1 Epidemiology of Mycobacterium tuberculosis...5 1.2 The mechanism of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis...6 1.3 Molecular methods to detect rifampin resisitance...7 1.4 Probe Melting Analysis...8 Section II Materials and Methods...8 2.1 Sample selection...8 2.2 Extraction of genomic DNA...9 2.3 Primers and probes...9 2.4 Thermal denaturation analysis for probes...9 2.5 Real-tme PCR assay...10 2.6 Sensitivity...10 2.7 Specificity...10 2.8 Detection of heteroresistant sample...11 2.9 Detection of 1753 samples...11 2.10 Sequencing...11 Section Ⅲ Results...11 3.1 Principle of Detection of Rifampin-resistant Mycobaterium tuberculosis with Probe Melting Analysis...11 3.2 Results of thermal denaturation analysis for probes...13 3.3 Results of sensitivity...14 3.4 Results of specificity...15 3.5 Results of heteroresistant sample...16 3.6 Results of 1753 samples...17 Section Ⅳ Discussion...31 Chapter II: Detection of Fluoroquinolones-resistant Mycobaterium tuberculosis with Probe Melting Analysis...33 SectionⅠ Introduction...33 1.1 The mechanism of fluoroquinolones resistance in Mycobacterium tuberculosis...33 Section II Materials and Methods...34 1
CONTENTS 2.1 Sample selection...34 2.2 Extraction of genomic DNA...35 2.3 Primers and probes...35 2.4 Thermal denaturation analysis for probes...35 2.5 Real-tme PCR assay...36 2.6 Sensitivity...36 2.7 Specificity...36 2.8 Detection of heteroresistant sample...37 2.9 Detection of 1753 samples...37 2.10 Sequencing...37 Section Ⅲ Results...37 3.1 Principle of Detection of fluoroquinolones-resistant Mycobaterium tuberculosis with Probe Melting Analysis...37 3.2 Results of thermal denaturation analysis for probe...38 3.3 Results of sensitivity...39 3.4 Results of specificity...40 3.5 Results of heteroresistant sample...41 3.5 Results of 1753 samples...42 Section Ⅳ Discussion...47 References...48 Acknowledgment...53 2
摘 要 摘 要 本 论 文 建 立 了 一 种 利 用 实 时 PCR 结 合 探 针 熔 解 分 析 技 术 对 结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 突 变 进 行 快 速 检 测 的 方 法 由 于 结 核 分 杆 菌 生 长 速 度 的 限 制, 目 前 临 床 上 用 于 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 对 药 物 敏 感 性 的 方 法 一 般 需 要 数 周 的 时 间, 不 利 于 临 床 的 诊 断 和 治 疗 因 此, 临 床 上 迫 切 需 要 一 种 能 够 快 速 准 确 地 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 性 的 方 法 研 究 工 作 包 括 两 个 部 分 : 双 管 双 色 实 时 荧 光 PCR 探 针 熔 解 分 析 法 快 速 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变, 实 时 荧 光 PCR 探 针 熔 解 分 析 法 快 速 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 突 变 第 一 部 分 : 在 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 分 离 株 中,95% 的 突 变 发 生 在 利 福 平 耐 药 相 关 基 因 rpob 上 的 507-533 密 码 子 ( 共 81bp) 的 耐 药 决 定 区, 因 此 我 们 选 择 根 据 该 区 域 序 列 设 计 实 验 通 过 筛 选 特 异 性 好, 扩 增 效 率 高 的 引 物 同 时 结 合 不 对 称 PCR 技 术 达 到 扩 增 大 量 单 链 的 目 的 ; 