86 南方医科大学学报 J South ed Univ ;() 基础研究 肠道病毒 7 型 VP~VP 基因克隆及其表达产物的免疫原性 宋远斌 余 楠 何思杰 陈欣欣 王 斌 车小燕 曾其毅 南方医科大学 珠江医院儿科中心 医学检验中心 广东 广州 58 摘要 目的 克隆并表达肠道病毒 7 型 VP~VP 蛋白基因 初步鉴定其免疫原性 方法 抽提病毒 RNA 经 RT-PCR 方法 分别扩增出 VP~VP 蛋白基因片段 经克隆后 在 QIA 表达系统中表达 表达产物用 8 mol/l 尿素洗涤及 Ni 柱亲和层析 纯化后 用肠道病毒 7 型免疫兔血清和柯萨奇病毒 A6 型免疫兔血清对重组蛋白进行 Western blotting 及 ELISA 鉴定 结果 构建的重组质粒 pqea/ VP~VP 经 IPTG 诱导 重组蛋白 VP~VP 高效表达并纯化成功 经 Western blotting 及 ELISA 证实重组蛋白 VP~VP 可以被免疫兔血清特异识别 结论 肠道病毒 7 型 VP~VP 蛋白表达载体在大肠杆菌 5中高效表达 纯化产物具有较强的免疫原性 为今后EV7亚单位疫苗的研究和检测试剂盒提供了参考 关键词 肠道病毒7型 基因克隆 原核表达 免疫原性 中图分类号 R7. 文献标志码 A 文章编号 67-5 -86-5 Gene cloning and immunogenicity analysis of the structural proteins VP-VP of enterovirus 7 SONG Yuan-bin, YU Nan, HE Si-jie, CHEN Xin-xin, WANG Bin, CHE Xiao-yan, ZENG Qi-yi Pediatric Center, Laboratory Testing Center, Zhujiang Hospital, Southern edical University, Guangzhou 58, China Abstract: Objective To clone the genes encoding the structural proteins VP-VP of enterovirus 7 and investigate the immunogenicity of the expressed recombinant proteins. ethods The VP-VP cdnas were amplified by RT-PCR from the extracted viral RNA and cloned into pd9-t vector. The cloned VP-VP genes were then inserted into the multi-cloning sites of plasmid pqea and expressed in E. coli 5 with IPTG induction. After washing with 8 mol/l urea and purification with Ni-affinity chromatography, the recombinant proteins obtained were tested for immunogenicity by Western blotting and ELISA using rabbit antisera against enterovirus 7 and Coxsackie Virus A6. Results The recombinant VP-VP proteins were highly expressed in E. coli 5 and the purified proteins could be specifically recognized by the rabbit sera against enterovirus 7. Conclusion The expressed enterovirus 7 structural proteins show good immunogenicity and can be used for developing enterovirus 7 vaccine and detection kits. Key words: enterovirus 7; gene clone; prokaryotic expression; immunogenicity 肠 道 病 毒 7 型 Enterovirus 7 EV7 属 于 小 RNA病毒科肠道病毒属 病毒颗粒大致呈球形 直径约 7 nm 其蛋白外壳由结构蛋白 VP~ 组成 其中 VP~ 形成病毒的外表面 VP 埋在内部 EV7 感 染是儿童常见疾病 主要引起手足口病 Hand foot and mouth disease HFD 以及心肌炎 肺水肿 无菌性脑 膜炎 脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种并发症 重 收稿日期 -8-7 基金项目 国家重大科技专项课题 (9ZX-6 ) 广州市医药 症病例较多 预后差 病死率高 尚无特异性治疗方 法 近年来 EV7流行日益严重 有多次的爆发流行 5-6 严重危害儿童生命健康 并造成社会恐慌 基于上述情 况 研制简便可靠 能满足基层医疗卫生机构的特异性 诊断试剂及EV7特异性疫苗对疫情的防控 疾病的治 疗显得尤为重要 本实验利用大肠杆菌表达系统对 EV7 VP~VP蛋白进行表达纯化 并对其抗原性及其 免疫原性进行研究 为今后研制EV7特异性检诊断剂 盒和疫苗提供参考 卫生科技重大项目 A7 作者简介 宋远斌 博士 E-mail: Jimmy85@6.com 通讯作者 曾其毅 博士 主任医师 博士生导师 E-mail: zqy_88@6. com DOI: CNKI:-67/R.7.97.7 网络出版时间 --7 9:7:5 http://www.cnki.net/kcms/detail/.67.r.7.97.7.html 材料和方法. 病毒株和细胞 EV7病毒株为年我院临床病毒分离株 经前 期分析为 EV7 北京株 FJ6959. 基因亚型为 Ca 型 E.coli 5为我实验室保存
第 期 宋 远 斌, 等. 肠 道 病 毒 7 型 VP~VP 基 因 克 隆 及 其 表 达 产 物 的 免 疫 原 性 87. 质 粒 试 剂 质 粒 pqea 表 达 载 体 Ni 亲 和 层 析 树 脂 病 毒 RNA 提 取 试 剂 盒 PCR 产 物 回 收 试 剂 盒 购 自 QIAGEN 公 司, 质 粒 pd9-t 克 隆 载 体 购 自 TaKaRa 公 司, 一 步 法 RT-PCR 试 剂 盒 鼠 抗 his 单 克 隆 抗 体 兔 血 清 多 克 隆 抗 体 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 标 记 的 羊 抗 兔 IgG 购 自 Invitrogen 公 司, 限 制 性 内 切 酶 T DNA 连 接 酶 购 自 美 国 BI 公 司 EV7 感 染 兔 血 清 CVA6 感 染 兔 血 清 正 常 兔 血 清 为 我 实 验 室 制 备 并 保 存 其 他 试 剂 均 为 进 口 分 装 或 国 产 分 析 纯. 引 物 设 计 利 用 primer5 软 件 设 计 EV7 VP~VP 基 因 引 物, 引 物 序 列 见 表 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合 成 表 EV7 VP~VP 引 物 核 苷 酸 序 列 表 Tab. Primers used for expanding Enterovirus 7 VP-VP 引 物 核 苷 酸 序 列 (5'-') 长 度 () 目 的 片 段 长 度 () VP-F aaggatccggagatagggtggcagatgt 8 89 VP-R gggaagcttaagagtagtgatcgctgt 7 VP-F aaggatcctccccatctgctgaggcatgt 9 76 VP-R gggaagcttttgcgtaactgcctgcct 7 VP-F aaggatccgggtttcccaccgagct 5 76 VP-R ggaagcttctggatggtacccgtct 5 VP-F gcggtaccatgacctttcttgtgtctacaca 7 VP-R agaagcttcttcagtggcgctgcca 5 引 物 下 划 线 为 酶 切 位 点. EV7 VP~VP 目 的 基 因 扩 增 取 μl 病 毒 培 养 上 清, 按 试 剂 盒 说 明 提 取 病 毒 RNA, 最 终 洗 脱 于 μl DEPC 水 取 上 述 RNA 溶 液 μl 加 入 6 μl RT-PCR 反 应 混 合 液 ( 含 Reaction ix 5 μl,sense primer(vp~) μl,anti-sense primer (VP~) μl,superscript R III RT/ Platinum R Taq ix μl,autoclaved distilled water 5 μl), 反 应 条 件 如 下 :5 逆 转 录 min,9 预 变 性 min 后, 个 循 环 (9 5 s,5 s,68 6 s),68 延 伸 min % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析.5 表 达 载 体 构 建 上 述 扩 增 产 物 即 特 异 VP~VP 基 因 片 段 经 PCR 产 物 回 收 试 剂 盒 纯 化, 与 pd9-t 载 体 连 接, 经 克 隆 筛 选 PCR 扩 增 及 基 因 测 序 鉴 定 ( 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 ) 挑 选 阳 性 克 隆,pD9-T/VP~VP 以 BamHⅠ 和 Hind Ⅲ 双 酶 切,pD9-T/VP 以 KpnⅠ 和 Hind Ⅲ 双 酶 切, 切 胶 纯 化 回 收 后, 与 同 样 处 理 的 pqea 表 达 载 体 经 T DNA 连 接 酶 作 用 h, 转 化 宿 主 菌 5,PCR 及 酶 切 鉴 定 筛 选 pqea/vp~vp [7] 阳 性 克 隆 实 验 操 作 详 见 分 子 克 隆 手 册.6 VP~VP 蛋 白 表 达 及 纯 化 挑 取 pqea/vp~vp 阳 性 5 克 隆,IPTG 诱 导 表 达 目 的 蛋 白,VP~VP 用 不 同 