同 时 筛 选 可 覆 盖 所 有 主 要 突 变 位 点, 且 分 型 效 果 好 的 探 针, 通 过 熔 解 曲 线 过 程 中 探 针 与 扩 增 产 物 杂 交 后 熔 点 的 不 同 以 区 别 野 生 型 与 突 变 型 首 先 通 过 人 工 合 成 靶 序 列 初 步 考 察 探 针 区 分 野 生 型 与 突 变 型 的 能 力, 后 经 实 际 样 本 检 测 考 察 体 系 的 分 型 能 力, 并 收 集 大 量 具 有 药 敏 结 果 的 临 床 分 离 株 以 验 证 体 系 的 灵 敏 度 特 异 性 阳 性 预 测 值 阴 性 预 测 值 总 准 确 度 等 指 标, 从 而 建 立 起 一 个 快 速 准 确 经 济 的 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 检 测 体 系 第 二 部 分 : 在 结 核 分 枝 杆 菌 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 分 离 株 中,42~85% 的 突 变 发 生 在 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 相 关 基 因 gyra 上 的 长 度 为 320bp 的 耐 药 决 定 区, 根 据 该 区 域 序 列 设 计 实 验 通 过 筛 选 引 物 以 达 到 较 高 的 扩 增 效 率, 提 高 检 测 的 灵 敏 度 ; 通 过 设 计 可 覆 盖 所 有 主 要 突 变 位 点 的 探 针, 通 过 熔 解 曲 线 过 程 中 探 针 与 扩 增 产 物 杂 交 后 熔 点 的 不 同 以 区 分 野 生 型 与 突 变 型 由 于 gyra 中 的 95 位 点 存 在 多 态 性, 人 工 合 成 靶 序 列 合 成 了 具 有 95 位 点 多 态 性 及 不 具 有 95 位 点 多 态 性 的 两 组, 通 过 靶 序 列 检 测 及 实 际 样 本 检 测, 筛 选 分 型 能 力 好 的 探 针, 并 检 测 大 量 标 本 以 验 证 体 系 的 灵 敏 度 特 异 性 阳 性 预 测 值 总 准 确 度 等 指 标, 从 而 建 立 起 一 个 快 速 1
摘 要 准 确 经 济 的 结 核 分 枝 杆 菌 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 检 测 体 系 本 论 文 的 方 法 可 缩 短 结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 检 测 所 需 的 时 间, 对 结 核 耐 药 的 早 期 诊 断 及 指 导 临 床 医 生 用 药 有 重 大 意 义 关 键 词 : 利 福 平 ; 氟 喹 诺 酮 类 ; 耐 药 ; 实 时 PCR 2
Abstract Abstract This paper developed a real-time PCR technology combined with probe melting curve analysis for rapid screening of rifampin and fluoroquinolone-resistant. Current clinical assays for determining antibiotic susceptibility in M.tuberculosis require several weeks to be completed due to the slow growth of the bacilli, so the clinical diagnosis was hampered by delayed laboratory diagnosis. The dissertation consist of two parts: Detection of rifampin resistance in dual tube with dual-color probe; Detection of fluoroquinolone resistance in in a single tube with modified molecular beacon. The first part reports a sensitive and specific assay that takes less than 3h and reliably identifies rifampin-resistant M.tuberculosis. 95 percent of mutations associated with rifampin resistance occur in an 81-bp core region of the bacterial RNA polymerase gene, rpob. All mutations that occur within this region result in rifampin resistance. Four different probes are used in dual reaction tubes, each perfectly complementary to a different target sequence within the 81-bp, and two of them were labeled with FAM, the other two were labeled with TET. Together, their target sequences encompass the region of interests. After the probe melting analysis, the melting temperature of the mismatch hybrid probe-target oligonucleotide is lower than the match one, and different mismatched bases have different melting temperature. So we can define wild type and distinguish different mutant type. Totally 1753 samples were tested, and the results were consistent with the DNA sequencing. The second part developed a probe melting analysis for rapid screening of fluoroquinolone drug resistance in M.tuberculosis. 