浓 度 尿 素 洗 涤 纯 化, VP 用 Ni-NTA 树 脂 纯 化 纯 化 方 法 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 SDS-PAGE 电 泳 鉴 定 表 达 产 物 的 纯 度.7 免 疫 印 迹 分 析 取 纯 化 后 EV7 VP~VP 蛋 白 经 % SDS-PAGE 电 泳 分 离 后 转 移 至 PVDF 膜 上, 用 含 % 脱 脂 奶 粉 PBS 室 温 封 闭 h, 分 别 加 入 按 稀 释 的 病 毒 免 疫 后 的 兔 血 清 和 稀 释 的 小 鼠 抗 his 单 抗, 结 合 过 夜, 洗 膜 后 加 入 相 应 的 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 / 鼠 IgG, 室 温 作 用 h, 洗 膜 后 ECL 显 色.8 ELISA 验 证 重 组 蛋 白 免 疫 原 性 及 其 与 柯 萨 奇 病 毒 A6 型 (CVA6) 交 叉 反 应 性 将 5 μg/ml 纯 化 EV7 VP~VP 蛋 白 包 被 于 PVC 板, 结 合 过 夜, 封 闭 液 7 封 闭 h, 分 别 加 入 倍 比 稀 释 的 EV7 感 染 兔 血 清 CVA6 感 染 兔 血 清 和 正 常 兔 血 清,7 结 合 h, 再 加 入 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 标 记 羊 抗 兔 IgG 二 抗,7 反 应 min, 加 入 TB 室 温 避 光 显 色 min, mol/l H SO 5 µl 终 止 反 应, 测 定 A 5 值 结 果. RT-PCR 扩 增 EV7 VP~VP 基 因 提 取 EV7 病 毒 总 RNA, 扩 增 EV7 VP~VP 基 因, 电 泳 分 析 显 示 EV7 VP~VP 在 约 处 有 一 特 异 亮 带,VP 在 约 处 有 一 特 异 亮 带, 大 小 与 预 计 相 符 ( 图 ). 重 组 质 粒 的 构 建 及 鉴 定 PCR 回 收 产 物 直 接 克 隆 到 pd9-t 载 体 中, 转 化 后 挑 选 阳 性 菌 落, 经 PCR 及 基 因 测 序 鉴 定, 均 可 获 得 VP 89,VP 76,VP 76,VP 7 左 右 条 带, 证 实 T-A 克 隆 正 确 后, 用 对 应 酶 切 位 点 酶 切 获 得 EV7 VP~VP 基 因 片 段 后 定 向 插 入 pqea 载 体 中,
88 南方医科大学学报 J South ed Univ 获得重组质粒 pqea/ev7 VP~VP 重组质粒经 PCR 及酶切鉴定 均与预期结果吻合 图. 重组质粒在大肠杆菌中表达与纯化 pqea/ev7 VP~VP 重组质粒转化的阳性克 隆菌 通过表达条件的比较 确立了于 LB 培养体系 VP VP VP在 mmol/l IPTG 诱导条件下 表 达于 h达高峰 VP在.5 mmol/l IPTG 诱导条 件下 表达于 h 达高峰 表达蛋白经 SDS-PAGE 电 泳示相对分子质量约为 VP 7 VP VP VP 与推测蛋白相对分子质量大小相符 所表达的蛋白约占总菌体蛋白的%~5% 经分离证 实 VP~VP 表达产物以包涵体形式存在 经不同浓度 尿素洗涤后 获得较高纯度的重组蛋白 VP用Ni亲和 层析树脂进行纯化后获得较高纯度的重组蛋白 图 5 图 肠道病毒7型VP~VP目的基因的扩增 : kb 标准 DNA 梯状分子标记; ~: EV7 VP~VP 扩增片段 5: 阴性对照 Fig. Amplification products of EV7 VP-VP gene with RT-PCR. 第 卷 B A 89 76 C D 76 7 图 重组质粒pQEa/VP~ 的PCR和酶切鉴定 A: pqea/vp; B: pqea/vp; C: pqea/vp; D: pqea/vp, : kb标准dna梯状分子标记; : 原始pQEa质 粒(. kb); : Hind Ⅲ单酶切 pqea/vp~; : BamH Ⅰ Hind Ⅲ双酶切 pqea/vp~, Kpn Ⅰ Hind Ⅲ 双酶切 pqea/vp; : pqea/vp~ PCR产物 Fig. Identif ication of the recombinant plasmids pqe/ VP- by PCR and restriction enzyme analysis.. 免疫印迹鉴定 用病毒免疫兔血清与转至膜上的 EV7 VP~VP 蛋白反应 Western blotting结果显示免疫兔血清在相对 分子质量约VP 7 VP VP VP 处有一明显阳性特异反应条带 图 与 his 单 抗结合作用后 在相应位置呈一致的特异显色带 结果 表明 重组蛋白与免疫血清有良好的免疫反应性 图5.5 ELISA验证重组蛋白免疫原性及其与CVA6交叉 反应性 用 不 同 滴 度 EV7 免 疫 兔 血 清 检 测 EV7 VP~VP 重组蛋白免疫原性 表明 EV7 VP~ 均具 有较高滴度的免疫原性 其中以 VP 滴度最高 达 同时检测 CVA6 免疫兔血清对重组蛋白的交 叉反应性 结果表明 CVA6 免疫兔血清能识别 EV7
89 宋远斌,等.肠道病毒 7 型 VP~VP 基因克隆及其表达产物的免疫原性 第 期 5 5 6 7 8 r VP 重组蛋白 存在一定的交叉反应性 但其滴度低于 EV7 免疫兔血清 CVA6 免疫兔血清不能与 EV7 VP~重组蛋白反应 表 6 表 EV7 VP~VP重组蛋白检测EV7免疫兔血清及CVA6 免疫兔血清抗体滴度 7 Tab. EV7 VP-VP recombinant protein detected antibody titers in EV7 and CA6 rabbit antisera 图 重组pQEa/EV7 VP~VP蛋白的SDS-PAGE分析 : 低相对分子质量蛋白标记; 5: IPTG 诱导 h 所得 E. coli 5; : IPTG 诱导 h 所得 pqea/ev7 VP 重组蛋白; : 纯化后 VP 重 组蛋白; : IPTG 诱导 h 所得 pqea/ev7 VP 重组蛋白; : 纯化后 VP 重组蛋白; 5: IPTG 诱导 h 所得 pqea/ev7 VP 重组蛋白; 6: 纯化后 VP 重组蛋白; 7: IPTG 诱导 h 所得 pqea/ev7 VP 重 组蛋白; 8: 纯化后 VP 重组蛋白 Fig. SDS-PAGE analysis of expressed and purified pqe/ev7 VP-VP proteins. r 6 7 图 Western blotting 检 测 兔 免 疫 血 清 与 EV7 VP~VP 重组蛋白的结合反应 : EV7 VP 重组蛋白; : EV7 VP 重组蛋白; : EV7 VP 重组蛋白; : EV7 VP 重组蛋白 Fig. Western blot analysis of rabbit sera responses to EV7 VP-VP proteins. r 6 7 图 5 Western blotting 检 测 his 单 抗 与 EV7 VP~VP 蛋白的结合反应 : EV7 VP 重 组 蛋 白; : EV7 VP 重 组 蛋 白; : EV7 VP 重组蛋白; : EV7 VP 重组蛋白 Fig.5 Western blot analysis of anti-his monoclonal antibody responses to EV7 VP-VP proteins. VP VP VP VP EV7 免疫兔血清 : :8 : : CVA6 免疫兔血清 :8 讨论 近年来 我国 HFD 疫情呈明显上升趋势 据中 国疾病预防控制中心数据显示 8 9 年共报告病例 5.6 万 重症病例.8 万 死亡 5 人 年报告病 例 77.5 万 较 9 年升高 5.8% 重症病例. 万 较 9 年同期升高 66.% 死亡 95 例 较 9 年升高 5.9% 仅 年 ~ 月 我国共报告 HFD 病例 7797例 死亡7例 我国HFD发病率不断上升 死 亡病例不断增加 预防及诊治形势严峻 EV7 为导致 HFD 的主要病原体之一 是引发神经系统 呼吸系统 严重并发症并导致死亡的主要病原体 其神经毒性仅 次于脊髓灰质炎病毒 是继脊髓灰质炎病毒消灭后对公 共卫生危害最大的肠道病毒 9 由于临床上尚无特异 性治疗方法 控制 EV7 感染以预防为主 针对 EV7 的灭活全病毒疫苗和亚单位疫苗是目前研究的重点 EV7 基因组为单股正链 RNA 长度约为 7 个 核苷酸 仅含有一个开放读码框 编码的多聚蛋白约含 9个氨基酸 该多聚蛋白可进一步水解成P P和P 前体蛋白 P前体蛋白编码VP VP VP和VP结构 蛋白 P 和 P 编码 7 个非结构蛋白 A~C 和 A~D EV7的种结构蛋白中除VP包埋在病毒衣壳的内侧 与核心紧密连接外 其他种结构蛋白均暴露在病毒颗 粒的表面 是抗原决定簇的存在部位 带有中和抗原 活性和特异性抗原位点 其中 又以VP蛋白为最重要 的抗原表位研究对象 这是由于VP是主要的病毒抗原 决定簇 VP基因的遗传多样性与病毒血清型也完全对 应 常被作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据 - 虽然VP蛋白有很多相对独立的抗原表位 但其作为亚 单位疫苗能否对机体产生很好的保护效应 目前仍存在 质疑 虽然VP结构蛋白的氨基酸序列非常保守 但按 照 VP 基因序列对 EV7 分离株进行分型 其结果与 VP高度一致 - 同时 有研究也显示通过扩增VP片 段进行肠道病毒的分型检测 其分型结果与VP也有较 5-6 高的一致性 上述研究提示 由于肠道病毒易发生 7-8 重组和变异 对肠道病毒亚单位疫苗的研究不能局