42~85 percent of mutations associated with fluoroquinolone resistance occur in quinolone resistance-determining region in the gyra. Missense mutations in codon 88,90,91,94 of gyra are associated with resistance to FQs. A polymorphism at gyra codon 95 is not associated with FQ resistance. We design a probe to encompass the region of interests. Totally 1753 samples were tested, and the results were consistent with the DNA sequencing. Our method is low cost and more rapid than drug susceptibility testing, can be 3
Abstract used for early detection and treatment of drug-resistant tuberculosis. Keywords:Rifampin; Fluoroquinolones; Drug resistance;real-time PCR 4
第 一 章 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变 第 一 章 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变 第 一 节 引 言 1.1 结 核 分 枝 杆 菌 流 行 病 学 研 究 结 核 病 一 种 通 过 空 气 传 播 的 慢 性 传 染 病, 是 人 类 已 知 的 最 古 老 的 疾 病 之 一, 目 前 已 成 为 全 球 最 为 关 注 的 重 大 公 共 卫 生 问 题 之 一 20 世 纪 50 年 代 以 来, 由 于 科 学 技 术 的 进 步 与 发 展, 人 类 发 明 了 卡 介 苗 (BCG) 以 及 多 种 可 以 结 核 病 的 化 学 药 物, 使 得 结 核 病 的 流 行 在 一 定 程 度 上 得 到 了 控 制 然 而 由 于 艾 滋 病, 耐 药 菌 株 以 及 人 口 流 动 等 多 种 原 因, 该 病 的 发 病 率 又 逐 渐 上 升, 导 致 结 核 病 在 20 世 纪 90 年 代 后 在 世 界 范 围 内 死 灰 复 燃 根 据 世 界 卫 生 组 织 的 统 计, 目 前 世 界 上 总 共 有 三 分 之 一 的 人 口 已 感 染 结 核 杆 菌, 每 秒 钟 就 有 一 人 新 感 染 结 核 杆 菌 据 世 界 卫 生 组 织 2009 年 全 球 结 核 病 控 制 报 告 显 示, 全 球 现 有 1370 万 结 核 病 患 者, 每 年 发 病 人 数 为 927 万, 每 年 死 亡 人 数 177 万, 发 病 人 数 占 前 五 位 的 国 家 分 别 为 印 度 中 国 印 度 尼 西 亚 尼 日 利 亚 和 南 非 我 国 是 世 界 上 结 核 病 高 负 担 国 家 之 一, 居 全 球 第 二 位 根 据 2000 年 全 国 结 核 病 流 行 病 学 调 查 结 果, 中 国 现 有 活 动 性 肺 结 核 患 者 约 450 万 目 前, 每 年 新 发 活 动 性 肺 结 核 约 150 万 例, 每 年 约 有 13 万 人 死 于 结 核 病, 而 且 耐 药 情 况 严 重, 给 结 核 病 的 预 防 和 治 疗 构 成 严 峻 挑 战 世 卫 组 织 推 荐 用 于 治 疗 结 核 病 的 一 线 药 物 包 括 异 烟 肼 利 福 平 链 霉 素 乙 胺 丁 醇 和 吡 嗪 酰 胺 二 线 药 物 有 氟 喹 诺 酮 类 ( 氧 氟 沙 星 斯 帕 沙 星 和 加 替 沙 星 ) 氨 基 糖 苷 类 ( 卡 那 霉 素 阿 米 卡 星 ) 和 多 肽 类 抗 生 素 ( 卷 曲 霉 素 紫 霉 素 和 恩 维 霉 素 ) D- 环 丝 氨 酸 和 硫 脲 类 抗 生 素 ( 乙 硫 异 烟 胺 丙 硫 异 烟 胺 ) 其 中 二 线 药 物 相 比 一 线 药 物 疗 效 差 且 毒 性 大, 用 于 耐 药 结 核 的 治 疗 耐 药 性 产 生 的 起 因 是 在 对 药 物 敏 感 的 结 核 病 患 者 的 治 疗 过 程 中, 不 恰 当 的 使 用 了 抗 菌 素 结 核 分 枝 杆 菌 的 自 发 突 变 很 普 遍, 单 一 使 用 某 一 种 药 物 治 疗 容 易 出 现 耐 药 的 情 况 耐 多 药 结 核 (MDR-TB) 界 定 为 至 少 对 异 烟 肼 和 利 福 平 ( 两 种 最 有 效 的 抗 结 核 药 物 ) 具 有 耐 药 性 的 结 核 杆 菌 引 起 的 疾 病 广 泛 耐 药 结 核 5