85 南 方 医 科 大 学 学 报 (J South ed Univ) 第 卷 限 于 仅 对 VP 基 因 的 研 究, 可 以 拓 宽 致 VP~VP 的 研 究, 或 许 能 够 找 到 更 好 的 亚 单 位 疫 苗 研 制 途 径 [9] 结 合 我 国 广 东 地 区 EV7 的 流 行 多 为 C 亚 型 的 特 点, 我 们 选 取 我 院 监 测 并 成 功 分 离 的 9~ 年 流 行 于 广 东 地 区 的 EV7 临 床 分 离 株 (Ca 亚 型 ), 通 过 构 建 原 核 表 达 载 体, 成 功 表 达 了 EV7 VP~VP 重 组 蛋 白, 通 过 优 化 条 件, 获 得 了 较 纯 的 重 组 蛋 白, 并 对 其 免 疫 学 活 性 进 行 了 初 步 鉴 定 结 果 表 明 EV7 VP~VP 重 组 蛋 白 均 具 有 较 强 的 免 疫 原 性, 能 诱 导 机 体 产 生 免 疫 反 应, 因 此 可 作 为 疫 苗 研 究 的 候 选 分 子, 为 EV7 疫 苗 研 究 提 供 实 验 依 据 在 ELISA 实 验 中, 我 们 通 过 EV7 VP~ 重 组 蛋 白 做 抗 原 包 被, 与 不 同 滴 度 的 EV7 感 染 兔 血 清 CVA6 感 染 兔 血 清 正 常 兔 血 清 反 应, 目 的 是 :() 进 一 步 检 测 及 比 较 VP~ 重 组 蛋 白 的 抗 原 效 价 ;() 检 测 及 比 较 VP~ 重 组 蛋 白 是 否 与 CVA6 病 毒 存 在 交 叉 反 应 结 果 显 示,EV7 VP~ 重 组 蛋 白 均 具 有 较 高 滴 度 的 免 疫 原 性, 其 中 以 VP 滴 度 最 高, 达 :, 其 他 种 结 构 蛋 白 滴 度 相 继 降 低, 这 与 VP 是 肠 道 病 毒 抗 原 决 [] 定 簇 的 存 在 部 位 有 关, 证 实 以 VP 作 为 抗 原 进 行 疫 苗 研 制, 更 容 易 获 得 特 异 性 产 品 [] 在 交 叉 反 应 ELISA 实 验 中, 我 们 发 现 EV7 VP 与 CVA6 免 疫 兔 血 清 有 交 叉 反 应 的 现 象, 滴 度 为 :8, 这 可 能 与 EV7 与 CVA6 基 因 组 的 核 苷 酸 序 列 之 间 具 有 很 高 的 同 源 性 [] ( 两 者 VP 同 源 性 可 达 67%), 且 EV7 与 CVA6 存 在 交 叉 保 [] 护 性 有 关 实 验 中,EV7 VP~ 重 组 蛋 白 具 有 良 好 的 免 疫 原 性 且 与 CVA6 免 疫 兔 血 清 无 交 叉 反 应 现 象, 我 们 设 想 若 使 用 VP~ 作 为 联 合 免 疫 原, 所 得 的 抗 体 可 能 会 研 制 出 更 加 具 特 异 性 的 EV7 诊 断 试 剂 盒, 从 而 提 高 EV7 的 病 原 学 检 出 率, 但 试 剂 盒 的 开 发 仍 需 进 一 步 研 究 综 上 所 述, 本 实 验 成 功 获 得 了 重 组 的 EV7 型 VP~VP 蛋 白, 具 有 较 好 的 免 疫 原 性, 可 作 为 候 选 的 抗 原 用 于 诊 断 试 剂 的 研 究, 亦 为 下 一 步 EV7 的 生 物 学 性 质 免 疫 学 特 性 及 亚 单 位 疫 苗 的 研 制 奠 定 了 基 础 参 考 文 献 : [] Chung YC, Huang JH, Lai CW, et al. Expression, purification and characterization of enterovirus-7 virus-like particles[j]. World J Gastroenterol, 6, (6): 9-7. [] Tsu-An John Hsu, Jen-Huang H. Formation of enterovirus-like particle aggregates by recombinant baculoviruses co-expressing P and CD in insect cells[j]. Biotechnol Lett,, 5(): 99-5. [] Koroleva GA, Lukashev AN, Khudiakova LV, et al. Encephalomyelitis caused by enterovirus type 7 in children[j]. Vopr Virusol,, 55(6): -. [] Solomon T, Lewthwaite P, Perera D, et al. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 7[J]. Lancet Infect Dis,, (): 778-9. [5] Yang F, Ren L, Xiong Z, et al. Enterovirus 7 outbreak in the People's Republic of China in 8[J]. J Clin icrobiol, 9, 7 (7): 5-. [6] Chen SC, Chang HL, Yan TR, et al. An eight-year study of epidemiologic features of enterovirus 7 infection in Taiwan[J]. Am J Trop ed Hyg, 7, 77(): 88-9. [7] Sambrook J. 分 子 克 隆 实 验 指 南 []. 版. 