第 一 章 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变 (XDR-TB) 是 指 在 耐 多 药 结 核 的 基 础 上 对 二 线 药 物 中 的 氟 喹 诺 酮 类 药 物 以 及 对 三 种 二 线 抗 结 核 注 射 剂 ( 卷 曲 霉 素 卡 那 霉 素 丁 胺 卡 那 霉 素 ) 中 的 至 少 一 种 耐 药 近 几 年 耐 多 药 / 广 泛 耐 药 结 核 病 的 出 现 和 蔓 延 严 重 阻 碍 了 我 国 结 核 病 防 治 工 作 的 进 程, 已 成 为 严 重 的 公 共 卫 生 和 社 会 问 题 [1] 2007-2008 年 全 国 结 核 病 耐 药 基 线 调 查 显 示 : 全 国 肺 结 核 病 患 者 的 单 耐 药 率 21%, 多 耐 药 为 8.32%, 广 泛 耐 药 率 为 0.68%, 总 耐 药 率 37.79% 据 此 估 计, 中 国 现 有 耐 药 结 核 病 患 者 56 万, 占 到 世 界 耐 药 结 核 病 患 者 的 1/4; 每 年 新 发 耐 多 药 肺 结 核 病 患 者 约 12 万, 其 中 广 泛 耐 药 肺 结 核 病 患 者 近 1 万 除 了 巨 大 的 基 数, 中 国 耐 药 结 核 病 的 分 布 亦 非 常 广 泛 耐 多 药 结 核 的 分 布 以 农 村 为 主 青 壮 年 占 的 比 例 较 高, 无 明 显 性 别 差 异, 且 东 中 西 部 不 同 地 区 耐 药 率 并 无 显 著 差 异 1.2 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 机 制 利 福 平 (rifampin, RFP) 为 利 福 霉 素 类 半 合 成 广 谱 抗 菌 药, 该 药 对 结 核 分 枝 杆 菌 和 部 分 非 结 核 分 枝 杆 菌 ( 包 括 麻 风 分 枝 杆 菌 等 ) 在 宿 主 细 胞 内 外 均 有 明 显 的 杀 菌 作 用 该 药 物 自 1971 年 发 明 以 来, 一 直 是 结 核 化 疗 方 案 中 的 关 键 药 物 利 福 平 的 作 用 机 制 是 通 过 与 依 赖 DNA 的 RNA 聚 合 酶 的 β 亚 单 位 牢 固 结 合, 抑 制 细 菌 RNA 的 合 成, 防 止 该 酶 与 DNA 连 接, 从 而 干 扰 转 录 的 开 始, 阻 断 RNA 延 伸 过 程, 使 DNA 和 蛋 白 的 合 成 停 止 编 码 β 亚 单 位 的 基 因 被 命 名 为 rpob 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 菌 株 中,95% 在 rpob 基 因 利 福 平 耐 药 决 定 区 (RRDR) 内 存 在 突 变, 突 变 一 般 发 生 在 507-533 共 27 个 氨 基 酸 密 码 子 (81bp) 区 域 内, 形 式 包 括 点 突 变, 插 入 及 缺 失, 其 中 以 点 突 变 最 为 常 见, 突 变 率 较 高 的 位 点 有 531,526, 516 等 [2-5] 其 中 常 见 突 变 位 点 的 频 率 及 类 型 见 图 1-1 [6,7] 及 1-2 6
第 一 章 探 针 熔 解 分 析 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 突 变 Figure 1-1: Frequencies of mutations on the strands of the 81-bp M. tuberculosis rpob core region. Figure 1-2: Mutation type on the strands of the 81-bp M. tuberculosis rpob core region. 1.3 结 核 分 枝 杆 菌 基 因 分 型 技 术 由 于 需 要 及 时 为 结 核 病 患 者 制 定 出 合 理 的 治 疗 方 案, 我 们 必 须 找 到 一 种 快 速 准 确 地 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 耐 药 情 况 的 方 法 [8] 现 有 的 检 测 方 法 可 分 为 表 型 检 测 和 基 因 检 测 两 大 类 [9,10] 表 型 检 测 中 的 药 物 敏 感 性 试 验 (Drug susceptibility testing, DST) 以 及 噬 菌 体 生 物 扩 增 法 已 应 用 于 临 床, 但 这 些 方 法 各 有 其 局 限 性 由 于 结 核 分 枝 杆 菌 生 长 缓 慢, 常 规 药 敏 检 测 方 法 至 少 需 要 6-8 周 才 能 得 到 结 果 BACTEC TB-460 液 体 培 养 基 药 敏 检 测 方 法 虽 然 速 度 较 快, 但 需 昂 贵 的 设 备 及 培 养 基, 且 易 受 杂 菌 污 染 噬 菌 体 生 物 扩 增 法 [11] 检 测 难 以 快 速 高 效 地 给 出 耐 药 结 果 操 作 复 杂, 受 干 扰 因 素 多, 因 此 目 前 的 表 型 由 于 结 核 分 枝 杆 菌 利 福 平 耐 药 主 要 与 rpob 基 因 突 变 有 关 [12], 因 此 基 因 检 测 法 更 为 直 接, 近 年 来 也 得 到 了 较 快 发 展 [13] 基 因 检 测 法 通 过 对 耐 药 相 关 基 因 的 扩 增 及 序 列 分 析, 可 以 较 快 的 给 出 耐 药 信 息, 甚 至 可 以 在 几 小 时 内 给 出 结 果 [14] 目 前 已 有 的 分 析 方 法 有 线 性 探 针 杂 交 法 [15-17], 单 链 多 态 性 分 析 法 (SSCP) [18], DNA 直 接 测 序 法 [19-22], 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 分 析, 高 分 辨 熔 解 曲 线 法 [23,24] 及 芯 片 检 测 [25,26] 等 [27,28] 上 述 方 法 在 检 出 率 以 及 通 量 上 各 有 不 同, 但 是 共 同 的 缺 点 是 有 PCR 后 处 理 过 程, 这 就 使 得 检 测 步 骤 繁 琐, 且 增 加 了 引 起 PCR 产 物 污 染 的 几 率 目 前 较 有 应 用 前 景 的 试 剂 盒 有 比 利 时 Innogenetics 公 司 的 INNO-LiPA [29] Rif.TB 试 剂 盒 以 及 德 国 Hain 公 司 的 GenoType MTBDRplus assay 试 剂 盒 [30], 其 中 后 者 覆 盖 位 点 较 多, 在 利 福 平 耐 药 突 变 检 测 上 性 价 比 很 高 以 7
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