北 京 : 科 学 出 版 社, : 68-98. [8] 中 国 卫 生 部 法 定 传 染 病 疫 情 报 告 [EB/OL]. http://www.moh.gov.cn/ publicfiles//business/htmlfiles/mohjbyfkzj/s97/index.htm [9] Huang CP, Chiung-Tzu Y. ultiplex reverse transcription-seminested PCR for differentiating enterovirus 7, coxsackievirus a6, and polioviruses from other enteroviruses[j]. J ed Sci,, (6): 77-8. []cinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 7 and its clinical and public health significance[j]. FES icrobiol Rev,, 6(): 9-7. []Brown BA, Oberste S, Alexander JP Jr, et al. olecular epidemiology and evolution of enterovirus 7 strains isolated from 97 to 998[J]. J Virol, 999, 7(): 9969-75. []Shih SR, Ho S, Lin KH, et al. Genetic analysis of enterovirus 7 isolated from fatal and non-fatal cases of hand, foot and mouth disease during an epidemic in Taiwan, 998[J]. Virus Res,, 68 (): 7-6. []Podin Y, Gias E, Ong F, et al. Sentinel surveillance for human enterovirus 7 in Sarawak, alaysia: lessons from the first 7 years [C]. 6: 8. []Shimizu H, Utama A, Onnimala N, et al. olecular epidemiology of enterovirus 7 infection in the Western Pacific Region[J]. Pediatr Int,, 6(): -5. [5]Nasri D, Bouslama L, Omar S, et al. Typing of human enterovirus by partial sequencing of VP[J]. J Clin icrobiol, 7, 5(8): 7-9. [6]Casas I, Palacios GF, Trallero G, et al. olecular characterization of human enteroviruses in clinical samples: comparison between VP, VP, and RNA polymerase regions using RT nested PCR assays and direct sequencing of products[j]. J ed Virol,, 65 (): 8-8. [8]Bible J, Pantelidis P, Chan PK, et al. Genetic evolution of enterovirus 7: epidemiological and pathological implications[j]. Rev ed Virol, 7, 7(6): 7-9. [8]Bible J, Pantelidis P, Chan PK, et al. Genetic evolution of enterovirus 7: epidemiological and pathological implications[j]. Rev ed Virol, 7, 7(6): 7-9. [9]Zheng HY, Zheng HZ. An enterovirus 7 epidemic in Guangdong Province of China. epidemiological, clinical, and virogenic manifestations[j]. Jpn J Infect Dis,, 6(): -8. []Foo DG, Alonso S, Chow VT, et al. Passive protection against lethal enterovirus 7 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide[j]. icrobes Infect, 7, 9(): 99-6. []Brown BA, Kilpatrick DR, Oberste S. Serotype-specific identification of enterovirus 7 by PCR[J]. J Clin Virol,, 6(): 7-. []Wu TC, Wang YF, Lee YP, et al. Immunity to avirulent enterovirus 7 and coxsackie A6 virus protects against enterovirus 7 infection in mice[j]. J Virol, 7, 8(9): -5. ( 编 辑 : 黄 开 颜 )